反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合正交試驗優(yōu)化荷葉降脂方的提取工藝

王迪磊 宋乃琪 楊凱麗 楊麒琳 郭子碩 肖五慶 楊天姿 李鵬躍 杜守穎

(北京中醫(yī)藥大學,北京,102488)

高脂血癥是一種常見的慢性疾病,且隨著人們生活水平的提高,高脂血癥的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長的態(tài)勢。高脂血癥是指人體血液中的血脂含量超過正常的范圍,表現(xiàn)為血液中膽固醇、三酰甘油含量過高或者高密度脂蛋白的含量過低,現(xiàn)代醫(yī)學也稱為“血脂異?！盵1]。高脂血癥是心血管疾病的一個重要誘因,與高血壓、冠心病等多種疾病聯(lián)系緊密[2-3],是現(xiàn)代醫(yī)學研究中的疑難雜癥,因此高脂血癥對癥藥物的開發(fā)也成為醫(yī)藥工作者的研究熱點。

荷葉降脂方由荷葉、菊花、枸杞子3味藥組成,具有降低血脂、保護血管的功效,在臨床上常以代茶飲或湯劑的方式供患者服用,用于治療高脂血癥、血管動脈粥樣硬化等疾病,療效明顯。方中君藥荷葉的主要成分為生物堿及黃酮類,現(xiàn)代研究表明荷葉中的生物堿類是其發(fā)揮降脂作用的主要活性成分[4-5],因此本研究選取荷葉堿作為含量測定的指標性成分進行后續(xù)試驗。

當前,應(yīng)用于中藥最佳工藝或處方配比篩選的試驗設(shè)計方法較多,如正交設(shè)計、均勻設(shè)計、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化法、星點設(shè)計、Box-Behnken設(shè)計等[6-7],不同方法各有優(yōu)勢,但也存在相應(yīng)的局限性。如正交設(shè)計適宜于水平數(shù)<5的多因素多水平試驗,均勻設(shè)計適宜于水平數(shù)較多的試驗,星點設(shè)計、Box-Behnken設(shè)計適宜于變量為連續(xù)變量且試驗次數(shù)較多的試驗,而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化因其具有強大的非線性擬合能力尤其適宜于中藥復(fù)方的復(fù)雜體系研究[8-9]。因此,本研究以荷葉堿含量作為評價指標,采用正交試驗結(jié)合反向傳播(Back Propagation,BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化法優(yōu)選其最佳提取工藝參數(shù),為該方后續(xù)醫(yī)療機構(gòu)制劑的開發(fā)奠定研究基礎(chǔ),同時為正交設(shè)計-BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化設(shè)計在中藥制藥領(lǐng)域的聯(lián)合應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 賽多利斯電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,型號:BSA224S];電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司,型號:JM-B10002);Thermo高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號:Ultimate 3000]。

1.2 試劑 三乙胺(批號:212510)、乙腈(批號:205309)、甲醇(批號:213476),均為色譜純,購自美國Fisher公司;娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司,批號:20210319)。

1.3 分析樣品 荷葉堿對照品(99.8%,中國食品藥品檢定研究院,批號:111566-201907);荷葉(北京仟草中藥飲片有限公司,批號:201208002);菊花(北京鶴延嶺藥業(yè)發(fā)展有限公司,批號:200815);枸杞子(北京鶴延嶺藥業(yè)發(fā)展有限公司,批號:201005)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo Lot validation C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(A)-0.1%三乙胺溶液(B)梯度洗脫(0～40 min:A 20%～70%,B 80%～30%);檢測波長為270 nm;柱溫為30 ℃;進樣20 μL;流速1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取荷葉堿對照品適量,加甲醇溶解并混勻,制成荷葉堿質(zhì)量濃度為11.35 μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 干膏粉與提取溶劑比例考察 本研究擬不改變提取用溶劑,仍采用水作為溶劑進行提取,同時模擬工業(yè)生產(chǎn)多功能提取罐的提取過程,采用回流裝置進行提取。

稱取3倍量處方飲片,加水回流提取,水提液濃縮至稠膏狀態(tài),60 ℃減壓干燥,得干浸膏,碎成浸膏粉,過四號篩。分別稱取干膏粉0.3 g、0.5 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,超聲45 min,濾過,取續(xù)濾液進行測定。由SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析干膏粉與提取溶劑不同比例組的含測結(jié)果。統(tǒng)計結(jié)果顯示,2種比例所得的荷葉堿含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),選擇以25 mL甲醇提取0.3 g浸膏粉用于后續(xù)正交試驗中各組提取物的含量測定。

2.3.2 超聲提取時間的考察 稱取干膏粉0.3 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,分別超聲30 min、45 min,濾過,取續(xù)濾液進行測定。由SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析超聲時間對指標性成分含量的影響,統(tǒng)計結(jié)果顯示,2種方法所得的荷葉堿含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),因此選擇超聲時間為30 min。

