二陳湯對PCOS大鼠卵巢中NF-κB和NLRP3介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用

施書梅 姜培培 王曉燕 黃愛紅

〔摘要〕 目的 研究二陳湯對多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）大鼠卵巢中核因子-κB（factor-kappa-B， NF-κB）和NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及意義。方法 將成年雌性SD大鼠隨機分成空白對照組、PCOS組、二陳湯組、二甲雙胍組?？瞻讓φ战M給予普通飼料喂養(yǎng)，PCOS組、二陳湯組和二甲雙胍組均采用來曲唑灌胃聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的方式進行PCOS造模;空白對照組和PCOS組進行生理鹽水灌胃，二陳湯組進行二陳湯灌胃，二甲雙胍組進行二甲雙胍灌胃，共30 d。采用HE染色檢測卵巢組織形態(tài)學(xué)變化;采用試劑盒檢測血清黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone， FSH）、雌二醇（estradiol， E2）、睪酮（testosterone， T）、抗米勒管激素（anti mullerian hormone， AMH）、總膽固醇（total cholesterol， TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、空腹血糖（fasting blood glucose， FBG）、空腹胰島素（fasting insulin， FINS）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein， CRP）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）水平;計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）;采用Western blot檢測卵巢組織中TLR4、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表達水平。結(jié)果 PCOS組大鼠卵巢組織中可見大量囊狀擴張卵泡和閉鎖卵泡，未見優(yōu)勢卵泡，黃體減少;血清LH、T、AMH、TC、TG、FBG、FINS、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，LH-FSH、HOMA-IR水平，卵巢組織中TLR4、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表達水平高于空白對照組（P<0.05），血清FSH、E2水平低于空白對照組（P<0.05）。二陳湯組和二甲雙胍組卵巢組織中可見各級卵泡、黃體增多;血清LH、T、AMH、TC、TG、FBG、FINS、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，LH-FSH、HOMA-IR水平，卵巢組織中TLR4、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表達水平低于PCOS組，血清FSH、E2水平高于PCOS組（P<0.05）。結(jié)論 二陳湯可顯著改善PCOS大鼠的卵巢形態(tài)學(xué)特征、內(nèi)分泌紊亂并減輕炎癥狀態(tài)，抑制卵巢組織中NF-κB和NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是相關(guān)的分子機制。

〔關(guān)鍵詞〕 多囊卵巢綜合征;二陳湯;胰島素抵抗;炎癥反應(yīng);核因子-κB;NOD樣受體蛋白3

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.002

〔Abstract〕 Objective To study the regulation of Erchen Decoction on nuclear factor-kappa-B （NF-κB） and NOD-like receptor protein 3 （NLRP3） mediated inflammatory response in ovaries of rats with polycystic ovary syndrome （PCOS）， and to discuss the significance. Methods Adult female SD rats were randomly divided into blank group， PCOS group， Erchen Decoction group， and metformin group. Blank group was given normal feeding while PCOS group， Erchen Decoction group， and metformin group were all given letrozole by gavage combined with high-fat diet to establish PCOS model. After modeling， blank group and PCOS group were given normal saline by gavage， while Erchen Decoction group and metformin group were given corresponding drugs by gavage respectively for a total of 30 days. The ovarian histomorphological changes were detected by hematoxylin and eosin （HE） staining， while the levels of serum luteinizing hormone （LH）， follicle stimulating hormone （FSH）， estradiol （E2）， testosterone （T）， anti mullerian hormone （AMH）， total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， fasting blood glucose （FBG）， fasting insulin （FINS）， C-reactive protein （CRP）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were determined by kits. Then the insulin resistance index （HOMA-IR） was measured. And the expression levels of toll-likereceptor 4 （TLR4）， NF-κB， NLRP3， ASC， and cysteinyl aspartate specific proteinase-1 （Caspase-1） in ovarian tissue were measured by Western blot. Results In rats of PCOS group， there were a large number of expanded follicles and atresia follicles but no dominant follicles， and the corpus lutea decreased. The levels of serum LH， T， AMH， TC， TG， FBG， FINS， CRP， IL-1β， IL-6， and levels of TNF-α， LH/FSH ratio， and HOMA-IR were higher than those of rats in blank group， so were the expression levels of TLR4， NF-κB， NLRP3， ASC， Caspase-1 in rat ovarian tissue （P<0.05）， while the levels of serum FSH and E2 were lower than those of rats in blank group （P<0.05）. There were follicles at all levels and the corpus lutea increased in rat ovarian tissue in Erchen Decoction group and metformin group. In these two groups， the levels of serum LH， T， AMH， TC， TG， FBG， FINS， CRP， IL-1β， IL-6， and levels of TNF-α， LH/FSH ratio， and HOMA-IR were lower than those of rats in PCOS group， so were the expression levels of TLR4， NF-κB， NLRP3， ASC， and Caspase-1 in rat ovarian tissue， while the levels of serum FSH and E2 were higher than those of rats in PCOS group （P<0.05）. Conclusion Erchen Decoction can significantly improve the ovarian morphological features and relieve endocrine disorders in rats with PCOS. Meanwhile， it can reduce inflammation and inhibit NF-κB and NLRP3 mediated inflammatory response in the ovarian tissue.

