不同光照條件對(duì)卷枝毛霉生長發(fā)育及類胡蘿卜素合成的影響

池 銘，孫麗娟，郝浩然，馬立杰，趙 婧，李鵬霞，4，張映曈*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，江蘇 南京 210014；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；4.江蘇省高校園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

類胡蘿卜素屬于類異戊二烯物質(zhì)，是重要的天然抗氧化劑，具有延緩衰老、調(diào)劑免疫力和預(yù)防癌癥等多種生理功能［1］。植物與化學(xué)合成是類胡蘿卜素的傳統(tǒng)來源，其生產(chǎn)效率高，受氣候、光照和地理位置的影響較小，因此，食品微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素正逐漸受到人們的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，藻類、酵母、霉菌、細(xì)菌等多種微生物均具備合成類胡蘿卜素的能力［2］。其中霉菌具有易培養(yǎng)、生長快、發(fā)酵條件易控制、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，是微生物發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的理想菌株。卷枝毛霉(Mucor circinelloides)屬于接合類霉菌，具有較強(qiáng)的類胡蘿卜素合成能力，且生長速率快，擁有清晰的遺傳背景和完善的分子操作體系，常被用作真菌類胡蘿卜素合成的模式菌株［3］。

光照作為一種重要的環(huán)境信號(hào)，對(duì)微生物的生長晝夜節(jié)律、形態(tài)發(fā)育和生理代謝過程均起到調(diào)控作用［4］。但在不同微生物中，光照的調(diào)控作用和方式存在一定的差異。例如粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的光應(yīng)答由藍(lán)光觸發(fā)，構(gòu)巢曲菌(Aspergillus nidulans)在生長過程中則響應(yīng)紅光［5］，而白光、紅光和藍(lán)光均對(duì)灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)菌絲體的生長有促進(jìn)作用［6］。在調(diào)控類胡蘿卜素合成方面，藍(lán)光、紅光以及白光能分別誘導(dǎo)三孢布拉霉(Blakeslea trispora)［7］、杜氏鹽藻(Dunaliella salina)［8］和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)［9］的類胡蘿卜素合成。采用脈沖方式［7］、提高光強(qiáng)度［8］以及延長光照時(shí)間［9］可以進(jìn)一步提高微生物的類胡蘿卜素產(chǎn)量。因此，光質(zhì)、光照強(qiáng)度和光照時(shí)間會(huì)在不同程度上影響微生物的生長發(fā)育和類胡蘿卜素合成。

迄今，有關(guān)不同光照條件對(duì)模式菌株卷枝毛霉生長發(fā)育以及類胡蘿卜素代謝影響的研究還較少。鑒于此，筆者以卷枝毛霉菌株CBS277.49為研究對(duì)象，考察了不同光質(zhì)、光強(qiáng)和光照時(shí)間對(duì)其生長及類胡蘿卜素合成的影響，明確了光照誘導(dǎo)CBS277.49產(chǎn)類胡蘿卜素的最適條件，以期為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并豐富真菌類胡蘿卜素合成光誘導(dǎo)機(jī)制的基礎(chǔ)理論知識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸硫胺（生物試劑）為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；巰基乙醇（分析純）為上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；石油醚（分析純）為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品； RNAprep pure Plant Kit提取試劑盒由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)；HiScriptIII RT SuperMix for qPCR cDNA合成試劑盒由南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

LED燈帶為歐曼有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1102）為上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀（EDC-810）為東勝國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；CFX connect熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 YPG培養(yǎng)基：10.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L瓊脂粉、3.0 g/L酵母提取物、12.5 g/L無水葡萄糖。YNB培養(yǎng)基：1.5 g/L硫酸銨、1.5 g/L谷氨酸、0.5 g/L酵母氮源、10.0 g/L無水葡萄糖、20.0 g/L瓊脂粉。高壓滅菌后添加硫胺素和煙酸，終濃度為1.0 μg/mL。

1.3.2 菌體的培養(yǎng) 使用YPG培養(yǎng)基活化卷枝毛霉CBS277.49菌株，并在光照條件下產(chǎn)孢。使用無菌水沖洗平板，得到孢子液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為×107個(gè)/mL。

