囊胚玻璃化冷凍預(yù)平衡時(shí)間對(duì)輔助生殖妊娠結(jié)局的影響

張留光，李寧，李玉虎，蔡雪想

·論 著·

囊胚玻璃化冷凍預(yù)平衡時(shí)間對(duì)輔助生殖妊娠結(jié)局的影響

張留光，李寧，李玉虎，蔡雪想

?？诂旣愥t(yī)院生殖中心，海南?？?570102

探討囊胚激光皺縮后縮短玻璃化冷凍預(yù)平衡時(shí)間對(duì)臨床妊娠及新生兒結(jié)局的影響?；仡櫺苑治?018年1月至2021年12月于?？诂旣愥t(yī)院進(jìn)行囊胚復(fù)蘇移植患者的臨床資料，從中篩選501例患者518個(gè)移植周期。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室囊胚玻璃化冷凍技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序修訂前后的預(yù)平衡時(shí)間將其分為A組（9～10min）和B組（7～8min），比較兩組間的妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局。兩組患者的年齡、移植胚胎數(shù)、卵泡刺激素、體質(zhì)量指數(shù)、不孕年限、原發(fā)不孕比例、移植日內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜方案比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）；兩組的囊胚存活率、著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率、母體并發(fā)癥比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。兩組的新生兒性別比、孕周、早產(chǎn)兒比例、出生體質(zhì)量、低出生體重兒、巨大兒、剖宮產(chǎn)、出生缺陷比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。囊胚激光皺縮后，縮短玻璃化冷凍預(yù)平衡時(shí)間不影響囊胚復(fù)蘇移植的妊娠結(jié)局。

玻璃化冷凍；囊胚；時(shí)間；妊娠結(jié)局

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)囊胚復(fù)蘇移植的比例不斷擴(kuò)大。囊胚移植有諸多優(yōu)點(diǎn)，如有助于胚胎質(zhì)量自我篩選、提高成功率、有效降低多胎率、減少卵裂期胚胎保存數(shù)量、進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷等。玻璃化冷凍方法在輔助生殖領(lǐng)域的成功運(yùn)用和快速發(fā)展，使得胚胎凍存更為簡(jiǎn)便、高效和安全[1]。目前，國(guó)內(nèi)多數(shù)中心采用商品化試劑盒進(jìn)行囊胚玻璃化冷凍。然而，玻璃化冷凍試劑中通常含有乙二醇和二甲基亞砜，這些物質(zhì)對(duì)胚胎的細(xì)胞毒性并未得到大家的足夠重視。眾所周知，冷凍保護(hù)劑的暴露時(shí)間和濃度是影響細(xì)胞內(nèi)冰晶形成和細(xì)胞毒性的兩個(gè)重要因素。為降低冷凍保護(hù)劑對(duì)囊胚的細(xì)胞毒性，多數(shù)中心將胚胎暴露于高濃度冷凍液中的時(shí)間限制在40～60s，但在低濃度冷凍保護(hù)劑中的預(yù)平衡時(shí)間不盡相同[2-5]。在行囊胚玻璃化冷凍之前進(jìn)行激光皺縮，可使囊胚在平衡液中的暴露時(shí)間更加靈活[6-10]。研究顯示，卵裂期胚胎不同的玻璃化冷凍預(yù)平衡時(shí)間可對(duì)臨床結(jié)局產(chǎn)生影響，而囊胚方面是否影響臨床及新生兒結(jié)局卻少有報(bào)道[11-12]。本研究擬評(píng)價(jià)人類囊胚激光皺縮后行玻璃化冷凍，其較短的預(yù)平衡時(shí)間是否對(duì)臨床妊娠及新生兒結(jié)局產(chǎn)生影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年1月至2021年12月就診于?？诂旣愥t(yī)院生殖中心的501例患者518個(gè)囊胚復(fù)蘇移植周期的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<35歲；②內(nèi)膜無(wú)明顯異常；③囊胚評(píng)分3BB以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①囊胚復(fù)蘇后2h囊胚腔未擴(kuò)張者；②卵裂期胚胎和囊胚期胚胎序貫移植者。本研究進(jìn)行胚胎冷凍的原因：①預(yù)防卵巢過(guò)度刺激；②促排卵方案不適宜移植；③孕酮升高；④子宮內(nèi)膜薄或內(nèi)膜有炎癥等內(nèi)膜因素；⑤個(gè)人原因及其他。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室囊胚玻璃化冷凍技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序修訂前后的預(yù)平衡時(shí)間將其分為兩組，即9～10min為A組（269例患者278個(gè)周期）；7～8min為B組（232例患者240個(gè)周期）。本研究獲得?？诂旣愥t(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：2021-10-02）。