〔Keywords〕 polycystic ovary syndrome; Erchen Decoction; insulin resistance; inflammatory response; nuclear factor-kappa-B; NOD-like receptor protein 3

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）是一種以月經(jīng)紊亂、稀發(fā)排卵或無排卵、高雄激素血癥、胰島素抵抗、肥胖、糖脂代謝紊亂為主要特征的生殖代謝功能異常疾病[1-2]。近些年，關(guān)于PCOS的分子生物學(xué)研究認為慢性微炎癥的持續(xù)激活是與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子機制之一，卵巢組織中核因子-κB（factor-kappa-B， NF-κB）以及NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)不僅與卵巢多囊樣改變及排卵障礙有關(guān)，還參與全身胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂的發(fā)生[3-4]。因此，針對NF-κB和NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進行干預(yù)是糾正PCOS相關(guān)生殖代謝功能異常的有效靶點。中醫(yī)學(xué)認為，PCOS屬于“月經(jīng)不調(diào)”“閉經(jīng)”“癥瘕”范疇，“痰濕不孕”是疾病的重要病機[5]，出自《太平惠民和劑局方》的二陳湯能夠針對PCOS的“痰濕不孕”發(fā)揮燥濕化痰作用，相關(guān)動物實驗證實二陳湯對PCOS大鼠的卵巢多囊樣改變、胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂具有改善作用[6-7]，但相關(guān)的分子機制并不清楚。為深入認識二陳湯治療PCOS的分子機制，本研究將通過動物實驗觀察二陳湯對PCOS大鼠卵巢中NF-κB和NLRP3介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及意義。

1 材料與方法

1.1? 實驗材料

1.1.1? 實驗動物? 8周齡、SPF級SD雌性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，使用許可：SYXK（蘇）2016-0050。動物實驗遵循3R原則，取得醫(yī)院倫理委員會批準（批準日期2020-11-20）。

1.1.2? 實驗藥物? 參照文獻[6-7]制備二陳湯，湯劑組成為半夏12 g、陳皮9 g、茯苓15 g、甘草6 g，由醫(yī)院藥劑科提供，混合濃縮成生藥含量為0.88 g/mL的水煎劑;來曲唑片和鹽酸二甲雙胍片分別購買于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司和中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.1.3? 實驗試劑? HE染色試劑盒（批號M027，上海歌凡生物公司）;酶聯(lián)免疫吸附法測定試劑盒（上海西唐生物科技公司）;生化檢測配套試劑（批號969706，美國Beckman公司）;小鼠來源抗大鼠Toll樣受體4（TLR4）（批號ab13556）、NF-κB（批號ab220803）、NLRP3（批號ab263899）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）（批號ab283684）、胱天蛋白酶-1（Caspase-1）（批號ab207802）一抗（美國Abcam公司）。

1.1.4? 實驗儀器? E100型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）;AU5800型生化分析儀（美國Beckman公司）;EPS300型凝膠電泳儀、Tanon4800型凝膠化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 動物分組、PCOS造模及藥物治療? 實驗前先對大鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)、持續(xù)1周，而后將大鼠分為空白對照組10只和模型大鼠30只?？瞻讓φ战M給予10 mL·（kg·d）-1生理鹽水灌胃及普通飼料喂養(yǎng);其余各組給予來曲唑1 mg·（kg·d）-1灌胃聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)21 d。大鼠進行陰道涂片，連續(xù)觀察4 d，顯微鏡下觀察陰道涂片，出現(xiàn)陰道上皮持續(xù)角化判斷為PCOS造模成功。造模成功的大鼠分為PCOS組、二陳湯組、二甲雙胍組，每組各10只。

造模成功后進行給藥?？瞻讓φ战M和PCOS組給予10 mL·（kg·d）-1蒸餾水灌胃，連續(xù)30 d;參照文獻[7]確定二陳湯組的給藥劑量，給予生藥含量0.88 g/mL的二陳湯10 mL·（kg·d）-1灌胃，連續(xù)30 d;二甲雙胍組給予鹽酸二甲雙胍片0.1 g·（kg·d）-1溶于10 mL/kg 蒸餾水中灌胃，連續(xù)30 d。末次給藥后禁食不禁水過夜，次日空腹進行標本采集。

