生物標志物在肝細胞癌診斷與治療中的研究進展

徐飛麒,張 哲,胡 昂,黃東勝

徐飛麒,張哲,浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 浙江省杭州市 310053

徐飛麒,張哲,黃東勝,浙江省人民醫(yī)院,杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院肝膽胰微創(chuàng)外科 浙江省杭州市 310014

胡昂,杭州醫(yī)學院 浙江省杭州市 310059

0 引言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝惡性腫瘤,其嚴重威脅人類的生命和健康,有文獻報道[1-3],預計到2030年將會有超過100萬人死于HCC.HCC的發(fā)病非常隱匿,早期診斷困難,超過80%的HCC患者在確診時就已經(jīng)處于進展期,甚至失去手術根治的機會.早期診斷困難導致患者不能及時得到有效的治療,是HCC患者預后較差的主要原因之一[4,5].另外,HCC患者術后5年內(nèi)的復發(fā)率高達70%,患者在接受根治性治療后未能對腫瘤進展進行準確監(jiān)測,而錯過最佳治療時機,也是導致HCC患者不良預后的重要原因[6].

目前多個指南建議對于乙型肝炎病毒感染、肝硬化等HCC發(fā)病的高?；颊?采取超聲聯(lián)合甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的檢測進行HCC的早期篩查與診斷,但其敏感性和特異性并不理想,且有超過1/3的小肝癌患者存在AFP陰性的情況[7].另外,近年來非酒精性脂肪性肝硬化相關的HCC患者數(shù)量逐年增加,這一類患者的肝臟脂肪性病變嚴重,嚴重的脂肪性病變大大降低了超聲檢查對小肝癌診斷的敏感性[8,9].而在HCC患者的治療后隨訪過程中,我們主要采用影像學檢查包括超聲、增強CT、磁共振等方法聯(lián)合血清標志物的檢測來進行腫瘤治療后的療效評價及復發(fā)監(jiān)測,而這一方法對早期腫瘤復發(fā)的監(jiān)測敏感性和特異性仍不能令人滿意,且檢查繁瑣、花費巨大.因此,我們亟需找到能提高HCC早期診斷的敏感性及特異性,以及能在HCC的治療后隨訪過程中及時準確地對腫瘤進展進行監(jiān)測的有效方法,以便對存在早期復發(fā)跡象的患者采取及時有效的治療干預措施,從而改善HCC患者的預后.

生物標志物在HCC的診斷、進展監(jiān)測以及預后評估方面都有非常重要的作用.近年來,越來越多的新型生物標志物的出現(xiàn),以及一些基于AFP等多個HCC預后相關變量的統(tǒng)計模型的出現(xiàn),都極大地改善了HCC的診療現(xiàn)狀[10].另外,隨著對肝癌細胞研究的深入以及生物學技術的提高,液體活檢技術成為HCC診斷與治療相關領域的另一個熱點.在此,本文就近年來生物標志物在HCC的診斷與治療中的最新研究進展進行綜述,旨在為HCC的早期診斷、治療后療效評價、復發(fā)監(jiān)測提供文獻及數(shù)據(jù)支持,為改善HCC患者的預后提供新思路.