1.2 方法

1.2.1 囊胚準(zhǔn)備 當(dāng)有2個(gè)以上卵泡的直徑≥18mm時(shí)，當(dāng)晚肌內(nèi)注射重組人絨促性素250μg，37h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。胚胎培養(yǎng)體系：卵冠丘復(fù)合物在四孔皿授精液中培養(yǎng)并進(jìn)行受精，在培養(yǎng)箱（37℃，6% CO2，5% O2）培養(yǎng)約18h后觀察卵子受精情況并轉(zhuǎn)移到卵裂液中，每隔24h觀察并記錄胚胎發(fā)育情況。胚胎發(fā)育到第3天將胚胎轉(zhuǎn)移到囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)[13]。第5天和第6天時(shí)，按照伊斯坦布爾共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)囊胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察評(píng)估[14]。

1.2.2 激光皺縮 所有囊胚冷凍前進(jìn)行激光打孔，使擴(kuò)張囊胚皺縮。具體過(guò)程如下：采用激光破膜系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)張期囊胚行激光打孔，使用單束激光脈沖（200ms）在滋養(yǎng)層的細(xì)胞連接處（遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）發(fā)射激光進(jìn)行打孔，囊腔迅速塌陷，腔內(nèi)水分流出，見圖1。在培養(yǎng)箱中放置約10min后進(jìn)行冷凍。

1.2.3 囊胚冷凍與復(fù)蘇 采用商品化試劑盒（Kitazato，日本）進(jìn)行囊胚的玻璃化冷凍與復(fù)蘇，操作步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行。在室溫條件下，將皺縮后的囊胚置于平衡液中，9～10min或7～8min后將其轉(zhuǎn)入VS液中，最后將胚胎轉(zhuǎn)移到玻璃化冷凍載桿上（Kitazato，日本）并迅速投入液氮中保存，胚胎從轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液到投入液氮中的時(shí)間間隔不超過(guò)1min（40～60s）。復(fù)蘇時(shí)，將TS液提前預(yù)熱至37℃，從液氮中迅速取出載體浸入其中，放置1 min，然后依次轉(zhuǎn)移至復(fù)蘇液（DS液、WS1液、WS2液）放置3min、5min、5min，最后轉(zhuǎn)入含10%人血清替代品的培養(yǎng)基中，在37℃、6% CO2及5% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后觀察囊胚色澤及囊胚腔擴(kuò)張情況，囊腔部分或全部擴(kuò)張為存活，進(jìn)行移植。

1.2.4 內(nèi)膜準(zhǔn)備 根據(jù)患者自身?xiàng)l件不同，內(nèi)膜準(zhǔn)備方案分為自然周期和人工周期兩種。自然周期適用于月經(jīng)周期規(guī)律的患者，于月經(jīng)周期第10天開始B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況及內(nèi)膜厚度，綜合黃體生成素、雌二醇及孕酮水平確定排卵時(shí)間，排卵后第5天進(jìn)行胚胎移植。人工周期適用于排卵障礙、月經(jīng)不規(guī)律、自然周期內(nèi)膜發(fā)育欠佳者，從月經(jīng)周期第2～3天起口服戊酸雌二醇，根據(jù)B超監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度酌情調(diào)整戊酸雌二醇劑量，至內(nèi)膜≥8mm時(shí)肌內(nèi)注射黃體酮（40～60mg/d）轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，5d后在B超引導(dǎo)下進(jìn)行胚胎移植。所有冷凍復(fù)蘇移植周期胚胎均為優(yōu)質(zhì)囊胚。