1.2.2? ELISA檢測血清指標? 腹腔注射戊巴比妥鈉（0.04 g/kg）麻醉，經(jīng)心臟采血2～3 mL，4 ℃、3500 r/min（半徑10 cm）離心15 min，采用生化分析儀檢測總膽固醇（total cholesterol， TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、空腹血糖（fasting blood glucose， FBG）、空腹胰島素（fasting insulin， FINS），采用ELISA檢測黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone， FSH）、雌二醇（estradiol， E2）、睪酮（testosterone， T）、抗米勒管激素（anti mullerian hormone， AMH）、C反應(yīng)蛋白（C reaction protein， CRP）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）的水平，計算LH/FSH比值，按照穩(wěn)態(tài)模型計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG×FINS/22.5[6]。

1.2.3? HE染色檢測卵巢組織形態(tài)學(xué)? 麻醉狀態(tài)下取大鼠的左側(cè)卵巢組織，在4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋并制作病理切片，進行HE染色及中性樹膠封片，觀察卵巢組織在HE染色下的形態(tài)學(xué)變化，拍照記錄。

1.2.4? Western blot檢測卵巢組織中的蛋白表達? 麻醉狀態(tài)下取大鼠的右側(cè)卵巢組織，在液氮中冷凍后放入低溫冰箱;檢測時取30 mg卵巢組織，加入裂解液進行研磨，研磨液在4 ℃、12 000 r/min（半徑10 cm）離心15 min，取上清液檢測蛋白濃度。將蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜后封閉，放入TLR4、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、β-actin一抗中，4 ℃孵育過夜;次日復(fù)溫后洗膜3次，加入1∶2000稀釋的山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h。最后洗膜3次并進行化學(xué)發(fā)光，用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參、計算目標蛋白的表達水平。

1.3? 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)均為符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，以“x±s”表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用SNK-q法進行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 二陳湯對PCOS大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響

各組大鼠卵巢組織的HE染色見圖1，空白對照組大鼠卵巢組織中可見各個發(fā)育階段的卵泡及正常的成熟卵泡、黃體;PCOS組大鼠卵巢組織中未見優(yōu)勢卵泡，卻可見大量囊狀擴張卵泡和閉鎖卵泡，并且黃體數(shù)量明顯減少;二陳湯組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織中可見各個發(fā)育階段的卵泡及正常的成熟卵泡，囊狀擴張卵泡減少，并且黃體數(shù)量增多。

2.2? 二陳湯對PCOS大鼠血清性激素水平的影響

PCOS組大鼠的血清LH、LH/FSH、T、AMH水平高于空白對照組，F(xiàn)SH、E2水平低于空白對照組（P<0.05）;二陳湯組、二甲雙胍組大鼠的血清LH、LH/FSH、T、AMH水平低于PCOS組，F(xiàn)SH、E2水平高于PCOS組（P<0.05）。詳見表1。

2.3? 二陳湯對PCOS大鼠血清糖脂代謝指標的影響

PCOS組大鼠的血清TC、TG、FBG、FINS水平及HOMA-IR水平高于空白對照組（P<0.05）;二陳湯組、二甲雙胍組大鼠的血清TC、TG、FBG、FINS水平及HOMA-IR水平低于PCOS組（P<0.05）。詳見表2。

2.4? 二陳湯對PCOS大鼠血清CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響

PCOS組大鼠的血清CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于空白對照組（P<0.05）;二陳湯組、二甲雙胍組大鼠的血清CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于PCOS組（P<0.05）。詳見表3。

2.5? 二陳湯對PCOS大鼠卵巢組織中TLR4、NF-κB表達水平的影響

PCOS組大鼠卵巢組織中TLR4、NF-κB的表達水平高于空白對照組（P<0.05）;二陳湯組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織中TLR4、NF-κB的表達水平低于PCOS組（P<0.05）。詳見圖2。

2.6? 二陳湯對PCOS大鼠卵巢組織中NLRP3、ASC、Caspase-1表達水平的影響

PCOS組大鼠卵巢組織中NLRP3、ASC、Caspase-1的表達水平高于空白對照組（P<0.05）;二陳湯組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織中NLRP3、ASC、Caspase-1的表達水平低于PCOS組（P<0.05）。詳見圖3。