1 血清標志物

1.1 AFP AFP是一種結構與人血清白蛋白類似的生物活性蛋白,其分子量大約為70 kDa.1964年Tatarinov首先證實了原發(fā)性肝癌患者血清中存在大量AFP,近幾十年來,AFP是最廣泛的運用于HCC診斷與預后評估等方面的生物標志物.但其不管在診斷HCC的敏感性還是特異性方面都不理想.并且血清AFP值不僅僅只在HCC患者中會升高,在一些慢性肝病、生殖系統(tǒng)腫瘤患者中同樣可能存在AFP的升高,從而導致AFP診斷HCC的假陽性率上升[11].如果將AFP作為一個獨立的篩查指標應用于HCC的診斷顯然是不可取的,但是將AFP與超聲檢查相結合,能大大提高對早期HCC的檢出率.近年來一項薈萃分析顯示,超聲檢查單獨用于HCC診斷的敏感性僅為45%,而將AFP與超聲相結合后的敏感性可達到63%[12].此外,AFP在藥物療效預測方面也發(fā)揮著重要作用[13].最近一項對565例接受索拉非尼治療失敗的HCC患者的隨機對照試驗顯示,在AFP水平高的亞組里應用雷莫蘆單抗治療能給患者帶來更好的長期預后[14].另外一項來自中國的多中心、大樣本的回顧性分析顯示,對于術前AFP＞400 ng/mL的HCC患者,結合其術后AFP水平聯(lián)合評估可以有效預測腫瘤的復發(fā)以及長期預后[15].總之,AFP作為目前在HCC領域運用最廣泛的生物標志物,在HCC的診斷、療效評估、復發(fā)監(jiān)測等方面都發(fā)揮著重要作用.將AFP與其他檢查手段結合,或者將它與其他指標聯(lián)合運用于統(tǒng)計模型,能大大提高AFP在HCC的診斷與治療方面的價值.

1.2 AFP異質體 AFP異質體是甲胎蛋白異常糖基化的產(chǎn)物.1970年Purves對HCC患者血清作凝膠電泳時發(fā)現(xiàn)AFP有不同的遷移率,首先提出了甲胎蛋白異質體這一概念,隨后Taketa等[16,17]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者血清中AFP與小扁豆素結合后,電泳分成三帶,并將其依次命名為AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3,AFP-L3被認為是診斷早期HCC可靠的生物標志物.不同研究報道AFP-L3在診斷早期HCC的敏感性范圍在49%-60%之間[18-20],最近一項來自美國共納入534例患者的Ⅲ期獨立隊列研究表明,當AFP-L3的截斷值為40%時,其診斷早期HCC的敏感性為40%,假陽性率為10%[21].總之,單獨應用AFP-L3對HCC的診斷敏感性仍然較低,但近幾年它被納入多個模型中與其他生物標志物聯(lián)合應用,其聯(lián)合檢測的效能得到較大提升.另外,有研究表明術前AFP-L3水平有助于監(jiān)測肝癌術后早期復發(fā),且術后AFP-L3水平≥5%是影響肝癌患者術后較差預后的獨立危險因素[風險比(hazard ratio,HR): 1.63,95%置信區(qū)間(95% confidence interval,95%CI): 1.18-2.26,P=0.003][22].

1.3 異常凝血酶原 異常凝血酶原,即維生素K缺乏或拮抗誘導的蛋白-Ⅱ(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ),又稱脫-γ-羧基凝血酶原(des-γcarboxy-prothrombin,DCP),是一種在肝癌細胞中凝血酶原前體羧化不足產(chǎn)生的蛋白質,由Liebman等[23]于1984年首次報道.有研究表明[24,25],PIVKA-Ⅱ對HCC的診斷的靈敏度和特異度分別達到了80%和89%.在一項對131例早期HCC患者的Ⅱ期研究中,單獨使用PIVKA-Ⅱ診斷HCC的曲線下面積(area under the receiver operating characteristic,AUROC)為0.72[20].一項國內(nèi)的多中心、大樣本回顧性研究表明,使用PIVKA-Ⅱ單獨診斷丙型病毒性肝炎相關肝癌(HCV-HCC)以及非酒精性脂肪性肝病相關肝癌(NAFLD-HCC)的AUROC均高于單獨使用AFP以及AFP-L3(PIVKA-Ⅱ 0.90vsAFP 0.80vsAFP-L3 0.69;PIVKA-Ⅱ 0.869vsAFP 0.76vsAFP-L3 0.689),另外,將PIVKA-Ⅱ、AFP以及AFP-L3三者聯(lián)合用于診斷可大大提升其診斷效能[26,27].同時有研究指出PIVKA-Ⅱ在肝癌細胞的增值、血管浸潤和轉移過程中發(fā)揮著作用,這意味著它是HCC患者預后判斷的潛在標志物[28,29].另有研究表明[30],術前PIVKA-Ⅱ陽性是預測HCC切除術后早期復發(fā)的獨立危險因素(HR: 2.384,95%CI: 1.735-3.276,P＜0.001).

