六種同域分布雌雄異株榕樹揮發(fā)物多樣性與系統(tǒng)發(fā)育一致性

陳明波,王 剛,彭艷瓊,王 波*

(1. 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南勐臘 666303;2. 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

植物與昆蟲之間的傳粉互惠關(guān)系廣泛存在于自然界中,傳粉者可以根據(jù)植物花揮發(fā)物來精準(zhǔn)定位植物獲取食物,并幫助植物傳粉(Kantsaetal., 2017)。因此,花揮發(fā)物是開花植物與其傳粉者之間交流的重要化學(xué)信號(Raguso, 2008; 2009),但不同類群的傳粉昆蟲對特定種類的揮發(fā)物具有選擇偏好,例如切葉蜂科與倍半萜類、蜜蜂科和地蜂科與芳香族化合物以及苯丙烷類、多數(shù)的寄生蜂類群與六碳的綠葉物質(zhì)或者萜類物質(zhì),從而保證了植物近緣種之間的生殖隔離(Dudarevaetal., 2013; Kantsaetal., 2019)。特別是在專性的植物-傳粉者相互作用中,花揮發(fā)物的特異性組成以及專性傳粉者對它的特異性識別,對于維持專性傳粉關(guān)系以及植物的成功繁殖至關(guān)重要(Wareetal., 1993; Chenetal., 2009)。

榕樹是桑科Morance榕屬Ficus植物的總稱,必須通過專一的榕小蜂為其傳粉才能實(shí)現(xiàn)有性生殖,而傳粉榕小蜂將榕果作為繁殖場所(Janzen, 1979)。二者形成了專性的傳粉-育幼互利共生關(guān)系,任何一方的缺失都會導(dǎo)致互利共生關(guān)系的破裂(Borges, 2015)。榕樹的花著生在甕型的果腔內(nèi),形成了特殊的隱頭花序結(jié)構(gòu)(又稱榕果)。榕果發(fā)育分為5個時期:雌花前期、雌花期(又稱接收期)、間花期、雄花期、花后期(Galil &Eisikowitch, 1968)。其中,雌花期榕果會釋放濃郁的揮發(fā)性氣味來吸引其專一傳粉榕小蜂的到訪,是維持專性傳粉互作的關(guān)鍵。另外一方面,不同榕樹之間為了避免傳粉錯配,其種間揮發(fā)物的組成及含量差異較大(Proffit &Johnson, 2009),而近緣種榕樹的雌花期揮發(fā)物組成相似,且存在共享傳粉者的現(xiàn)象(Cornilleetal., 2012; Wangetal., 2016)。傳粉者共享打破了榕樹-榕小蜂之間“一對一”的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系(Wangetal., 2021),而雌花期釋放相似的揮發(fā)物是導(dǎo)致兩種榕樹間傳粉者共享的重要原因之一。

榕樹可分為功能性雌雄同株與雌雄異株。兩類樹的榕果中都包含兩種特征鮮明的雌花類型,分別是長花柱型和短花柱型。長花柱型雌花在被授粉后發(fā)育成種子,具有繁殖功能;短花柱型可支持榕小蜂產(chǎn)卵、形成癭花,待癭花內(nèi)的子代榕小蜂羽化后,攜帶花粉完成傳粉功能。雌雄同株的榕樹,兩種類型的雌花共存于榕果中,傳粉榕小蜂進(jìn)入雌花期榕果內(nèi)在短花柱雌花上產(chǎn)卵,并為長花柱雌花傳粉,最終同一果內(nèi)既生產(chǎn)種子,又繁殖榕小蜂。與之相比,雌雄異株的雄果內(nèi)只有短花柱雌花,傳粉榕小蜂進(jìn)入果內(nèi)只產(chǎn)卵繁殖自身后代;而雌果內(nèi)只有長花柱雌花,經(jīng)榕小蜂傳粉后,發(fā)育成種子;也就是種子的產(chǎn)生和榕小蜂的繁殖在不同性別樹上完成(Janzen, 1979; Kjellbergetal., 1987; Weiblenetal., 1995)。對于同域分布的多種近緣種雌雄異株榕樹而言,雌花期榕果揮發(fā)物(下文簡稱“榕果揮發(fā)物”)的差異對于維持種間生殖隔離具有重要的作用,而保持雌雄間揮發(fā)物的相似性是成功生存和繁衍的關(guān)鍵。因此,本研究以中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園內(nèi)聚果榕亞屬的6種雌雄異株榕樹為研究對象,采用頂空固相微萃取方法對榕果揮發(fā)物進(jìn)行收集,并進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析。探討以下科學(xué)問題:(1)6種近緣榕樹榕果揮發(fā)物主要組成成分有哪些?(2)其榕果揮發(fā)物種類及組成在種間、種內(nèi)性別間存在怎樣的差異?(3)榕果揮發(fā)物的差異是否與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系有關(guān)?本研究對于理解同域近緣榕樹及其榕小蜂的協(xié)同進(jìn)化以及物種分化機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)概況與實(shí)驗(yàn)材料