圖1 囊胚激光皺縮示意圖

A.激光皺縮前；B.激光皺縮后

注：紅色為激光打孔位置；藍(lán)色為滋養(yǎng)層細(xì)胞；青色為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

1.3 妊娠判斷及觀察指標(biāo)

胚胎移植后常規(guī)黃體支持，第14天測(cè)定血清人絨毛膜促性腺激素，>25U/L為生化妊娠；1個(gè)月后超聲檢查示宮內(nèi)有孕囊者視為臨床妊娠。

妊娠及新生兒結(jié)局的評(píng)估：①著床：囊胚移植約5周行陰道B超檢查有無(wú)孕囊及數(shù)目。著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。②臨床妊娠：囊胚移植后14d查血人絨毛膜促性腺激素陽(yáng)性，且移植后4～6周行陰道B超可見孕囊，包括宮外孕。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。③早期流產(chǎn)：妊娠后于3個(gè)月內(nèi)終止為早期流產(chǎn)。早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。④活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。⑤多胎妊娠率=雙胎及以上妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。⑥低出生體重兒：出生體質(zhì)量<2.5kg。⑦巨大兒：出生體質(zhì)量>4kg。⑧早產(chǎn)：20～37周分娩。⑨出生缺陷：在出生時(shí)或出生后表現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)、功能或發(fā)育異常，可能是由出生前遺傳或非遺傳因素造成。⑩母體并發(fā)癥：主要包括妊娠高血壓、妊娠糖尿病、胎膜早破、前置胎盤等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較

兩組患者的年齡、移植胚胎數(shù)、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、體質(zhì)量指數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、不孕年限、原發(fā)不孕比例及內(nèi)膜方案比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見表1。

2.2 兩組胚胎凍融周期的臨床結(jié)局比較

兩組的囊胚存活率、著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率、母體并發(fā)癥比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05)，見表2。

2.3 兩組的新生兒結(jié)局比較

本研究共有新生兒366人，兩組的新生兒性別比、孕周、早產(chǎn)兒比例、出生體質(zhì)量、低出生體重兒、巨大兒、剖宮產(chǎn)、出生缺陷比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見表3。

表1 兩組患者的一般資料比較

表2 兩組胚胎凍融周期的臨床結(jié)局比較

表3 兩組的新生兒結(jié)局比較

3 討論

玻璃化冷凍保護(hù)劑對(duì)胚胎的細(xì)胞毒性影響主要由冷凍保護(hù)劑的濃度、預(yù)平衡時(shí)間和溫度等幾個(gè)關(guān)鍵因素決定[5]。本研究表明，較短的預(yù)平衡時(shí)間可達(dá)到較好的玻璃化冷凍效果，而延長(zhǎng)預(yù)平衡時(shí)間至9～10min并未顯著提高冷凍效果且降低操作效率。

日本加藤商品化玻璃化冷凍試劑建議囊胚玻璃化冷凍第一步預(yù)平衡時(shí)間為12～15min。然而，已有研究表明不必要的長(zhǎng)時(shí)間暴露于玻璃化預(yù)平衡液中可能對(duì)后期胚胎發(fā)育帶來(lái)不良影響[15-16]。早在1997年，Ishida等[16]就發(fā)現(xiàn)在玻璃化冷凍平衡液中暴露時(shí)間為5～40min不等的實(shí)驗(yàn)組小鼠胚胎在冷凍和解凍后的發(fā)育情況相似。但是，暴露5min的實(shí)驗(yàn)組小鼠的姐妹染色單體交換數(shù)量明顯減少，這表明5min是其玻璃化冷凍中最安全的平衡時(shí)間。Xiong等[11-12]研究表明，不同的預(yù)平衡時(shí)間會(huì)影響人類早期胚胎玻璃化冷凍的臨床結(jié)局，適當(dāng)延長(zhǎng)預(yù)平衡時(shí)間（9～10min）可能會(huì)改善臨床結(jié)局。然而，這幾項(xiàng)研究的對(duì)象都是卵裂期胚胎，并沒有提到預(yù)平衡時(shí)間對(duì)囊胚期胚胎玻璃化冷凍結(jié)局的影響。