1.4 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC3)是一類錨定在細胞膜上的癌胚蛋白,Zhou等[31]和Anatelli等[32]在2008年首次報道了其在HCC患者中存在特異性高表達.近年來,GPC3被認為是一種新的HCC血清標志物,該蛋白通過激活Wnt信號通路促進肝癌細胞的生長[33,34].雖然有不少研究報道了GPC3用于診斷HCC的敏感度和特異度,但其結果存在較大差異,一項薈萃分析顯示其診斷HCC的合并敏感度和合并特異度分別為56%和89%[35].另外,最新的一項薈萃分析表明,單獨使用GPC3診斷HCC的AUROC為0.7793[36].此外,近期的一項研究發(fā)現(xiàn)GPC3是肝癌患者術后復發(fā)的獨立危險因素,并將其聯(lián)合其他影像學指標納入術后復發(fā)監(jiān)測的預測模型,該模型展現(xiàn)出了不錯的預測效能(AUROC: 0.931)[37].

1.5 Dickkopf-1 Dickkopf-1(DKK-1)蛋白屬于富含半胱氨酸蛋白家族,于1998年在非洲蟾蜍胚胎細胞中發(fā)現(xiàn)[38].盡管該蛋白被認為是Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑,但其確切的功能尚未完全闡明[39,40].一項薈萃分析顯示[41],DKK-1診斷HCC的合并敏感度和特異度達到了64%和94%.另外一項共納入831名肝癌患者的多中心研究發(fā)現(xiàn)[42],DKK-1在診斷AFP陰性肝癌患者方面的AUROC達到了0.841(95%CI: 0.815-0.923),并且在診斷早期肝癌患者方面也展現(xiàn)出了不錯的效能(AUROC:0.870,95%CI: 0.829-0.911).另有學者研究指出將DKK-1、AFP、PIVKA-Ⅱ三者聯(lián)合用于診斷肝癌的AUROC可以達到0.952,診斷效能優(yōu)于任何單獨與組合的模式[43].對于DKK-1在肝癌的復發(fā)監(jiān)測及預后評估方面的研究較少,有學者報道DKK-1在評價肝癌患者接受經(jīng)導管動脈化療栓塞治療(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)后的療效中具有一定的預測價值[44].

2 血清標志物相關模型

AFP作為HCC診斷及腫瘤進展、療效監(jiān)測的基礎標志物已經(jīng)是無可爭議的,近年來研究者們以AFP為基礎,將它與多種新型標志物結合納入統(tǒng)計模型,可大大提高其敏感度和特異度.

2.1 GALAD模型 GALAD模型是基于性別、年齡、AFP-L3、AFP、DCP這五個變量所構建的統(tǒng)計模型,用于HCC的早期診斷,由Johnson等[45]于2014年首次提出.該模型在診斷早期HCC的敏感性和特異性分別達到了85.6%和93.3%,AUROC為0.9662,特別有助于AFP陰性HCC的早期診斷[45,46].GALAD模型的計算形式為: Z=-10.08+0.09×年齡(歲)+1.67×性別+2.34×log[AFP(ng/mL)]+0.04×AFP-L3 (ng/mL)+1.33×log[DCP(ng/mL)],其中男性賦值為1,女性賦值為0.該模型的效能在一項由梅奧診所牽頭的北美國際隊列(一共291名參與者)中得到了獨立驗證[46-49].然而,該模型暫缺乏更多大型的前瞻性隊列研究來進行檢驗證明,目前,亞洲和中東地區(qū)正在進行相關大型前瞻性的隊列研究[50].

2.2 ASAP模型 爭對中國乙型病毒性肝炎感染相關HCC為主的特點,2019年在一項國內(nèi)多中心的前瞻性研究中基于性別、年齡、AFP、DCP四個變量構建了ASAP模型,用于HCC的早期診斷[51].ASAP模型的計算形式為: [p/(1-p)]=-7.57711770+0.04666357×年齡(歲)-0.57611693×性別+0.42243533×ln[AFP(ng/mL)]+1.10518910×ln[DCP(ng/mL)],其中男性賦值為0,女性賦值為1.該模型較GALAD模型少了一個變量AFP-L3,這大大降低了檢測成本,并且針對中國人群,其用于診斷HCC的效能優(yōu)于GALAD模型(AUROC: 0.935vs0.921,P＜0.006)[51].另外,最近的研究顯示,ASAP用于診斷早期HCV-HCC的效能同樣優(yōu)于GALAD模型(AUROC: 0.917vs0.894),并且在AFP陰性患者亞組中的分析也得到了同樣的結論[52].