采樣地點(diǎn)位于中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園及其周邊(21°56′N,101°15′E),該區(qū)域有非常豐富的榕樹資源(許再富, 1994)。本實(shí)驗(yàn)選取聚果榕亞屬的6種雌雄異株榕樹,分別是:雞嗉子榕Ficussemicordata、對葉榕F.hispida、異形花榕F.heterostyla、木瓜榕F.auriculata、肉托榕F.squamosa、蘋果榕F.oligodon。

1.2 雌花期榕果揮發(fā)物的收集

2020年11月-2021年11月,選取實(shí)驗(yàn)榕樹,并在雌花前期時用紗網(wǎng)袋(200目)進(jìn)行套袋,以避免非傳粉小蜂對榕果揮發(fā)物的干擾。當(dāng)紗網(wǎng)袋外環(huán)繞著大量的傳粉小蜂,或者聞到濃郁的特殊氣味,意味著榕果發(fā)育至雌花期。此時,采集榕果,并將其帶回實(shí)驗(yàn)室,采用頂空固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME,手柄:57330-U,萃取頭:Supelco 57310-U,65 um,PDM/DVB,USA)的方法收集榕果揮發(fā)物(耿向宗等, 2014)。首先將采集的榕果用超純水沖洗掉表面的雜物,然后放入潔凈的Teflon采樣袋內(nèi)(聚四氟乙烯,北京浩辰天誠環(huán)?？萍加邢薰?,兩端密封好后,利用頂空固相微萃取裝置萃取1 h。實(shí)驗(yàn)在9∶00-17∶00之間,室溫條件進(jìn)行。采樣時所用每種榕果數(shù)量在10～30個之間(木瓜榕果較大,選用1個果)。以空的Teflon采樣袋為對照,實(shí)驗(yàn)所用的采樣袋均為一次性使用。

1.3 雌花期榕果揮發(fā)物的分析與鑒定

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS: 7890 B-5977 B;Agilent Techologies, USA)分析萃取的榕果揮發(fā)物,GC的分析條件:HP-5 MS石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),柱溫在40～250℃之間,程序升溫的初始溫度是40℃,保持1 min,再以6℃/min升溫至250℃,保持10 min,進(jìn)樣口溫度為250℃,柱前壓:7.0699 psi,柱流量:1.0 mL/min,載氣為高純氦氣(99.999%)。MS條件:以電子轟擊方式電離,掃描范圍28.50～450 u,電子能量為70 eV,傳輸線溫度250℃,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃。針對化合物的鑒定,將樣品與對照進(jìn)行比較,扣除掉潛在的雜質(zhì)化合物。再根據(jù)正構(gòu)烷烴的保留時間計(jì)算各個峰的保留指數(shù)(Van Den Dool &Kratz, 1963)。將質(zhì)譜圖在標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST17)中進(jìn)行檢索,并查閱已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)資料所報道的保留指數(shù)(同NIST Chemical web book,http://webbook.nist. gov)相比較,確定化合物(Adams, 2007)。對部分化合物進(jìn)行了人工合成標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的比對(用“*”標(biāo)示,見附表1)來進(jìn)一步確定化合物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各組分的相對含量按峰面積歸一化法來計(jì)算(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差),以和弦圖的形式來表示化合物相對含量和6種榕樹之間的關(guān)系(Guetal., 2014)。用相似百分比分析(Similarity Percentage,SIMPER)確定導(dǎo)致種間差異的主要貢獻(xiàn)化合物,對累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到80%的主要化合物以和弦圖的形式呈現(xiàn)。對6種榕樹雌花期榕果揮發(fā)物的組成進(jìn)行NMDS分析(Nonmetric Multidimensional Scaling,非度量多維尺度分析),用置換多變量方差分析(Permutational Multivariate Analysis of Variance Using Distance Matrices,PERMANOVA)來比較榕樹種內(nèi)、種間榕果揮發(fā)物組成的統(tǒng)計(jì)差異(Oksanenetal., 2007; Sarkar, 2008)?；衔锵鄬堪凑瘴锓N和性別分別進(jìn)行平均,對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化轉(zhuǎn)換后,利用完全連接聚類法進(jìn)行聚類分析(Maechleretal., 2012)。6種榕樹的系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)提取自近期發(fā)表的全基因組重測序數(shù)據(jù)構(gòu)建的榕屬系統(tǒng)樹(Zhangetal., 2020)。分別計(jì)算榕樹遺傳距離矩陣(p-distance)以及榕果揮發(fā)物的距離矩陣(Bray-Curtis dissimilarity index),然后對兩個矩陣進(jìn)行mantel test檢驗(yàn),隨機(jī)置換999次(Legendreetal., 2015)。本研究所有數(shù)據(jù)分析均在R軟件(R version 4.1.1, https://www.r-project.org/)中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌花期榕果揮發(fā)物組成及相對含量