供試品溶液的制備方法最終確定:稱取干膏粉0.3 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,超聲30 min,濾過,取續(xù)濾液即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 按照處方比例,制備不含荷葉的干膏粉,按照“2.3”項下供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.5 專屬性試驗 取“2.2”“2.3”“2.4”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各適量,按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果顯示,色譜峰分離良好,陰性樣品在荷葉堿對照品相應(yīng)色譜峰位置未檢出色譜峰。表明本方法系統(tǒng)適用性及專屬性均良好。見圖1。

圖1 荷葉堿高壓液相色譜法色譜圖(時間軸,單位min)注:A.對照品溶液;B.供試品溶液;C.陰性樣品溶液;峰1荷葉堿

2.6 線性關(guān)系考察 取對照品母液,加入甲醇依次稀釋為不同濃度,分別進樣測定峰面積。以峰面積(Y)對進樣濃度(X)進行線性回歸,得荷葉堿的回歸方程為Y=1.196 4X-0.052 1,r2=0.999 5。結(jié)果表明,荷葉堿在1.135～45.400 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。見圖2。

圖2 荷葉堿峰面積和進樣濃度線性關(guān)系

2.7 中間精密度試驗 取“2.2”項下對照溶液,按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,測定荷葉堿的峰面積,計算相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)值。結(jié)果荷葉堿的RSD值為0.55%,此條件下儀器精密度良好(RSD<3%)。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣,測定荷葉堿的峰面積,計算RSD值。結(jié)果測得荷葉堿峰面積的RSD=0.84%,供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD<3%)。

2.9 重復(fù)性試驗 取干膏粉6份,每份約0.3 g,精密稱定,按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備供試品,進樣體積為20 μL,測定荷葉堿的峰面積,計算RSD值。結(jié)果測得荷葉堿含量為0.828 3 mg/g,RSD為1.68%,重復(fù)性符合實驗要求(RSD<3%)。

2.10 回收率試驗 取含荷葉堿為0.828 3 mg/g的同一批樣品6份,約0.15 g/份,精密稱定,精密加入荷葉堿濃度為0.113 5 mg/mL的對照品溶液1 mL,按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備,進樣體積為20 μL,測定荷葉堿的峰面積,計算回收率,并計算RSD值。結(jié)果荷葉堿的加樣回收率為99.90%～103.96%,RSD值為1.48%,符合實驗要求(RSD<3%)。見表1。

表1 荷葉堿加樣回收率

2.11 樣品測定結(jié)果

2.11.1 吸水量考察 按照3倍處方量稱取飲片置圓底燒瓶中,加入12倍量水(按飲片重量計)每隔30 min用300目尼龍紗布濾過,測定濾液體積,至體積不再減少為止,計算飲片的吸水倍量,結(jié)果顯示飲片的平均吸水率為265%,約為飲片總重量的3倍。

2.11.2 正交提取工藝設(shè)計 參考臨床使用方法,飲片用水提取,以水提物中荷葉堿含量作為考察指標,加水倍量、提取時間、提取次數(shù)為因素,每個因素設(shè)計3個水平。見表2。

表2 水提正交試驗因素水平

2.11.3 含量測定 分別稱取3倍處方量的飲片,按照正交試驗因素水平表中各因素水平設(shè)計正交試驗,按照“2.3”項下方法制備供試品溶液,按照“2.1”項下色譜條件測定荷葉堿含量。見表3。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對正交結(jié)果進行方差分析。見表4。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 正交試驗方差分析

由方差分析表可知,A因素(加水倍量)、C因素(提取次數(shù))對荷葉堿轉(zhuǎn)移率有極顯著性影響,為主要因素;B因素(提取時間)沒有顯著性影響,各影響因素大小為C>A>B。由正交試驗結(jié)果表可知:A因素、C因素各水平間差異較大,選擇荷葉堿含量較高的A3、C3水平,B因素各水平間差異不大,結(jié)合實際考慮選擇提取時間較短的B1。綜上正交優(yōu)選最佳工藝確定為A3B1C3,即12倍量水,提取3次,每次0.5 h。

2.11.4 基于正交試驗的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化 以正交試驗中加水量、提取時間、提取次數(shù)3個因素數(shù)值作為輸入層,以荷葉堿含量作為輸出層,運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件編程建立BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置隱含層為1個,選擇雙曲正切傳遞函數(shù)(tansig)作為隱含層傳遞函數(shù),線性傳遞函數(shù)(purelin)作為輸出層傳遞函數(shù)對結(jié)果進行仿真輸出,對三因素各組合進行綜合評分。見表5,圖3～4。

表5 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)函數(shù)訓練結(jié)果

圖3 綜合評分結(jié)果預(yù)測

圖4 因素重要性結(jié)果預(yù)測

由綜合評分結(jié)果預(yù)測圖可知,訓練曲線相關(guān)性良好,表明訓練結(jié)果準確可信。而因素重要性結(jié)果預(yù)測圖表明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測各因素重要性為提取次數(shù)>加水倍量>提取時間,與正交方差分析結(jié)果一致。最終計算綜合評分得到BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型仿真優(yōu)化最佳提取工藝:12倍量水,提取3次,1 h/次(A3B2C3)。見表5。

2.11.5 驗證試驗 稱取3倍處方量飲片,按正交試驗與BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù),分別平行安排3組試驗,測定出膏率及荷葉堿的含量,確定最佳提取工藝。見表6。

