經(jīng)典名方當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

謝曉林 李 娟 張德柱 馬 釗 梁承遠(yuǎn) 凌 梅 喬乖萍 惠 楠

(1 陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,西安,710021; 2 陜西科技大學(xué),西安,710021)

經(jīng)典名方研究是國(guó)家推動(dòng)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要手段,2018年國(guó)家公布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》,掀起了經(jīng)典名方的研究熱潮[1-3]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是國(guó)家首批公布的經(jīng)典名方之一,源自金元時(shí)期李東垣的《內(nèi)外傷辯惑論》,是經(jīng)典的補(bǔ)益劑[4]。其方為“黃芪一兩,當(dāng)歸(酒洗)二錢。上件藥,口父咀,都作一服。水二盞,煎至一盞,去渣,溫服,空心食前?！狈街悬S芪大補(bǔ)肺脾之氣,以滋生化之源,當(dāng)歸養(yǎng)血合營(yíng),二者合用,共奏益氣補(bǔ)血之效[5]。主治血虛陽(yáng)浮發(fā)熱證,肌熱面紅,煩渴欲飲,脈洪大而虛,重按無(wú)力。亦治婦人經(jīng)期、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛,或瘡瘍潰后久不愈合者[6]?，F(xiàn)代研究還表明,當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有抗腫瘤、抗疲勞、抗炎、抗糖尿病、保肝、保護(hù)心腦血管等藥理作用[7-11]。此外,當(dāng)歸補(bǔ)血湯療效確切、配伍簡(jiǎn)單,是中藥復(fù)方制劑的研究熱點(diǎn)。

本研究參照《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》中的部分要求[12],研究了當(dāng)歸補(bǔ)血湯的基準(zhǔn)樣品,包括當(dāng)歸的炮制、藥材前處理、煎煮、濾過、干燥等工藝參數(shù),進(jìn)行了當(dāng)歸補(bǔ)血湯基準(zhǔn)樣品中阿魏酸以及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定以及基準(zhǔn)樣品的薄層鑒別,為當(dāng)歸補(bǔ)血湯基準(zhǔn)樣品質(zhì)量研究提供了科學(xué)依據(jù),也為該經(jīng)典名方研制成現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津公司,日本,型號(hào):LC-16);電子天平(0.1 mg)[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,瑞士,型號(hào):LE204E/02];電子天平(0.01 g)(凱豐集團(tuán)有限公司,型號(hào):JCS-600);語(yǔ)盟牌超聲波清洗機(jī)(深圳市方奧微電子有限公司,型號(hào):YM-100S);集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器設(shè)備有限公司,型號(hào):DF-101S);數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠,型號(hào):HH-8);三用紫外分析儀(南京大衛(wèi)儀器設(shè)備有限公司,型號(hào):ZF-1);3L底盤加熱式煎藥壺(潮州市潮安區(qū)龍光電器有限公司,型號(hào):30MF5)。

1.2 試劑與試藥 毛蕊異黃酮葡萄糖苷(南京春秋生物工程有限公司,批號(hào):MRYG20200813);黃芪甲苷(南京春秋生物工程有限公司,批號(hào):HQJG20190126);藁本內(nèi)酯(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,批號(hào):91980008);阿魏酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110773-201915);色譜醇乙腈(Fisher Scientific,美國(guó),批號(hào):P2478474);色譜醇磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號(hào):H2110260);色譜醇甲醇(Fisher Scientific,美國(guó),批號(hào):P2470293);色譜級(jí)甲酸(麥克林,批號(hào):G12966266);純凈水(陜西娃哈哈有限公司,貨號(hào):6222SS07116),色譜醇無(wú)水乙醇(麥克林,批號(hào):C14789359);其他試劑均為分析純,包括甲苯(西隴科學(xué),批號(hào):201029);乙酸乙酯(GENERAL-REAGENT,批號(hào):G23272I);冰乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號(hào):G2121128);正丁醇(麥克林,批號(hào):C14255485);三氯甲烷(浙化中星化工,批號(hào):20201009)。

1.3 分析樣品 當(dāng)歸補(bǔ)血湯處方藥材黃芪和當(dāng)歸收集不少于3個(gè)產(chǎn)地,采集批次不低于15批,經(jīng)檢驗(yàn),藥材質(zhì)量符合最新版《中華人民共和國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)[13]。將這15批黃芪和當(dāng)歸藥材飲片進(jìn)行分批組合,制備15批當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品。見表1。