從6種榕樹的雌花期榕果共鑒定出77種揮發(fā)物成分,包含脂肪酸類衍生物6種、單萜類化合物16種、倍半萜類衍生物50種、芳香族化合物5種以及7種化合物未被鑒定的化合物(請見附件增強(qiáng)出版材料)。雞嗉子榕(n=13)含有的化合物種類最少,僅有13種,但獨(dú)特化合物對甲基苯甲醚(芳香族化合物)的相對含量達(dá)85.8%;對葉榕(n=19)的化合物種類最多,有44種;其它榕樹,即異形花榕(n=12)有37種,木瓜榕(n=12)有31種,肉托榕(n=16)有29種,蘋果榕(n=8)有18種。D-檸檬烯(D-Limonene)和β-羅勒烯(β-Ocimene)同時存在于6種榕樹之中,但它們在6種榕樹上所占的相對含量均不同。例如,D-檸檬烯在蘋果榕中含量最高(13.24%±18.44%),木瓜榕中最低(0.37%±1.27%);β-羅勒烯在蘋果榕中含量最高(28.17%±22.53%),雞嗉子榕中含量最低(0.86%±0.77%)。

2.2 種間與種內(nèi)榕果揮發(fā)物的分析及比較

6種榕樹之間化合物組成與相對含量的和弦圖(圖1)表明:異形花榕不含脂肪酸類衍生物,木瓜榕和肉托榕不含芳香族化合物,且每種榕樹都含有其自身特有的化合物組成及相對含量。其中,木瓜榕和異形花榕各有6種特異性化合物,對葉榕有9種,蘋果榕有1種,肉托榕有3種,雞嗉子榕有5種。木瓜榕、異形花榕、對葉榕、蘋果榕和肉托榕的組成較為接近,均以單萜和倍半萜為主,但雞嗉子榕以芳香族化合物相對含量最高,與其它5種榕樹的揮發(fā)物組成差異極顯著(P<0.001,表1)。

表1 6種雌雄異株榕樹兩兩種間以及種內(nèi)性別間PERMARVAONVA分析結(jié)果Table 1 Pairwise analysis of variance using distance matrices of 6 diecious Ficus species and between sex comparison

圖1 6種雌雄異株榕樹雌花期榕果揮發(fā)物弦狀圖Fig.1 Circularize chart to show the fig floral volatile organic compounds composition of 6 dioecious Ficus注:顏色代表不同的化合物或榕樹物種。柱子寬度代表化合物百分比的總和?；衔锩Q縮寫見附表2,物種名縮寫如下:Aur, F. auriculata; Het, F. heterostyla; His, F. hispida; Oli, F. oligodon; Sem, F. semicordata; Squ, F. squamosa. Note: Different colors represented chemicals and Ficus species. The width of bars represented the sum of percentages for each chemical and Ficus species, respectively. Aur, F. auriculata; Het, F. heterostyla; His, F. hispida; Oli, F. oligodon; Sem, F. semicordata; Squ, F. squamosa.