2.3 BALAD模型 BALAD模型最初由Toyoda等[53]于2006年構建,由膽紅素、白蛋白、AFP-L3、AFP、DCP五個變量組成,現(xiàn)在也稱BALAD-2模型,用于協(xié)助評估HCC患者的預后.該模型的變量由腫瘤負荷(AFP、DCP、AFP-L3)以及肝功能(膽紅素、白蛋白)兩方面構成,用于HCC患者預后的評估顯然是合理的.一項來自歐美的多中心研究證明BALAD-2模型可評估不同分級患者的生存率,另外一項來自日本的納入24029例HCC患者的全國性調(diào)查也發(fā)現(xiàn),BALAD-2模型有助于對肝細胞癌的分期和預后進行評估[54-56].

2.4 Doylestown算法/Doylestown plus算法 Doylestown算法最初由Wang等[57]于2016年構建,該算法模型由log(AFP)、年齡、性別、堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉移酶五個指標組成.隨后他們在一項涉及69例早期HCC(T1或T2期)患者和93例肝硬化對照的Ⅱ期研究中,將巖藻糖基化激肽原添加到算法中,構建Doylestown plus算法,其診斷早期HCC的AUROC達到了0.97,分別高于單獨使用Doylestown算法和AFP(0.93和0.80)[58].另外在一項包含29例HCC患者)和58例對照組的巢式病例對照研究表明,Doylestown plus算法的敏感性為63.2%[59].目前針對Doylestown plus算法的效能檢驗有更大的Ⅱ期隊列研究正在進行(NCT03878550)[60].

3 液體活檢

液體活檢是指從人體的體液(尤其是血液)中提取具有腫瘤或基因特征信息的微小成分,主要包括循環(huán)游離DNA、循環(huán)游離RNA、細胞外囊泡等;近年來隨著對肝癌細胞研究的深入以及生物學技術的提高,液體活檢技術成為HCC診斷與治療相關領域的另一個熱點[61,62].

3.1 循環(huán)游離DNA 循環(huán)游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)是細胞通過凋亡、壞死和活性分泌釋放到包括血液、尿液和腦脊液在內(nèi)的體液中的DNA分子[63],包括循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、游離線粒體DNA、游離病毒DNA等.其中,ctDNA主要來源于壞死的腫瘤細胞,因此這部分的DNA突變與其來源的腫瘤細胞是相同的,所以可以通過對其突變基因、甲基化等的檢測,來預測早期腫瘤的發(fā)生[64].近年來,ctDNA在HCC的早期診斷以及療效監(jiān)測方面的突出表現(xiàn)得到了學者的肯定.在一項Ⅱ期病例對照研究中,Chalasani等[65]構建的一種名為多靶點HCC血液檢測(mt-HBT)的算法模型,將三種甲基化ctDNA標記物、AFP、性別組合納入模型,對早期HCC的診斷敏感性為82%,特異性為87%,AUROC為0.91.Qu等[66]通過聯(lián)合檢測ctDNA突變(TP53、CTNNB1等)、AFP、PIVKA-Ⅱ,對社區(qū)中乙肝表面抗原陽性患者進行早期HCC的篩查,交叉驗證顯示這個聯(lián)合檢測方法診斷HCC的靈敏度和特異度分別達到了83%和93%.另外,ctDNA在檢測HCC治療期間或緩解期患者體內(nèi)殘留的癌細胞方面具有一定效能,從而監(jiān)測腫瘤早期復發(fā).一項研究表明[67],通過對ctDNA進行相關檢測可以在MRI發(fā)現(xiàn)復發(fā)灶之前預測復發(fā),其性能似乎優(yōu)于血清生物標志物AFP、AFPL3和DCP.另外一項納入258例接受肝切除手術的肝癌患者的前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)[68],術前患者ctDNA中基因突變的總數(shù)與肝癌術后的早期復發(fā)獨立相關(HR=2.2,P＜0.001),這表明通過術前對肝癌患者的ctDNA進行相關檢測可以預測其術后的早期復發(fā).

