高溫脅迫對(duì)新菠蘿灰粉蚧不同地理種群保護(hù)酶活性的影響

李德偉,羅亞偉,黃 杏,易婷婷,覃振強(qiáng)

(廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所,南寧 530007)

新菠蘿灰粉蚧DysmicoccusneobrevipesBeardsley屬半翅目Hemiptera粉蚧科Pseudococcidae,主要為害劍麻、菠蘿、柑橘、南瓜、番茄、可可和香蕉等39科76種寄主植物,是熱帶和亞熱帶農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物的重要害蟲(chóng)(覃振強(qiáng)等,2010;Qinetal., 2013; 林曉佳等, 2013; 胡鐘予等, 2017)。新菠蘿灰粉蚧是一種高度危險(xiǎn)的檢疫性有害生物。該粉蚧于1998年在海南省昌江縣青坎農(nóng)場(chǎng)暴發(fā)危害劍麻,2006年開(kāi)始在廣東省湛江市劍麻種植區(qū)發(fā)生蔓延,2015年在廣西壯族自治區(qū)欽州市劍麻種植區(qū)發(fā)生危害,嚴(yán)重脅迫劍麻產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展;此外,在臺(tái)灣省菠蘿種植區(qū)、云南省景洪市劍麻和金邊龍舌蘭等花卉植物上也發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)危害(Jayma and Ronald, 2007; 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2007;覃振強(qiáng)等,2010;Qinetal., 2013; Qinetal., 2019)。隨著全球氣候的變暖,新菠蘿灰粉蚧在我國(guó)有加劇危害的趨勢(shì),至2050年該粉蚧的適生區(qū)將北移到上海、江蘇和安徽的南部,潛在危害性十分巨大(傅遼等,2012)。因此應(yīng)加強(qiáng)新菠蘿灰粉蚧在不同生境的基礎(chǔ)生物學(xué)及其防控方面的研究工作(林曉佳等,2013)。

溫度升高對(duì)害蟲(chóng)種群生態(tài)及擴(kuò)散產(chǎn)生重大影響,從昆蟲(chóng)生理水平上研究溫度脅迫可揭示其作用機(jī)制(袁盛勇等, 2016)。研究表明,新菠蘿灰粉蚧最適宜生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的溫度范圍是23～29℃,過(guò)高溫度不利于其生長(zhǎng)和繁殖(Qinetal., 2013)。不同地理種群的新菠蘿灰粉蚧由于長(zhǎng)期生長(zhǎng)環(huán)境不一樣,因此對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)性可能存在差異,在生理上對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)也可能會(huì)有一定的差異。過(guò)氧化物酶(Peroxidase, POD)、酚氧化酶(Phenoloxidse, PO)及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferases, GST)是昆蟲(chóng)抵抗不良因子的3種重要保護(hù)酶。研究表明,POD可以清除昆蟲(chóng)在高溫環(huán)境下產(chǎn)生的大量活性氧(Reactive oxygen species, ROS),降低ROS對(duì)蟲(chóng)體造成氧化損傷;PO是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的免疫蛋白,是黑色素生物合成的關(guān)鍵酶,在昆蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育、免疫和防御系統(tǒng)中都起著重要的作用;GST是昆蟲(chóng)解毒酶系統(tǒng)中的一類重要的多功能超基因家族酶,昆蟲(chóng)通過(guò)調(diào)節(jié)自身體內(nèi)GST活力變化來(lái)代謝或清除高溫脅迫產(chǎn)生的有害物質(zhì),從而維持其機(jī)體的正常生理代謝(Felton &Summers, 1995; 徐亞玲和李文楚,2010;崔娟等,2021;王常清等,2021)。高溫對(duì)昆蟲(chóng)的POD、PO及GST活性均會(huì)產(chǎn)生影響,POD、PO及GST活性的變化差異體現(xiàn)出其影響昆蟲(chóng)對(duì)高溫的適應(yīng)性(袁盛勇等,2016;張志虎等,2018;崔娟等,2021)。因此,研究高溫脅迫下不同地理環(huán)境新菠蘿灰粉蚧的POD、PO及GST的酶活性差異有助于闡明其對(duì)溫度的適應(yīng)性。目前尚未見(jiàn)有相關(guān)的研究報(bào)道。本研究擬從新菠蘿灰粉蚧不同地理種群在高溫脅迫下體內(nèi) 3種酶活力的變化中分析該粉蚧對(duì)高溫脅迫的生理響應(yīng)機(jī)理,進(jìn)而了解其田間不同地理種群對(duì)極端高溫環(huán)境的適應(yīng)性,為研究該害蟲(chóng)的生態(tài)適應(yīng)性評(píng)價(jià)及對(duì)其全球區(qū)域性分布擴(kuò)張趨勢(shì)分析提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試?yán)ハx(chóng)