表1 15批當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)制備用藥材產(chǎn)地及批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 物質(zhì)基準(zhǔn)制備方法 根據(jù)《內(nèi)外傷辨惑論》進(jìn)行處方考證[4],查閱文獻(xiàn)典籍考證歷代度量衡的演變[14]。最終確定本方中一兩折合現(xiàn)代劑量約為30 g,二錢約為6 g,一盞約為200 mL。同時(shí),通過對(duì)煎煮工藝的考察[15-17],最終確定物質(zhì)基準(zhǔn)制備方法為:稱取黃芪飲片30 g、酒洗當(dāng)歸飲片6 g,共36 g,置煎藥鍋中,加水400 mL浸泡30 min,武火煎煮30 min,放冷,濾過。另加水200 mL,文火煎煮30 min,放冷,濾過。將2次煎液合并,冷凍干燥36 h。即得15批當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品,編號(hào)為DGBXT01～DGBXT15。

2.2 薄層色譜法鑒別

2.2.1 當(dāng)歸 稱取當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品粉末0.2 g于250 mL具塞錐形瓶中,加入甲醇10 mL,密塞超聲提取1 h后取出,放冷、過濾,濾液水浴蒸干后加1 mL甲醇溶解,作為供試品溶液。另取炮制好的酒洗當(dāng)歸藥材、當(dāng)歸對(duì)照藥材以及阿魏酸和藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量,照2020版《中華人民共和國(guó)藥典(一部)》當(dāng)歸項(xiàng)下鑒別法制備對(duì)照藥材溶液以及對(duì)照品溶液[13]。

展開方法:按2020版《中華人民共和國(guó)藥典·通則0502》薄層色譜法試驗(yàn)[13],在同一硅膠G薄層板上,用毛細(xì)管取上述對(duì)照藥材及對(duì)照品溶液10 μL、供試品溶液15 μL依次點(diǎn)樣,將點(diǎn)好的薄層板放入裝有展開劑甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.2)的雙槽展開缸中,上行展開10 cm后取出薄層板,晾干,在365 nm紫外光燈下檢視。樣品與對(duì)照藥材以及對(duì)照品在相應(yīng)的位置上呈現(xiàn)相同的熒光斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 當(dāng)歸的薄層色譜法鑒別注:1.阿魏酸對(duì)照品;2.藁本內(nèi)酯對(duì)照品;3.當(dāng)歸(酒洗)藥材;4.當(dāng)歸對(duì)照藥材;5～9.樣品

2.2.2 黃芪 稱取當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品粉末0.5 g于250 mL具塞錐形瓶中,加入高純水20 mL后超聲20 min使溶解,用水飽和的正丁醇溶液30 mL萃取2次,15 mL/次,棄去水液,將合并的正丁醇液用5%碳酸鈉溶液提取2次,15 mL/次,棄去水液,蒸干正丁醇液,用1 mL甲醇將剩余物溶解,以此為樣品溶液。另取黃芪藥材2 g,加水20 mL,加熱回流30 min,濾過,濾液同法萃取制備對(duì)照藥材溶液。稱取適量黃芪甲苷對(duì)照品,按照2020版《中華人民共和國(guó)藥典(一部)》黃芪項(xiàng)下鑒別法制備對(duì)照品溶液[13]。

展開方法:按薄層色譜法2020版《中華人民共和國(guó)藥典·通則0502》試驗(yàn)[13],在同一硅膠G薄層板上,用毛細(xì)管吸取10 μL對(duì)照品溶液,20 μL對(duì)照藥材以及供試品溶液依次點(diǎn)樣,將點(diǎn)好的薄層板放入裝有展開劑三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的雙槽展開缸中,上行展開10 cm后取出薄層板,晾干后均勻噴上10%硫酸乙醇溶液,放入烘箱中,105 ℃加熱至有清晰的斑點(diǎn)顯現(xiàn)。樣品與對(duì)照藥材以及對(duì)照品在相應(yīng)的位置上,日光下顯相同顏色的斑點(diǎn);365 nm紫外光燈下顯相同的熒光斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 黃芪的薄層色譜法鑒別注:1.黃芪甲苷對(duì)照品;2.黃芪對(duì)照藥材;3～7.樣品

