circCLK3通過靶向miR-654-5p促進結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲的機制研究

姜麗琴,郭 赟

姜麗琴,淳安縣第二人民醫(yī)院內(nèi)科 浙江省杭州市 311719

郭赟,杭州師范大學附屬醫(yī)院消化科 浙江省杭州市 310015

0 引言

結(jié)直腸癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,特別是遠處腫瘤擴散患者的生存率較低[1,2],因而探究影響其發(fā)展的分子機制對于結(jié)直腸癌的治療有重要意義.環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)有微小RNA(microRNA,miRNA)的反應元件并可競爭結(jié)合miRNA從而影響蛋白表達.研究顯示[3,4],很多circRNA在結(jié)直腸癌組織中異常表達,并參與調(diào)控了癌細胞的惡性表型.circCLK3被發(fā)現(xiàn)在舌鱗癌組織中高表達,且其敲低可降低癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5].但circCLK3在結(jié)直腸癌中表達及其可能作用機制尚未可知.StarBase預測顯示circCLK3與miR-654-5p能夠通過結(jié)合位點結(jié)合.研究表明[6],miR-654-5p在結(jié)直腸癌細胞中低表達,且其過表達可降低癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移.但circCLK3是否可通過競爭性結(jié)合miR-654-5p而參與結(jié)直腸癌的發(fā)展尚不清楚.因此,我們探究circCLK3是否靶向miR-654-5p而調(diào)控結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲.

1 材料和方法

1.1 材料 從本院招募47例結(jié)直腸癌患者,患者年齡在19歲-70歲之間,男性28例,女性19例,已發(fā)生遠處腫瘤轉(zhuǎn)移的患者是24例.收集癌組織及癌旁組織并保存于-80 ℃.本研究獲得了病人或其親屬的知情同意,且符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求.本研究經(jīng)我院倫理委員會批準,審查文件號: 2023002.

人結(jié)直腸癌細胞SW620購自美國ATCC;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清與胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher;Lipofectamine2000、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen;質(zhì)粒與寡核苷酸由上海吉瑪合成;CCK8試劑盒與雙熒光素酶檢測試劑盒購自上海碧云天;Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD;兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、GAPDH與二抗購自美國Abcam.

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染: SW620細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM并置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱.根據(jù)Lipofectamine2000說明書將si-circCLK3、pcDNAcircCLK3、miR-654-5p mimics、anti-miR-654-5p及相應的對照(si-NC、pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC)轉(zhuǎn)染入細胞.

1.2.2 qRT-PCR: 總RNA用Trizol試劑提取,然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.以cDNA為模板進行qRT-PCR.采用2-ΔΔCt法計算相對表達量并以GAPDH或U6為內(nèi)參.

1.2.3 CCK8: 細胞接種于96孔板培養(yǎng)48 h,然后與CCK8溶液孵育.酶標儀檢測在450 nm處的光密度(OD)值.

1.2.4 克隆形成實驗: 細胞接種于6孔板培養(yǎng)14 d.細胞菌落用甲醇固定和結(jié)晶紫染色,然后在顯微鏡下統(tǒng)計克隆形成數(shù).

1.2.5 劃痕實驗: 細胞接種于6孔板,待細胞長滿時用20 μL槍頭畫出一條筆直的道痕,然后清洗后于顯微鏡下拍照(0 h).將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后用ImageJ軟件分析劃痕愈合率.

1.2.6 Transwell: 細胞接種于預包被Matrigel基質(zhì)膠的上室,下室加入完全培養(yǎng)基.48 h后,細胞經(jīng)多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色,在顯微鏡下統(tǒng)計侵襲細胞數(shù).

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗: 由美國Promega公司構(gòu)建完成含有circCLK3與miR-654-5p結(jié)合位點的野生型載體WT-circCLK3以及含有其突變位點的突變型載體MUT-circCLK3.SW620細胞共轉(zhuǎn)染miR-NC/miR-654-5p mimics和WT-circCLK3/MUT-circCLK3,于48 h后檢測相對熒光素酶活性.

1.2.8 Western blot: 總蛋白用RIPA裂解液提取,經(jīng)SDSPAGE電泳,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上.膜用脫脂牛奶封閉,然后與anti-MMP-2(1:1000)、anti-MMP-9(1:1000)與anti-GAPDH(1:2000)孵育.經(jīng)二抗(1:3000)孵育后,用ECL顯示蛋白條帶并用Quantity One軟件進行灰度分析.

統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)用SPS S21.0軟件分析,以(mean±SD)表示.獨立樣本t檢驗及單因素方差分析進行組間比較,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 circCLK3和miR-654-5p的表達 分析顯示circCLK3在結(jié)直腸癌組織中高表達(P＜0.001),而miR-654-5p低表達(P＜0.001),見圖1.

圖1 circCLK3和miR-654-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達.A: 結(jié)直腸癌中circCLK3高表達;B: 結(jié)直腸癌中miR-654-5p低表達.aP＜0.05,與Normal組(癌旁組織)比較.