所用的新菠蘿灰粉蚧,廣西種群采自于廣西欽州市浦北縣張黃鎮(zhèn)的廣西農(nóng)墾東方農(nóng)場(chǎng)有限公司的劍麻作物上,廣東種群采自于廣東省湛江市雷州市英利鎮(zhèn)劍麻作物上,海南種群采自于海南省昌江縣石碌鎮(zhèn)青坎村劍麻作物上,云南種群采自于云南省西雙版納州景洪市西雙版納熱帶花卉園的劍麻作物上。將新菠蘿灰粉蚧不同種群分別置于不同的實(shí)驗(yàn)室用南瓜進(jìn)行繼代繁殖,飼養(yǎng)溫度為26±1℃,繼代繁殖5代以上作不同地理種群的供試蟲(chóng)源。

1.1.2試劑與儀器

主要試劑:POD、PO、GST試劑盒均購(gòu)于蘇州格銳思生物科技有限公司。

主要儀器:恒溫培養(yǎng)箱(RXZ-280B-LED,寧波江南儀器廠)、多功能酶標(biāo)儀(Spark,帝肯上海貿(mào)易有限公司)、冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Mikro 200R,德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司)、可調(diào)式移液器(德國(guó)艾本德股份公司)、電子天平(AL-204,梅特勒-托利多儀器上海有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1試蟲(chóng)處理

本試驗(yàn)選擇35℃、38℃、41℃、44℃共4個(gè)高溫梯度為脅迫溫度,處理時(shí)間為2 h,以室溫26℃為對(duì)照處理。用柔軟的小毛筆挑取健康雌成蟲(chóng)移入放置有新鮮劍麻葉片的培養(yǎng)皿內(nèi),每個(gè)不同地理種群按以上各溫度處理分別選取120～130頭,挑夠數(shù)量后用保鮮膜覆蓋皿口,并用昆蟲(chóng)針在保鮮膜上插些小孔,放入相應(yīng)溫度梯度,相對(duì)濕度為75%±5%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)處理2 h,每個(gè)不同地理種群及溫度處理均隨機(jī)稱取經(jīng)處理后的成蟲(chóng)0.1 g為測(cè)定樣本,3次重復(fù)。

POD、PO和GST的活力測(cè)定嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒(蘇州格銳思生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的公式計(jì)算活力值。POD、PO和GST的活力測(cè)定波長(zhǎng)分別為470 nm、490 nm和340 nm。POD活性單位定義為每克樣品每分鐘在反應(yīng)體系中使470 nm處吸光值增加1為1個(gè)酶活力單位;PO活性單位定義為每克樣品每分鐘在反應(yīng)體系中使490 nm處吸光值變化0.001為1個(gè)酶活力單位;GST活性單位定義為每克樣品每分鐘催化1 nmol的CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活力單位。

1.2.2數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后,計(jì)算活力值。采用DPS 9.01統(tǒng)計(jì)軟件,使用單因素方差分析(ANOVA)分析不同地理種群各高溫脅迫下新菠蘿灰粉蚧成蟲(chóng)3種保護(hù)酶活性的差異顯著性(P<0.05),并采用Duncan’s法檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)新菠蘿灰粉蚧不同地理種群POD活性的影響