接種孢子液至YNB培養(yǎng)基，在（26±2）℃下培養(yǎng)84 h。前60 h置于黑暗條件進(jìn)行培養(yǎng)，后24 h采用不同光質(zhì)（紅、綠、藍(lán)和黑光）、不同光強(qiáng)（250、500、750和1000 lx）和不同光照時(shí)間（6、12、18和24 h）進(jìn)行培養(yǎng)。定期取樣，將收獲的菌絲用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 類胡蘿卜素產(chǎn)量的測(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)法［10］測(cè)定類胡蘿卜素產(chǎn)量(μg/g)，其計(jì)算公式為：

上式中：A453為溶液在453 nm處的吸光值；D為稀釋倍數(shù)；V為提取所用石油醚體積；0.2592為消光系數(shù)；M為樣品質(zhì)量。

1.3.4 基因表達(dá)的測(cè)定 RNA提取按照RNAprep pure Plant Kit說明書指導(dǎo)完成。cDNA合成使用HiScript III RT SuperMix for qPCR cDNA合成試劑盒。以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，并采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)處理重復(fù)3次。引物序列如下：actinF，TTGAACCCCAAGTCCAACCG；actinR，TGACACCATCACCGGAATCG。carRPF，GGGTCGA TGTCGTCGCTATT；carRPR，TTGAACAGGTGGAG GATCGC。carBF，AAGCAAGCTCACCTCTGACC；carBR，CAGCATCAGGCTCCTCCAAA。mcwc1-cF，CAACGACGACGCTTACAACC；mcwc1-cR，GGCCC AATTGGATCTGTGGA。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)所有指標(biāo)進(jìn)行3次平行測(cè)定，最終結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。使用SPSS 22.0單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析，并用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對(duì)卷枝毛霉CBS277.49的影響

2.1.1 對(duì)卷枝毛霉CBS277.49菌落形態(tài)和菌絲生長的影響 由圖1A可知，黑暗條件下菌落的顏色隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而無明顯變化；培養(yǎng)24 h時(shí)藍(lán)光處理的菌落顏色呈橙黃色，紅光處理呈明黃色，綠光處理呈微黃色。表明藍(lán)光照射能夠顯著促進(jìn)卷枝毛霉CBS277.49菌落顏色的積累。

圖1 不同光質(zhì)對(duì)卷枝毛霉CBS277.49的菌落顏色（A）、生物量（B）和菌絲生長狀態(tài)（C）的影響

由圖1B可知，在培養(yǎng)期間所有處理的菌落生物量均呈逐步上升趨勢(shì)，在培養(yǎng)12 h后積累速度有所減緩；不同光質(zhì)處理對(duì)菌落的生物量均有顯著影響，在培養(yǎng)6～24 h期間3個(gè)光質(zhì)處理的菌落生物量均顯著高于黑暗條件下的，但3個(gè)光質(zhì)處理之間差異不顯著。

真菌通常與植物一樣具有向光性。使用不同光質(zhì)單束光源側(cè)方向照射24 h，結(jié)果如圖1C所示，在綠光和藍(lán)光照射下，菌絲均朝著光照的方向生長；而在紅光照射下，菌絲的生長方向毫無規(guī)律，與黑暗條件下相仿。

2.1.2 對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響 如圖2A所示，光質(zhì)處理對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量有促進(jìn)效果，3個(gè)光質(zhì)處理在培養(yǎng)6 h時(shí)的類胡蘿卜素產(chǎn)量相當(dāng)。在培養(yǎng)6～12 h期間，藍(lán)光處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量急劇上升，并在12 h時(shí)達(dá)到峰值，為黑暗對(duì)照的22.08倍；紅光與綠光處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量呈現(xiàn)小幅度上升趨勢(shì)，而黑暗對(duì)照的類胡蘿卜素產(chǎn)量無明顯變化。至24 h時(shí)，3個(gè)光質(zhì)處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量均顯著下降，但藍(lán)光處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量仍顯著高于其他2個(gè)處理和黑暗對(duì)照的，說明藍(lán)光照射可以顯著提升CBS277.49的類胡蘿卜素產(chǎn)量。