近年來(lái)，隨著技術(shù)的發(fā)展，大量研究證實(shí)人工皺縮能改善囊胚玻璃化冷凍的臨床結(jié)局，但各中心人工皺縮后囊胚的冷凍預(yù)平衡時(shí)間差異較大（2～15min）[6-10]。研究人員使用冷凍環(huán)對(duì)第5天的囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍，獲得100%的復(fù)蘇存活率[7]。Levi-Setti等[8]用同樣的囊胚玻璃化冷凍方法，獲得存活率為97.5%。值得注意的是，在這兩項(xiàng)研究中，其囊胚預(yù)平衡時(shí)間均是37°C下2min。此外，Darwish等[17]報(bào)道使用Cryoleaf玻璃化冷凍第5天囊胚的存活率為97.3%，其囊胚在常溫下預(yù)平衡時(shí)間為6～10min。2011年，Zhu等[18]采用Crytop方法在室溫下對(duì)人工皺縮的囊胚進(jìn)行12～15min的預(yù)平衡，其存活率為85.7%。然而，很少有專門的研究對(duì)比皺縮后人囊胚不同的玻璃化預(yù)平衡時(shí)間對(duì)臨床結(jié)局的影響，尤其是對(duì)新生兒的影響。因每個(gè)中心的冷凍方法、冷凍保護(hù)劑類型、載體類型、患者群體、胚胎師操作水平存在差異，因此很難通過(guò)對(duì)比不同中心的數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)判不同預(yù)平衡時(shí)間對(duì)臨床結(jié)局和新生兒的影響。2010年的一項(xiàng)研究顯示，未經(jīng)人工皺縮的囊胚隨著預(yù)平衡時(shí)間的延長(zhǎng)其存活率升高，但人工皺縮后的囊胚在預(yù)平衡2、5、10、15min后的存活率無(wú)差異，建議皺縮后預(yù)平衡較短的時(shí)間[11]。本研究中人工皺縮后的囊胚復(fù)蘇存活率無(wú)顯著差異，且筆者發(fā)現(xiàn)妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局也無(wú)顯著差異。Mitsuhata等[19]研究結(jié)果表明，用未經(jīng)人工皺縮的擴(kuò)張期囊胚行玻璃化冷凍時(shí)，延長(zhǎng)預(yù)平衡時(shí)間（12～15min）能顯著改善囊胚的存活率、種植率及出生率，而新生兒結(jié)局無(wú)顯著差異。這一結(jié)果和本研究結(jié)果部分相似，之所以其延長(zhǎng)預(yù)平衡時(shí)間能顯著改善存活率、種植率及出生率，可能與未經(jīng)人工皺縮有較大關(guān)系。2021年，李翔等[20]研究結(jié)果顯示，激光皺縮可增加D5優(yōu)質(zhì)單囊胚復(fù)蘇移植周期的早期流產(chǎn)率，而本研究結(jié)果證實(shí)延長(zhǎng)預(yù)平衡時(shí)間有增加早期流產(chǎn)率的風(fēng)險(xiǎn)，這從側(cè)面反映囊胚激光皺縮后縮短冷凍預(yù)平衡時(shí)間的必要性。眾所周知，伴隨著囊胚的不斷發(fā)育，其胚胎體積不斷變大，細(xì)胞數(shù)目也逐漸增多，冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡所需的時(shí)間也隨之延長(zhǎng)。人工皺縮后的囊胚其體積塌陷縮小，囊泡液逐漸流出腔外，這樣有利于冷凍保護(hù)劑快速滲透到細(xì)胞內(nèi)，從而縮短細(xì)胞脫水時(shí)間。2018年，Kova?i?等[10]在研究人工皺縮能改善囊胚復(fù)蘇移植周期臨床結(jié)局時(shí)，曾提出一個(gè)假設(shè)，即其預(yù)平衡時(shí)間是否可縮短至10min以內(nèi)；其采用10min的玻璃化預(yù)平衡時(shí)間，獲得97.2%的復(fù)蘇存活率。本研究結(jié)果顯示，兩組預(yù)平衡時(shí)間均取得較高的復(fù)蘇存活率及較好的臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局，這進(jìn)一步證實(shí)Kova?i?等的假設(shè)。