表6 驗證試驗結(jié)果

由試驗結(jié)果可知2種工藝的荷葉堿含量大致相同,工藝A3B2C3(12倍量水,提取3次,1 h/次)與工藝A3B1C3(12倍量水,提取3次,30 min/次)比較出膏率增加約2%,結(jié)合生產(chǎn)實際,在2種工藝指標性成分含量及出膏率差別不大的基礎(chǔ)上,建議選擇時間短,耗能低的A3B1C3作為最終提取工藝。

3 討論

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是在對人腦組織結(jié)構(gòu)和運行機制的認識基礎(chǔ)上,模擬其結(jié)構(gòu)和智能行為的一種工程系統(tǒng),其適合研究非線性系統(tǒng)的特性為解決復(fù)雜問題提供了一種相對有效且簡單的方法[10-11]。

荷葉、菊花、枸杞子作為常見的藥食兩用中藥[12],在醫(yī)療與食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。而高脂血癥作為一種常見的慢性疾病,因此在治療上藥食同源類藥物就具有其獨特的優(yōu)勢?，F(xiàn)代研究表明,荷葉、菊花、枸杞子均具有良好的降脂作用,荷葉總生物堿可顯著降低血清中總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇含量,升高高密度脂蛋白膽固醇含量,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂;菊花總黃酮能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,增加細胞的抗氧化能力;而枸杞多糖在降脂的基礎(chǔ)上還具有防止動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的作用[13],因此也越來越多地被應(yīng)用于高脂血癥的臨床治療及食療領(lǐng)域。

本研究以荷葉的主要降脂活性成分荷葉堿作為指標性成分[14],依據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》選取甲醇作為溶劑對其進行溶解[15],并對溶劑體積比和超聲時間進行了考察,選取了最優(yōu)的研究方法,重復(fù)性結(jié)果良好,表明方法穩(wěn)定可行。

提取工藝的優(yōu)化歷來都對制藥生產(chǎn)起著舉足輕重的作用,是新藥研發(fā)過程中的關(guān)鍵一步。而中藥復(fù)方由于其成分眾多,提取過程往往又會使多組分之間發(fā)生交叉化學反應(yīng),這也造成了中藥復(fù)方提取過程的模型多是非線性的且機制較為復(fù)雜,因此會對很多分析方法的結(jié)果造成影響。而BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的一個顯著特性是通用近似性,又稱為萬能表達定理,即有1個隱藏層的多層感知機可以精確表示任意連續(xù)有界函數(shù)或布爾函數(shù),有2個隱藏層的多層感知機可以精確表示任意函數(shù)。因此,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的非線性表達能力非常強,可以很好的近似數(shù)據(jù)中蘊含的非線性特征。另外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有互連性和結(jié)構(gòu)可塑性的信息處理單元,因此不要求分析變量滿足正態(tài)性及獨立性等條件,且具有自組織、自學習、聯(lián)想記憶等優(yōu)良特性,對復(fù)雜體系的數(shù)據(jù)具有良好的適應(yīng)能力,因此非常符合中藥復(fù)方作用體系的規(guī)律性探究[16-17]。

正交試驗雖然在優(yōu)化工藝方面應(yīng)用廣泛,但受限于因素水平的設(shè)定,正交試驗篩選出的最佳參數(shù)只能是已設(shè)水平的組合,因此可能只是較優(yōu)組合而非最佳組合。本研究在各因素下分別設(shè)置了3個水平,適合于用正交試驗對其進行分析概括,因其是復(fù)方同時又選取了BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的方式與正交試驗進行互補,共同參考2種分析方法的結(jié)果,如此不需要在正交的基礎(chǔ)上增加試驗次數(shù)即可獲得理想的試驗參數(shù)組合,結(jié)果更加準確可靠,可操作性較強[18-19]。最終本研究的正交試驗與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在加水量及提取次數(shù)方面得出的結(jié)論一致,后續(xù)試驗又對提取時間進行了考察驗證,篩選出了最佳的提取工藝參數(shù),可為后續(xù)的制劑開發(fā)奠定一定的研究基礎(chǔ)[20]。

在中藥新藥或醫(yī)療機構(gòu)制劑的研發(fā)過程中,長期以來在“唯成分論”的影響下,常采用有機溶劑替代水對有效成分進行提取、富集。這種提取溶劑的改變雖然能夠富集有效成分,但由于中藥成分的多樣性、復(fù)雜性,這種改變也可能引起毒性成分的富集,從而帶來安全性的風險,對痔血膠囊、仙牛健骨顆粒的研究均反映了這種風險[20-21]。因此,在對于來源于臨床經(jīng)驗方的中藥復(fù)方制劑的開發(fā)時要充分考慮人用經(jīng)驗,參照臨床用藥的工藝來進行制劑工藝研究具有更好的保障。荷葉降脂方來源于臨床經(jīng)驗方,在臨床上多以代茶飲或湯劑的方式應(yīng)用,為了尊重臨床用藥經(jīng)驗,保障臨床療效,故在研究中提取溶劑仍以水為溶劑。

利益沖突聲明:無。