3 討論

現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究認為，卵巢組織中持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)的激活在PCOS的生殖內(nèi)分泌功能紊亂中起到重要作用[7-8]。卵巢組織中炎癥細胞因子的釋放一方面直接損傷顆粒細胞、不利于卵泡發(fā)育，進而導(dǎo)致稀發(fā)排卵或無排卵;另一方面刺激雄激素產(chǎn)生，進而加重排卵障礙，也造成全身高雄激素表現(xiàn)。同時，炎癥反應(yīng)的激活還會影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、降低胰島素敏感性，進而導(dǎo)致胰島素抵抗和代償性的高胰島素血癥。

來曲唑給藥聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)是建立PCOS模型動物的常用方法，該造模方法能夠模擬PCOS的排卵障礙、胰島素抵抗、糖脂代謝異常等生殖內(nèi)分泌功能紊亂特征，與PCOS的臨床表現(xiàn)具有高度一致性[9-10]。本研究進行PCOS造模后在卵巢組織中未觀察到優(yōu)勢卵泡，且觀察到大量囊狀擴張卵泡和閉鎖卵泡，同時黃體數(shù)量明顯減少，符合PCOS的組織學(xué)特征;血清中性激素LH、LH/FSH、T、AMH水平升高，F(xiàn)SH、E2水平降低，符合PCOS高雄激素的特征;糖脂代謝指標TC、TG、FBG、FINS、HOMA-IR升高，符合PCOS胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂的特征。以上結(jié)果與既往PCOS相關(guān)基礎(chǔ)研究的結(jié)果相似[9-10]，表明本研究中來曲唑給藥聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的PCOS模型制備成功。

中醫(yī)學(xué)認為PCOS多為痰濕證，脾虛痰濕、壅塞胞宮是PCOS子宮病變的關(guān)鍵病機?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認為長期脾虛痰濕參與微炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展[11-12]。二陳湯的功效為健脾益氣、燥濕化痰，能夠針對PCOS的中醫(yī)病機發(fā)揮治療作用;該方中半夏為君藥，起燥濕化痰的作用;陳皮為臣藥，起理氣和中的作用;茯苓為佐藥，起健脾利水的作用;甘草為使藥，起調(diào)和諸藥的作用[13-14]。已有相關(guān)動物實驗證實，二陳湯對PCOS大鼠的生殖內(nèi)分泌功能紊亂具有改善作用[6，15]。本研究中PCOS大鼠接受二陳湯治療后血清中的各項性激素指標及糖脂代謝指標均明顯改善，提示二陳湯顯著改善PCOS的生殖內(nèi)分泌功能紊亂，與既往其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[6，15];同時本研究還觀察到二陳湯治療后PCOS大鼠卵巢組織中囊狀擴張卵泡減少、可見各個發(fā)育階段的卵泡及正常的成熟卵泡、黃體數(shù)量增多，為二陳湯發(fā)揮PCOS的治療價值提供了直接的組織學(xué)依據(jù)。

在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究對二陳湯治療PCOS的分子機制進行了探索。卵巢組織中持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)的激活與PCOS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，炎癥反應(yīng)的激活、炎癥細胞因子的釋放會影響卵巢內(nèi)分泌功能、導(dǎo)致多種性激素水平改變，也影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂。NF-κB和NLRP3在PCOS卵巢組織的炎癥反應(yīng)激活中起關(guān)鍵作用。NF-κB是TLR4下游的核轉(zhuǎn)錄因子，對多種炎癥細胞因子的表達具有促進作用;NLRP3與ASC、Caspase-1共同組成炎癥小體，對促炎因子IL-1β的成熟和釋放具有促進作用，IL-1β可進一步刺激多種炎癥細胞因子的釋放。已有研究證實，PCOS卵巢組織中NF-κB和NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過度激活，抑制兩者介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可顯著改善PCOS的生殖內(nèi)分泌功能紊亂[16-17]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，二陳湯具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，且這一作用與抑制NF-κB和NLRP3的表達有關(guān)[18-20]?；诖?，本研究以NF-κB和NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)為切入點初步探索二陳湯治療PCOS的相關(guān)分子機制。PCOS大鼠接受二陳湯治療后，血清多種炎癥因子含量均明顯降低，提示二陳湯抑制PCOS大鼠的炎癥反應(yīng);卵巢組織中TLR4、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1的表達水平明顯降低，表明二陳湯對PCOS大鼠卵巢組織中NF-κB和NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，進而提示二陳湯改善PCOS的生殖內(nèi)分泌功能紊亂的作用與其抑制NF-κB和NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，二陳湯治療PCOS大鼠，顯著改善卵巢組織中多囊改變及卵泡發(fā)育異常、排卵障礙的組織學(xué)特征，同時改善性激素水平和糖脂代謝;進一步對分子機制進行探索，二陳湯治療PCOS的相關(guān)分子機制可能是抑制卵巢組織中NF-κB和NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

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