除了ctDNA外,另外一項巢式病例對照研究發(fā)現(xiàn)[69],游離線粒體DNA含量較低的慢性乙肝患者較含量高的患者發(fā)生肝癌的風險更高(OR: 2.21,95%CI: 1.28-3.72,P=0.004),這也預示了循環(huán)游離線粒體DNA在診斷早期肝癌方面的潛在作用.此外,循環(huán)游離線粒體DNA還可以用于評價TACE聯(lián)合中藥治療后的肝癌患者的療效[70].除此之外,也有相關研究證實了游離病毒DNA在診斷早期肝癌方面的價值[71].一項觀察性研究報道了游離病毒DNA在監(jiān)測乙肝相關肝癌術后腫瘤殘留以及早期復發(fā)方面的價值[72].

3.2 循環(huán)游離RNA 循環(huán)游離RNA(cell-free RNA,cfRNA)是液體活檢另一個獲取腫瘤信息的來源,這是一個非常龐大的家族,種類繁多,包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)、微小RNAs(microRNAs,miRNAs)、circRNA等.已有許多研究證實了LncRNA和miRNAs在HCC診斷以及預后判斷方面的價值[73-75].有研究表明[76]LncRNA如LINC00462、HOTAIR和MALAT1,在肝癌組織中顯著上調(diào),預示其在診斷肝癌方面的潛在作用.有研究報道[77],LncRNA在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用,在發(fā)生轉移的HCC患者中LncRNAAT B上調(diào)預示不良的預后;抑制轉移的Lnc RNA miR503HG上調(diào)預示良好的預后.一項納入50項研究,總計3423例肝癌患者和2403例慢性肝病患者的薈萃分析

研究表明[78],miRNA用于診斷肝癌的AUROC為0.82,敏感性為75.8%,特異性為75%.circRNA作為一種共價閉合環(huán)結構的非編碼RNA,可被分泌到人體循環(huán)血液中,作為疾病診斷的生物標志物[79].Zhang等[80]的研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿中的多種circRNA水平低于肝硬化患者、乙肝患者和健康對照組患者(均P＜0.001),通過ROC分析可以發(fā)現(xiàn)其對診斷HCC良好的敏感度和特異度,并且其在血漿中的水平與TNM分期以及腫瘤大小呈正相關.

3.3 細胞外囊泡 細胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是細胞排出的包含各種生物信息的封閉結構,可以在人血漿中被檢測到,對細胞外囊泡的分析是液體活檢的另一種形式.Sun等[81]將36例早期HCC患者的血漿與26例肝硬化患者的血漿進行比較,運用EV芯片對EV進行檢測,以此來診斷HCC的敏感性達到了94.4%,特異性為88.5%.之后有待更加準確的EV檢測芯片的開發(fā)以及在更大的隊列中對其檢測效能進行驗證.

4 結論

當前,由于HCC早期診斷困難以及治療后較高的復發(fā)率,HCC患者的預后仍然較差,尋求有效的早期診斷以及治療后早期復發(fā)監(jiān)測的方法顯得尤為重要.近年來各種新型生物標志物的出現(xiàn),基于各種生物標志物構建的數(shù)理統(tǒng)計模型的運用,以及液體活檢技術的出現(xiàn)與推廣都大大提高了HCC早期診斷以及復發(fā)監(jiān)測的敏感度與特異度.未來通過對更多新型生物標志物的探索以及更高敏感度與特異度的統(tǒng)計模型的構建,同時隨著二代測序技術的發(fā)展,尋找提高液體活檢敏感度的方法并盡可能減少其費用,以此探索HCC的早期診斷、腫瘤進展、療效評估、早期復發(fā)監(jiān)測、生存期預測更有效的方法工具,從而改善HCC患者預后.