不同高溫脅迫處理下新菠蘿灰粉蚧不同地理種群POD活性表明(表1):在常溫下廣西、廣東種群POD活性遠(yuǎn)高于海南、云南種群,差異顯著(P<0.05);在高溫脅迫處理2 h后,各高溫脅迫處理下不同地理種群的POD活性值相比常溫均有所提高,但廣西、廣東種群在各高溫脅迫處理間及與常溫的POD活性均差異不顯著(P>0.05),海南種群在41℃高溫脅迫下的POD活性顯著高于常溫的(P<0.05),而其它高溫脅迫處理下的POD活性與常溫的相比差異不顯著(P>0.05),云南種群在35℃、44℃高溫脅迫下的POD活性與常溫的相比差異不顯著(P>0.05),而在38℃、41℃高溫脅迫下的POD活性顯著高于常溫的(P<0.05);從不同溫度處理下不同地理種群POD活性及其變化來(lái)看,海南種群POD活性最低,且各溫度處理下其POD均維持較低活性,而廣西種群和廣東種群各溫度處理下POD均維持較高活性,其活性值是海南種群相應(yīng)處理下POD活性的 2.7～6.5倍,云南種群在26℃、35℃溫度處理下POD活性較低,但38℃、41℃和44℃高溫處理下其POD活性迅速提升;除了廣東種群在44℃高溫處理下其POD活性還在提升外,其它各種群在38℃或41℃高溫處理下其POD活性達(dá)到高峰后均開(kāi)始回落;在高溫脅迫中云南種群變化幅度最大,POD活性從最低的常溫6.33 U/g/min經(jīng)高溫脅迫后達(dá)到最高36.67 U/g/min。

表1 高溫脅迫下新菠蘿灰粉蚧不同地理種群雌成蟲(chóng)POD活性(U/g/min)Table 1 POD activity of female adults of Dysmicoccus neobrevipes in different geographic populations under high temperature stress

2.2 高溫脅迫對(duì)新菠蘿灰粉蚧不同地理種群PO活性的影響

不同溫度處理下新菠蘿灰粉蚧不同地理種群PO活性檢測(cè)結(jié)果表明(表2):在常溫下各地理種群間的PO活性差異不顯著(P>0.05);在35℃、38℃高溫處理下廣西、廣東、海南3個(gè)種群間的PO活性差異不顯著(P>0.05),但均顯著低于云南種群的PO活性(P<0.05);在41℃高溫處理下4個(gè)種群間PO活性差異不顯著(P>0.05);在44℃高溫處理下廣西種群PO活性顯著低于廣東、海南種群的(P<0.05)。從不同溫度處理下不同地理種群PO活性及其變化來(lái)看,在高溫脅迫處理2 h后,除了38℃處理的云南種群外,其它各高溫脅迫處理下不同地理種群的PO活性相比常溫均出現(xiàn)不同程度的下降;35℃處理下各種群的PO活性急劇下降,均顯著低于常溫的(P<0.05);38℃處理下各種群的PO活性相比于35℃的又急劇上升,均顯著高于35℃處理的(P<0.05),云南種群的PO活性甚至還高于常溫處理的;41℃相比于38℃處理,除了廣西種群PO活性上升外其它3個(gè)種群的PO活性均又開(kāi)始下降;44℃處理下各種群PO活性相比于41℃處理繼續(xù)下降;各種群在不同高溫脅迫中云南種群變化幅度最大,PO活性從常溫的1 152.11 U/g/min上升到38℃處理的1 369.86 U/g/min,再降低到44℃處理的806.59 U/g/min。

表2 高溫脅迫下新菠蘿灰粉蚧不同地理種群雌成蟲(chóng)PO活性(U/g/min)Table 2 PO activity of female adults of Dysmicoccus neobrevipes in different geographic populations under high temperature stress

2.3 高溫脅迫對(duì)新菠蘿灰粉蚧不同地理種群GST活性的影響

不同溫度處理下新菠蘿灰粉蚧不同地理種群GST活性檢測(cè)結(jié)果表明(表3):在相同溫度處理下除了38℃處理下廣東種群的GST活性顯著低于其它種群的外,其它相同溫度處理的不同種群間的GST活性無(wú)顯著差異(P>0.05);從不同溫度處理下各地理種群GST活性及其變化來(lái)看,通過(guò)35℃、38℃、41℃和44℃高溫脅迫處理后不同地理種群GST活性均比常溫處理高,廣西、海南和云南種群在38℃高溫脅迫處理的GST活性達(dá)到最高,相比其它溫度處理的活性差異顯著(P<0.05),GST活性值是相應(yīng)種群常溫的11～18倍,廣東種群在41℃脅迫處理下GST活性達(dá)到最高;不同地理種群隨著脅迫溫度的升高其GST活性呈先升高后下降的趨勢(shì),其中海南種群GST活性變化幅度最大,廣東種群GST活性變化幅度最小。