2.3 阿魏酸的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 使用Newmate TM C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈(A):0.2%甲酸(B)=20∶80為流動(dòng)相等度洗脫,流速為0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):316 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:35 ℃。理論塔板數(shù):按阿魏酸峰計(jì)算不得低于3 000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量于容量瓶中,加乙醇溶解并定容,即得。

2.3.3 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備 精密稱取當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品0.2 g于250 mL的具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇10 mL,密塞稱重,加熱回流提取1 h,放冷,用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量后濾過,取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾即得。精密稱取不含當(dāng)歸的陰性對(duì)照樣品0.2 g,同法配制陰性對(duì)照溶液。

2.3.4 專屬性試驗(yàn) 分別取上述3種溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。見圖3。供試品色譜中與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置處有阿魏酸色譜峰,陰性樣品不干擾測(cè)定,雜質(zhì)峰與阿魏酸峰分離度良好,該方法專屬性良好。

圖3 阿魏酸的專屬性試驗(yàn)色譜圖注:A.阿魏酸對(duì)照品;B.樣品;C.缺當(dāng)歸陰性樣品;峰1.阿魏酸

2.3.5 線性關(guān)系考察 取阿魏酸對(duì)照品10 mg,置50 mL容量瓶中,加乙醇制備200.00 μg/mL的母液。取一定量的母液于容量瓶中,分別加乙醇稀釋配制質(zhì)量濃度為10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL的溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄峰面積,進(jìn)行線性回歸。阿魏酸的線性方程為:Y=82 270.2X-379 574(r=0.999 5),表明阿魏酸在10～200 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3.6 中間精密度試驗(yàn) 取上述20 μg/mL的阿魏酸對(duì)照品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜方法重復(fù)進(jìn)樣6次,計(jì)算阿魏酸色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation,RSD)為1.71%,表明阿魏酸有良好的進(jìn)樣精密度。

2.3.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定,得阿魏酸色譜峰面積RSD為2.32%,表明樣品24 h穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品,按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液并按相應(yīng)色譜條件進(jìn)樣,記錄阿魏酸的色譜峰面積,計(jì)算含量以及RSD。結(jié)果測(cè)得阿魏酸的平均含量為0.418 1 mg/g,RSD為2.31%,表明有良好的重復(fù)性。

2.3.9 回收率試驗(yàn) 取“2.3.8”項(xiàng)下的當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品6份,0.2 g/份,精密稱定。分別加入100 μg的阿魏酸對(duì)照品,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按相應(yīng)色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算回收率。阿魏酸的平均回收率為100.64%,RSD為2.87%,表明該方法回收率合格。見表2。

表2 加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.3.10 樣品測(cè)定結(jié)果 取15批當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品配制供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算阿魏酸的含量。見表4。

2.4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 使用Newmate TM C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈為流動(dòng)相A,0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相B。梯度洗脫(0～20 min,80%A→60%A;20～35 min,60%A),流速0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm,進(jìn)樣量10 μL,柱溫30 ℃。理論塔板數(shù):按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)算不得低于3 000。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量于容量瓶中,加甲醇溶解并定容即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品0.2 g于250 mL具塞錐形瓶中,精密量取10 mL甲醇,密塞稱重,超聲提取1 h,放冷,用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量后濾過,取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾即得。精密稱取不含黃芪的陰性對(duì)照樣品0.2 g,同法制成陰性對(duì)照溶液。

2.4.4 專屬性試驗(yàn) 分別取上述3種溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。供試品色譜中與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置處有毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰,陰性樣品不干擾測(cè)定。毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰與雜質(zhì)峰分離度良好,表明方法有良好的專屬性。見圖4。

圖4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的專屬性試驗(yàn)色譜圖注:D.毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品;E.樣品;F.無(wú)黃芪陰性樣品;2.毛蕊異黃酮葡萄糖苷

2.4.5 線性關(guān)系考察 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品5 mg于100 mL容量瓶中,加甲醇溶解制得50.00 μg/mL的母液。量取一定量的母液于容量瓶中,加甲醇溶解稀釋制備質(zhì)量濃度分別為5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、40.00 μg/mL的溶液。按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定,記錄峰面積,進(jìn)行線性回歸。得毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性方程為:Y=82 179.6X-257 13.2(r=0.999 9),毛蕊異黃酮葡萄糖苷在5～50 μg范圍線性關(guān)系良好。