2.2 circCLK3敲低影響SW620細胞增殖 結(jié)果顯示,sicircCLK3可以抑制細胞活力和克隆形成數(shù)(P＜0.001),見圖2.

圖2 circCLK3敲低影響SW620細胞增殖.A: 干擾circCLK3轉(zhuǎn)染效率的檢測;B: 干擾circCLK3對結(jié)直腸癌細胞活力的影響;C: 干擾circCLK3對結(jié)直腸癌細胞克隆形成數(shù)影響.aP＜0.05,與si-NC組比較.OD value: 光密度值.

2.3 circCLK3敲低影響SW620細胞遷移、侵襲 sicircCLK3可以抑制劃痕愈合率(P＜0.001)、MMP-2和MMP-9水平(P＜0.001)、侵襲細胞數(shù)(P=0.002),見圖3.

圖3 circCLK3敲低影響SW620細胞遷移、侵襲和相關(guān)蛋白表達.A: 干擾circCLK3對結(jié)直腸癌細胞遷移的影響;B: 干擾circCLK3對結(jié)直腸癌細胞侵襲的影響;C: 遷移侵襲相關(guān)蛋白表達.aP＜0.05,與si-NC 組比較.MMP-2: 基質(zhì)金屬蛋白酶-2;MMP-9: 基質(zhì)金屬蛋白酶-9;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

2.4 circCLK3靶向miR-654-5p 軟件分析結(jié)果顯示circCLK3可以與miR-654-5p互補結(jié)合.雙熒光素酶分析結(jié)果顯示miR-654-5p可以抑制WT-circCLK3的熒光素酶活性降低(P＜0.001)而不影響MUT-circCLK3的熒光素酶活性.此外,pcDNA-circCLK3可以抑制miR-654-5p的表達(P＜0.001),而si-circCLK3可以促進miR-654-5p的表達(P＜0.001),見圖4.

圖4 circCLK3靶向miR-654-5p.A: circCLK3含有miR-654-5p的互補序列;B: 雙熒光素酶報告實驗;C: miR-654-5p的表達被circCLK3調(diào)控.aP＜0.05,與miR-NC組比較;bP＜0.05,與pcDNA組比較;cP＜0.05,與si-NC組比較.

2.5 過表達miR-654-5p影響SW620細胞增殖、遷移和侵襲 miR-654-5p可以抑制細胞活力(P=0.002)、劃痕愈合率(P=0.001)、MMP-2和MMP-9水平(P＜0.001)、克隆形成數(shù)(P=0.002)和侵襲細胞數(shù)(P=0.007),見圖5.

圖5 過表達miR-654-5p影響SW620細胞增殖、遷移、侵襲和相關(guān)蛋白表達.A: 過表達miR-654-5p轉(zhuǎn)染效率的檢測;B: 過表達miR-654-5p對結(jié)直腸癌細胞活力的影響;C: 過表達miR-654-5p對結(jié)直腸癌細胞克隆形成數(shù)影響;D: 過表達miR-654-5p對結(jié)直腸癌細胞遷移的影響;E: 過表達miR-654-5p對結(jié)直腸癌細胞侵襲的影響;F: 遷移侵襲相關(guān)蛋白表達.aP＜0.05,與miR-NC組比較.MMP-2: 基質(zhì)金屬蛋白酶-2;MMP-9: 基質(zhì)金屬蛋白酶-9;GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

2.6 抑制miR-654-5p逆轉(zhuǎn)了circCLK3敲低對SW620細胞進程的影響 si-circCLK3+anti-miR-654-5p可以促進細胞活力(P=0.001)、劃痕愈合率(P=0.001)、MMP-2和MMP-9水平(P＜0.001)、克隆形成數(shù)(P=0.001)、侵襲細胞數(shù)((P=0.002),見圖6.

圖6 抑制miR-654-5p逆轉(zhuǎn)了circCLK3敲低對細胞增殖、遷移、侵襲和相關(guān)蛋白表達的影響.A: miR-654-5p在結(jié)直腸癌細胞中的表達;B:結(jié)直腸癌細胞的活力;C: 結(jié)直腸癌細胞的克隆形成數(shù);D: 結(jié)直腸癌細胞的遷移;E: 結(jié)直腸癌細胞的侵襲;F: 遷移侵襲相關(guān)蛋白表達.aP＜0.05,與si-circCLK3+anti-miR-NC組比較.MMP-2: 基質(zhì)金屬蛋白酶-2;MMP-9: 基質(zhì)金屬蛋白酶-9;GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

2.7 circCLK3通過靶向miR-654-5p促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲 circCLK3在結(jié)直腸癌細胞中上調(diào)表達,miR-654-5p下調(diào)表達,miR-654-5p抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,circCLK3通過海綿miR-654-5p降低miR-654-5p的水平促進結(jié)直腸癌的增殖、遷移和侵襲,作用示意圖見圖7.

圖7 circCLK3通過靶向miR-654-5p促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲示意圖.