SIMPER顯示:累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到80%的化合物種類有39種化合物(附表2)。芳香族化合物對甲基苯甲醚的貢獻(xiàn)率最高(木瓜榕-雞嗉子榕、異形花榕-雞嗉子榕、對葉榕-雞嗉子榕、蘋果榕-雞嗉子榕和肉托榕-雞嗉子榕的貢獻(xiàn)率均是0.43),其次是單萜類化合物β-羅勒烯(蘋果榕-木瓜榕、異形花榕-蘋果榕、對葉榕-蘋果榕、雞嗉子-蘋果榕和肉托榕-蘋果榕的貢獻(xiàn)率分別是0.13、0.13、0.12、0.14和0.13),然后是倍半萜類衍生物喜沙木烯(Prezizaene)(異形花榕-木瓜榕、對葉榕-木瓜榕和肉托榕-木瓜榕的貢獻(xiàn)率均是0.08)。雞嗉子榕和其它榕樹間的差異主要由對甲基苯甲醚貢獻(xiàn)(附圖1)。累積貢獻(xiàn)率排名前十的其余7種化合物分別是D-檸檬烯、桉葉油醇(Eucalyptol)、β-法尼烯(β-Farnesene)、芳樟醇(Linalool)、β-柏木烯(β-Cedrene)、β-人參烯(β-Panasinsene)、胡蘿卜烯(Daucene)。

NMDS分析結(jié)果表明,種間的揮發(fā)物距離較大,而種內(nèi)性別間差異較小(stress=0.14,R2=0.98,圖2)。6種榕樹種間揮發(fā)物均具有顯著差異(PERMANOVA,F5,74=27.65,P<0.001)。而種內(nèi)兩性間差異均不顯著(表1)。對于近緣種榕樹,例如異形花榕和肉托榕它們共享25種化合物,種間差異顯著(PERMANOVA,F1,26=8.16,P<0.001)。蘋果榕和木瓜榕共享9種化合物,種間化合物差異顯著(PERMANOVA,F1,18=12.74,P<0.001)。

圖2 6種榕樹榕果雌花期揮發(fā)物的非度量多維尺度分析Fig.2 Non-metric multi-dimension scaling analysis of the floral volatiles of 6 dioecious Ficus注:化合物距離矩陣基于Bray-Curtis距離。每個點(diǎn)代表一個采樣樣本。相同的顏色表示同一種樹,M,雄樹;F,雌樹。Note: Distances computed by Bray-Curtis dissimilarity; Each point was a sample; Points with the same color represented a Ficus species. Polygon marks the range of points representing the same species in two dimensions. F, Female tree; M, Male tree.

2.3 雌花期榕果揮發(fā)物與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

雌花期榕果揮發(fā)物聚類顯示:榕樹被分為6大類,且同種榕樹的雌樹與雄樹均聚為一小枝,榕果揮發(fā)物聚類樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育樹之間的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有一定的對應(yīng)關(guān)系(圖3-A)。Mantel test表明雌花期榕果揮發(fā)物的組成會受到系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系影響,即親緣關(guān)系越近的榕樹,其榕果揮發(fā)物組成會越相似(r=0.55,P<0.05,圖3-B)。

圖3 榕樹系統(tǒng)發(fā)育樹與榕樹雌花期榕果揮發(fā)物的相關(guān)性Fig.3 Correlation between Ficus phylogeny and floral volatile organic compounds注:(A) 左邊系統(tǒng)樹是基于榕樹全基因組構(gòu)建的最大似然樹,A右邊雌花期榕果揮發(fā)物聚類樹是基于完全連接聚類分析構(gòu)建。(B) 榕樹遺傳距離與榕樹雌花期榕果揮發(fā)物距離的相關(guān)性,基于Mantel test分析結(jié)果表明兩者具有顯著的相關(guān)性(r=0.55,P<0.05)。Note: (A) Congruence between Ficus phylogeny (left side, maximum likelihood tree based on whole genome) and floral volatile organic compounds clustering tree (left side, hierarchical cluster tree with complete linkage method). (B) Correlation between Ficus genetic distance and floral volatile organic compounds Bray-Curtis distance. Mantel test shows significant positive correlation (r=0.55,P<0.05).

3 結(jié)論與討論

本研究從聚果榕亞屬6種雌雄異株榕樹的榕果揮發(fā)物中鑒定出77種揮發(fā)物成分,表明雌花期榕果揮發(fā)物具有較高的化合物組成多樣性。物種間揮發(fā)物組成具有顯著差異,但同一物種不同性別間的化合物組成上沒有顯著的差異。種間的差異在維持物種分化上具有重要意義,而種內(nèi)的揮發(fā)物相似性保證了榕樹和榕小蜂能夠成功繁殖。榕樹雌花期揮發(fā)物的差異與榕樹系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系呈正相關(guān)性,暗示榕果揮發(fā)物是進(jìn)化上保守的。上述結(jié)果支持榕樹和傳粉榕小蜂之間以揮發(fā)物識別為基礎(chǔ)的特異性互作機(jī)制,而且這種機(jī)制的形成是長期漸進(jìn)式進(jìn)化的結(jié)果。