表3 高溫脅迫下新菠蘿灰粉蚧不同地理種群雌成蟲(chóng)GST活性(U/nmol/min/g)Table 3 GST activity of female adults of Dysmicoccus neobrevipes in different geographic populations under high temperature stress

3 結(jié)論與討論

昆蟲(chóng)是變溫動(dòng)物,保持和調(diào)節(jié)體內(nèi)溫度的能力不強(qiáng)。環(huán)境溫度影響昆蟲(chóng)生命活動(dòng)中全部化學(xué)反應(yīng)的速率,從而通過(guò)影響昆蟲(chóng)的酶及酶促反應(yīng)速率來(lái)影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖及存活等生命活動(dòng)(杜堯等,2007)。POD與其它抗氧化酶一起形成一整套高效清除ROS的保護(hù)機(jī)制(Felton &Summers, 1995),清除昆蟲(chóng)在高溫環(huán)境下產(chǎn)生的大量ROS,降低ROS對(duì)蟲(chóng)體造成氧化損傷(李毅平等,1998;崔娟等,2021)。本研究發(fā)現(xiàn),新菠蘿灰粉蚧不同地理種群在35～44℃高溫脅迫處理2 h后其POD活性均比26℃常溫對(duì)照處理下的活性有所提高,且除廣東種群外,其它3個(gè)種群均隨處理溫度的升高POD活性表現(xiàn)為先升高后降低的變化,這與高溫脅迫對(duì)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲Monoleptahieroglyphica、雙齒多刺蟻polyrhachisdives和梨小食心蟲(chóng)Grapholitamolesta的影響結(jié)果相似(劉纏民等,2007;劉彥飛,2013;張志虎等,2018),但與高溫脅迫對(duì)扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis成蟲(chóng)POD活性均低于常溫對(duì)照的結(jié)果不同(袁盛勇等,2016)。新菠蘿灰粉蚧成蟲(chóng)在35～44℃高溫處理下POD活性隨溫度先升高后降,這是因?yàn)樵撓x(chóng)在高溫脅迫下ROS在體內(nèi)大量產(chǎn)生,抗氧化機(jī)制通過(guò)提高POD活性清除體內(nèi)在高溫環(huán)境下產(chǎn)生的大量ROS,對(duì)自身起到保護(hù)作用;然而隨著處理溫度繼續(xù)升高,POD活性開(kāi)始降低,說(shuō)明在較高溫度條件下新菠蘿灰粉蚧體內(nèi)POD酶活性開(kāi)始下降甚至抑制。本研究中新菠蘿灰粉蚧廣西種群雌成蟲(chóng)在41℃、44℃高溫脅迫處理下的POD活性開(kāi)始下降,說(shuō)明這溫度下對(duì)該種群產(chǎn)生了不利影響,這與前期高溫脅迫對(duì)新菠蘿灰粉蚧廣西種群成蟲(chóng)死亡率影響試驗(yàn)中35℃、38℃高溫脅迫死亡率為0,而41℃、44℃高溫脅迫下開(kāi)始出現(xiàn)較低的死亡率的結(jié)果相附,但在47℃高溫脅迫2 h下該粉蚧死亡率為100%(李德偉等,2021)。新菠蘿灰粉蚧云南種群POD活性變化幅度最激烈,說(shuō)明POD在云南種群應(yīng)對(duì)高溫脅迫中發(fā)揮較大的作用,而海南種群在高溫脅迫下POD一直在低活性下變動(dòng),可能POD在海南種群應(yīng)對(duì)高溫脅迫中發(fā)揮的作用相對(duì)于其它種群小,這也可能是該種群適應(yīng)了海南熱帶地區(qū)高溫,不會(huì)因高溫脅迫而產(chǎn)生大量的ROS,從而導(dǎo)致POD活性不高,是海南種群對(duì)高溫適應(yīng)性的一種表現(xiàn)。