3 討論

先前的研究已經(jīng)表明circRNA是由3’端與5’端以共價鍵結(jié)合形成的一類閉合環(huán)狀RNA分子,并具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)性與組織特異性等特點.目前研究已證實circRNA參與了結(jié)直腸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[7,8].另外,大量的circRNA可作為結(jié)腸癌靶向治療的相關(guān)靶點,并通過靶向miRNA而正向調(diào)控靶基因的表達進而調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)展[9,10].

circCLK3在宮頸癌組織中高表達,下調(diào)其表達可抑制宮頸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移通過靶向miR-320a/FoxM1途徑[11].circCLK3通過充當miR-455-5p的海綿分子而下調(diào)PARVA,進而促進舌鱗狀細胞癌增殖,遷移,和侵襲[5].但circCLK3在結(jié)直腸癌進程中的作用尚未研究.本研究發(fā)現(xiàn),circCLK3在結(jié)直腸癌組織中高表達,且其敲低可抑制癌細胞增殖.這表明circCLK3具有促進結(jié)直腸癌細胞增殖的作用.MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶,被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)并促進細胞轉(zhuǎn)移[12,13].本研究發(fā)現(xiàn),circCLK3敲低可抑制細胞遷移及侵襲,并降低MMP-2和MMP-9表達,表明示circCLK3可以促進結(jié)直腸癌細胞遷移及侵襲.

為進一步探究circCLK3在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制,本研究證實circCLK3與miR-654-5p存在靶向調(diào)控作用,circCLK3可靶向結(jié)合miR-654-5p.既往的報道顯示,miR-654-5p在乳腺癌中低表達,其過表達可降低癌細胞的生長和侵襲能力[14].另外,上調(diào)miR-654-5p可抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15],并降低卵巢癌細胞的生長能力[16,17].此外,miR-654-5p已經(jīng)被報道在結(jié)腸癌患者中是高表達,并且它的高表達是結(jié)腸癌患者不良的預后標志物[18].這可能是因為腫瘤的發(fā)生事一類極其復雜的生物學過程,一些病例可能是因子的上調(diào),一些病例可能就是下調(diào).本研究中發(fā)現(xiàn),miR-654-5p在結(jié)直腸癌組織中低表達,其過表達可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移.另外,anti-miR-654-5p可拮抗si-circCLK3對癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用,表明circCLK3靶向miR-654-5p而促進結(jié)直腸癌發(fā)展.

4 結(jié)論

綜上所述,circCLK3在結(jié)直腸癌SW620細胞中上調(diào),miR-654-5p表達下調(diào),干擾circCLK3可通過靶向miR-654-5p抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲.這些結(jié)果意味著靶向抑制circCLK3可能是治療結(jié)直腸癌的有效舉措,但這些研究只局限于體外的實驗,關(guān)于circCLK3在體內(nèi)是如何作用于結(jié)直腸癌以及相關(guān)的作用機制仍有待繼續(xù)研究.

文章亮點

實驗背景

先前的研究證實了環(huán)狀RNA在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤進展中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)因子作用.然而,circCLK3的功能和潛在的調(diào)控機制在結(jié)直腸癌進展尚不清楚.

實驗動機

探索circCLK3是否可以調(diào)控結(jié)直腸癌的進展,為臨床治療結(jié)直腸癌提供有效靶點.

實驗目標

以miR-654-5p為切入點探索circCLK3在結(jié)直腸癌中的作用和機制,這可能是CRC的治療靶點.

實驗方法

qRT-PCR法檢測circCLK3、miR-654-5p在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織的表達;采用CCK8、克隆形成實驗、劃痕實驗與Transwell實驗分析細胞增殖、遷移及侵襲;采用雙熒光素酶報告分析circCLK3與miR-654-5p的靶向關(guān)系;采用Western blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9蛋白表達.

實驗結(jié)果

我們實驗結(jié)果證實了circCLK3在結(jié)直腸癌中的作用和潛在的機制.數(shù)據(jù)展示了circCLK3在結(jié)直腸癌組織中高表達,而miR-654-5p低表達;功能實驗驗證 si-circCLK3可以降低細胞活力、劃痕愈合率、MMP-2和MMP-9蛋白表達、克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù);circCLK3可負向調(diào)控miR-654-5p的表達;miR-654-5p抑制細胞活力、劃痕愈合率、MMP-2和MMP-9蛋白表達、克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù);另外,si-circCLK3+anti-miR-654-5p可以促進細胞活力、劃痕愈合率、MMP-2和MMP-9蛋白表達、克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù).

實驗結(jié)論

這次研究揭示了circCLK3在結(jié)直腸癌組織和細胞中上調(diào),干擾circCLK3通過促進miR-654-5p表達來抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲.因此,我們認為circCLK3/miR-654-5p軸可能對調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌進展至關(guān)重要,并且可能是結(jié)直腸癌的治療靶點.

展望前景

本研究了circCLK3/miR-654-5p軸可以調(diào)控結(jié)直腸癌生物惡性行為,為臨床治療CRC提供有效靶點.