2.4.6 中間精密度試驗(yàn) 取濃度為50 μg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,按上述色譜方法進(jìn)行測(cè)定,RSD為0.46%,表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷的進(jìn)樣精密度良好。

2.4.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣分析測(cè)定,得毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰面積RSD為1.94%,表明樣品室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品,按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜峰面積,計(jì)算含量以及RSD。結(jié)果測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量為0.555 4 mg/g,RSD為2.60%,表明重復(fù)性良好。

2.4.9 回收率試驗(yàn) 取“2.4.8”項(xiàng)下6份當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品,每份約0.2 g,精密稱定。分別加入50 μg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液2.4 mL,按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液,按相應(yīng)色譜條件分析測(cè)定,計(jì)算回收率。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為92.62%,RSD為1.85%,表明該方法有良好的加樣回收率。見表3。

表3 加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.4.10 樣品測(cè)定結(jié)果 取15批當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品制備供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。15批樣品中2個(gè)待測(cè)成分阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量分別在0.068%～0.109%和0.057%～0.092%。見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(%)

3 討論

3.1 薄層色譜法鑒別 本研究擬建立當(dāng)歸補(bǔ)血湯中阿魏酸、藁本內(nèi)酯、毛蕊異黃酮葡萄糖苷以及黃芪甲苷的薄層色譜法鑒別項(xiàng),但毛蕊異黃酮葡萄糖苷斑點(diǎn)顯色不清晰,最終選擇阿魏酸和藁本內(nèi)酯作為當(dāng)歸的定性鑒別項(xiàng),選擇黃芪甲苷作為黃芪的定性鑒別指標(biāo),建立的薄層色譜法鑒別方法中供試品制備方法簡(jiǎn)單易操作,所選擇的展開劑對(duì)樣品的分離度良好,得到的斑點(diǎn)清晰,耐用性良好。

3.2 流動(dòng)相以及流速的選擇 為了得到峰形良好,分離度良好的色譜峰,實(shí)驗(yàn)中考察了不同的流動(dòng)相體系,包括乙腈和水的體系、甲醇和水的體系,也考察了不同的改性劑如磷酸、甲酸對(duì)峰形的影響。結(jié)果表明以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)得到的色譜峰峰形較佳,且各成分分離情況相對(duì)較好,故最終選定乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)中還考察了0.5 mL/min、0.8 mL/min和1.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫,結(jié)果以0.5 mL/min的流速得到的色譜峰峰面積最大。

3.3 樣品提取方法選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇以及水作為提取溶劑的提取效率。鑒于常用的提取方法為超聲提取和加熱回流提取,因此本實(shí)驗(yàn)還考察了這2種提取方式的提取效果。結(jié)果表明用50%的乙醇回流1 h提取阿魏酸的效果最好。用甲醇超聲1 h和回流1 h提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷的效果無(wú)明顯區(qū)別,為了操作簡(jiǎn)單,選擇用甲醇超聲1 h提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷。

3.4 小結(jié) 經(jīng)典名方應(yīng)用歷史久遠(yuǎn),各種共性、難點(diǎn)問題如處方考證、劑量換算、藥材炮制、湯劑煎煮方式以及時(shí)間等較為復(fù)雜,文獻(xiàn)考證并不能為所有問題提供確證性依據(jù)。因此,本實(shí)驗(yàn)在崇經(jīng)尚典的基本原則下,秉承“遵古不泥古”的理念,從發(fā)展的角度去認(rèn)識(shí)經(jīng)典名方復(fù)方制劑的研發(fā)。本實(shí)驗(yàn)以古籍中記載的當(dāng)歸補(bǔ)血湯制備方法為依據(jù),結(jié)合劑型、容器的度量衡及現(xiàn)代通用方法綜合考慮來(lái)優(yōu)化并確定最終的當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)的制備方案[18-22]。對(duì)不同批次的當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,采用薄層色譜法和高壓液相色譜法,建立了當(dāng)歸補(bǔ)血湯的定性鑒別和含量測(cè)定方法。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定,為后續(xù)當(dāng)歸補(bǔ)血相關(guān)制劑的研發(fā)以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突聲明:無(wú)。