PO是生物體內(nèi)一類含銅氧化酶,在昆蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育、免疫和防御系統(tǒng)中都起著重要的作用。本研究的4個(gè)新菠蘿灰粉蚧不同地理種群成蟲(chóng)在高溫脅迫處理下除了云南種群在38℃高溫脅迫處理外其它處理的PO活性均比26℃對(duì)照處理低;35℃處理下各種群的PO活性急激下降,均顯著低于常溫;38℃處理下各種群的PO活性相比于35℃又急激上升,均顯著高于35℃處理,之后隨著脅迫的溫度升高又開(kāi)始緩慢下降。這與東亞飛蝗酚氧化酶在25℃時(shí)有最高活性,超過(guò)35℃后酶活性降低的結(jié)果相似(趙卓等,2011)。新菠蘿灰粉蚧雌成蟲(chóng)在高溫脅迫下相比于最適溫度,PO活性是顯著下降,這說(shuō)明高溫對(duì)PO活性影響顯著,但PO活性的下降說(shuō)明新菠蘿灰粉蚧雌成蟲(chóng)在高溫脅迫下的免疫能力下降,影響其對(duì)高溫的適應(yīng)能力,也說(shuō)明其在應(yīng)對(duì)高溫脅迫中沒(méi)有起到積極的抵抗作用。

GST是昆蟲(chóng)解毒酶系統(tǒng)中的一類重要的多功能超基因家族酶,可以催化還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)和疏水、親電底物的共價(jià)結(jié)合,形成共軛物,隔離在液泡或轉(zhuǎn)移到質(zhì)外體,從而對(duì)內(nèi)源和外來(lái)有害物質(zhì)進(jìn)行降解,以達(dá)到降低細(xì)胞損害的作用(袁盛勇等,2016;宋文等,2020)。在本研究中,不同溫度處理下各地理種群GST活性及其變化來(lái)看,通過(guò)35～44℃高溫脅迫處理后不同地理種群GST活性均比26℃常溫處理高,廣西、海南和云南種群在38℃高溫及廣東種群在41℃高溫脅迫處理下的GST活性達(dá)到最高,與其它溫度處理下的GST活性差異顯著,這說(shuō)明高溫對(duì)GST活性的有顯著影響,GST在高溫脅迫適應(yīng)性中起到積極作用;GST活性升高可能是由于高溫脅迫導(dǎo)致昆蟲(chóng)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累,誘導(dǎo)了GST的活力提升來(lái)加快代謝脂質(zhì)過(guò)氧化物,減少活性氧的傷害;然而隨著溫度的繼續(xù)升高,其活力發(fā)生顯著性的下降,可能較高的溫度損傷了體內(nèi)某些機(jī)能而影響GST發(fā)揮作用。

綜上所述,高溫脅迫對(duì)新菠蘿灰粉蚧不同地理種群成蟲(chóng)的POD、PO及GST活性均會(huì)產(chǎn)生影響。在一定范圍的高溫脅迫下,POD及GST活性均比常溫高,對(duì)抵抗高溫脅迫起到積極作用;而PO活性卻通常比常溫低,可能在應(yīng)對(duì)高溫脅迫中沒(méi)有起到積極的抵抗作用。然而,在38℃、41℃和44℃高溫處理下廣西、廣東、云南種群間的POD活性無(wú)顯著差異;在相同高溫處理下除了廣東種群38℃處理的GST活性顯著低于其它種群的外,其它相同溫度處理的不同種群間的GST活性無(wú)顯著差異;這說(shuō)明POD在廣西、廣東、云南種群應(yīng)對(duì)38℃、41℃、44℃高溫適應(yīng)性和GST在廣西、廣東、海南、云南種群應(yīng)對(duì)35℃、41℃、44℃高溫的適應(yīng)性均無(wú)明顯差異。新菠蘿灰粉蚧不同地理種群成蟲(chóng)間在某一溫度處理下的POD、PO及GST活性差異可能不同,這可能是新菠蘿灰粉蚧不同地理種群對(duì)環(huán)境溫度適應(yīng)性差異的反映。