另外，在其他物種上，研究人員也比較了不同的預(yù)平衡時(shí)間對(duì)囊胚玻璃化冷凍所帶來(lái)的影響。Kader等[15]評(píng)估玻璃化冷凍預(yù)平衡時(shí)間對(duì)小鼠囊胚DNA完整性指數(shù)的影響，該指數(shù)與胚胎的發(fā)育潛力呈正相關(guān)。結(jié)果顯示，不同的預(yù)平衡時(shí)間對(duì)擴(kuò)張期囊胚DNA完整性指數(shù)影響不同，其中8min組顯著高于4min組和15min組。玻璃化冷凍過(guò)程中較短的平衡時(shí)間（3min）相比較長(zhǎng)的平衡時(shí)間（12min）可提高牛的D7和D8擴(kuò)張囊胚的復(fù)蘇存活率和孵化率[21]。雖然這些動(dòng)物和人類的囊胚細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑的滲透速率各不相同，但實(shí)驗(yàn)表明預(yù)平衡時(shí)間是玻璃化冷凍的一個(gè)重要因素，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短的預(yù)平衡時(shí)間都將對(duì)囊胚玻璃化冷凍產(chǎn)生不利影響。

綜上所述，對(duì)于擴(kuò)張期的囊胚，激光皺縮能縮短囊胚玻璃化冷凍的預(yù)平衡時(shí)間，且其對(duì)臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局沒有顯著影響，這對(duì)臨床中提高玻璃化冷凍效率很有意義。但由于本研究規(guī)模小，還需更多數(shù)據(jù)來(lái)支持這一結(jié)論；同時(shí)是否還存在更短的玻璃化冷凍預(yù)平衡時(shí)間也需進(jìn)一步研究。

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Effect of vitrification pre-balance time of blastula on pregnancy outcome in assisted reproduction

Center for Reproductive Medicine, Haikou Mary Hospital, Haikou 570102, Hainan, China

To investigate the effect of shortening vitrification pre-balance time after laser blastocyst shrinkage on clinical pregnancy and neonatal outcomes.The clinical data of blastocyst resuscitation and transplantation in Haikou Mary Hospital from January 2018 to December 2021 were retrospectively analyzed, and 501 patients for a total of 518 transplantation cycles were screened. The blastocysts were divided into two groups according to the pre-balance time before and after the revision of the standard operating procedure of laboratory vitrification freezing technology: group A (9-10 min) or group B (7-8 min). The pregnancy outcome and neonatal outcomes were compared between the two groups.There were no significant differences in age, number of transplanted embryos, follicle-stimulating hormone, body mass index, infertility years, proportion of primary infertility, intima thickness and intima regimen between the two groups (>0.05). There were no significant differences in blastocyst survival rate, implantation rate, clinical pregnancy rate, live birth rate, early abortion rate, multiple pregnancy rate and maternal complications between the two groups (>0.05). There were no significant differences in neonatal sex ratio, gestational age, preterm birth rate, birth weight, low birth weight, macrosomia, cesarean section and birth defects between the two groups (>0.05).Shortening the vitrification pre-balance time after laser blastocyst shrinkage did not affect the pregnancy outcome of blastocyst resuscitation transplantation.

Vitrification; Blastocyst; Time; Pregnancy outcome

R321

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.19.002

（2022–12–26）

（2023–06–19）

海南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目（2101320319A2003）

張留光，電子信箱：xiaodaoivflab@163.com