3.1 種間榕果揮發(fā)物的差異分析

在6種雌雄異株榕樹的揮發(fā)物中,累積貢獻(xiàn)率最大的是對甲基苯甲醚,它是雞嗉子榕的特異性揮發(fā)物,且這一揮發(fā)物已被證實(shí)對其傳粉榕小蜂具有強(qiáng)烈的吸引作用(Chenetal., 2009)。除了這種單一物質(zhì)特異性吸引的互作模式之外,其他榕果可能通過不同揮發(fā)物的配比來吸引各自的傳粉榕小蜂,這是一種“泛化”模式(Proffitetal., 2020)。如聚果榕、對葉榕以及無花果等均是這種“泛化”模式(Songetal., 2001; Soleretal., 2011; Proffitetal., 2020)。如果以揮發(fā)物的貢獻(xiàn)率作為傳粉榕小蜂的行為活性指標(biāo),本研究中的其余5種榕樹和榕小蜂的互作模式應(yīng)視為“泛化”模式(Hossaert-McKeyetal., 2010)。NMDS分析中發(fā)現(xiàn)肉托榕和異形花榕難以區(qū)分,考慮到二者之間存在傳粉者共享的現(xiàn)象(Liuetal., 2015),這可能是由于二者生境差異較大、花期不同步等造成的。因此,生境、物候等因素也可以在一定程度上避免傳粉錯配。但另外一方面,PERMANOVA分析顯示6種榕樹化合物組成在種間水平差異顯著(P<0.05),與NMDS結(jié)果與之基本相似,這意味著“泛化”模式是同域分布內(nèi)的榕樹實(shí)現(xiàn)種間生殖隔離的重要保證。

3.2 種內(nèi)榕果揮發(fā)物的相似性

6種雌雄異株榕樹雌花期榕果揮發(fā)物在種內(nèi)雌雄之間相互重疊,差異均不顯著,這表明相似的榕果揮發(fā)物可能使傳粉榕小蜂無法區(qū)分雌、雄樹,從而保證傳粉榕小蜂的隨機(jī)拜訪的功能。這也符合Hossaert-McKey等(2016)提出的化學(xué)擬態(tài)的假設(shè)(Hossaert-McKeyetal., 2016)。此外,Proffit等(2020)在無花果揮發(fā)物吸引傳粉小蜂的行為實(shí)驗(yàn)中,也發(fā)現(xiàn)了傳粉榕小蜂對雌花期榕果的選擇在性別之間沒有偏好(Proffitetal., 2020)。因此,雌雄榕樹相似性是保證該種榕樹有性生殖成功的重要途徑。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育對雌花期榕果揮發(fā)物組成的影響

Machado等(2005)提出發(fā)散式協(xié)同進(jìn)化假說,即傳粉榕小蜂與榕樹在屬水平上存在明顯對應(yīng)關(guān)系,但在相應(yīng)的組內(nèi)、近緣榕屬植物之間可能存在著基因交流(Machadoetal., 2005)。在本研究中,6種聚果榕亞屬榕樹的遺傳距離矩陣和雌花期榕果揮發(fā)物距離矩陣之間呈正相關(guān)性,且親緣距離越近,榕果揮發(fā)物組成越相似,表明榕果揮發(fā)物是榕小蜂宿主轉(zhuǎn)移和榕樹近緣種間雜交的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),這也解釋了此前研究關(guān)于近緣種之間共享傳粉者的現(xiàn)象(Wangetal., 2016),但是,其它因素,如:地理隔離(Soleretal., 2011; Weietal., 2014; Souto‐Vilarósetal., 2018),生境差異(魏作東, 2010)、物候的錯位(劉桂香, 2013)以及傳粉者(Fribergetal., 2019)等也可能在近緣種間隔離中發(fā)揮著重要作用。聚焦雌花期榕果揮發(fā)物的釋放情況,結(jié)合傳粉小蜂對榕果揮發(fā)物的行為實(shí)驗(yàn),篩選出具有吸引活性的化合物,從化學(xué)生態(tài)學(xué)的角度整合榕樹與傳粉小蜂相互關(guān)系,將有利于揭示榕樹與其小蜂群落互作的化學(xué)感知機(jī)制。

致謝：感謝中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園文平、郭娟在化合物分析過程中給予的指導(dǎo)和幫助。感謝曹力提供了正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品。感謝郁文彬在系統(tǒng)發(fā)育分析中提供的意見和建議。感謝董亞坤、劉倬橙、玉玻香在野外實(shí)驗(yàn)中的幫助。