圖2 不同光質(zhì)對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產(chǎn)量和合成基因表達(dá)的影響

2.1.3 對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素合成基因表達(dá)的影響 卷枝毛霉中編碼八氫番茄紅素脫氫酶的carB基因以及編碼八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶的carRP基因負(fù)責(zé)將植物烯轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素，是類胡蘿卜素合成過程中的2個(gè)關(guān)鍵基因［11-12］。如圖2B、圖2C所示，不同光質(zhì)處理對(duì)carB和carRP的表達(dá)量有不同影響。在藍(lán)光處理下carB的表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在6 h時(shí)達(dá)到最高值，是對(duì)照的96.73倍，12 h時(shí)其表達(dá)量開始下降，至24 h時(shí)與黑暗對(duì)照相比無顯著差異。紅光和綠光處理的carB表達(dá)量在整個(gè)培養(yǎng)期間一直顯著低于藍(lán)光處理的。在藍(lán)光處理下，carRP表達(dá)量的變化趨勢(shì)與carB的相同，在6 h時(shí)到達(dá)峰值，且在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)始終顯著高于其他處理的。

2.2 不同光照強(qiáng)度對(duì)卷枝毛霉CBS277.49的影響

2.2.1 對(duì)卷枝毛霉CBS277.49菌落形態(tài)的影響 由圖3A可知，不同強(qiáng)度的藍(lán)光照射處理會(huì)影響CBS277.49的菌落顏色，其中在250 lx強(qiáng)度下培養(yǎng)24 h時(shí)菌落的顏色顯著提升，呈現(xiàn)淡黃色；在500、750和1000 lx處理下培養(yǎng)24 h菌落的顏色均呈現(xiàn)橙黃色，但在1000 lx處理下菌落外圈出現(xiàn)了白色年輪狀菌絲，說明菌絲積累胡蘿卜素的能力變差。

圖3 不同光強(qiáng)對(duì)卷枝毛霉CBS277.49的菌落顏色和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

2.2.2 對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響 從圖3B可以看出，不同強(qiáng)度的藍(lán)光處理對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量有不同影響；在培養(yǎng)0～6 h期間各處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量均呈上升趨勢(shì)，且在6 h時(shí)存在顯著差異，光強(qiáng)越強(qiáng)，類胡蘿卜素產(chǎn)量越高；在12 h時(shí)500、750和1000 lx處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量均達(dá)到峰值，分別為250 lx處理的2.90、2.94和3.25倍；在培養(yǎng)12～24 h期間500、750和1000 lx處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量均呈下降趨勢(shì)，而250 lx處理則持續(xù)上升；在24 h時(shí)，藍(lán)光1000 lx處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量為（1766.59±68.59）μg/g，顯著高于其他3個(gè)處理的。

2.2.3 對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖4A和圖4B所示，不同強(qiáng)度的藍(lán)光處理對(duì)3個(gè)基因的表達(dá)量有不同影響。250 lx處理的carB表達(dá)量在整個(gè)培養(yǎng)期間變化平緩。其他3個(gè)光強(qiáng)處理的carB表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中500 lx處理的carB表達(dá)量在培養(yǎng)12～24 h期間顯著高于250 lx處理的，但顯著低于750與1000 lx處理的（P＜0.05）。750 lx處理的carB表達(dá)量在前期顯著低于1000 lx處理的，但在24 h時(shí)顯著高于其他處理的。carRP表達(dá)量的變化趨勢(shì)與carB相似（圖4B），其中1000 lx處理的carRP表達(dá)量在6和12 h時(shí)顯著高于其他處理的（P＜0.05），但在24 h時(shí)750 lx處理的carRP表達(dá)量為所有處理中最大值。

圖4 不同光強(qiáng)對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素合成基因表達(dá)的影響

mcwc1-c基因通過編碼MCWC-1C蛋白進(jìn)行藍(lán)光的感知，正向調(diào)控類胡蘿卜素合成基因carB和carRP的表達(dá)［13］。由圖4C可知：在整個(gè)培養(yǎng)期間250 lx處理的mcwc1-c表達(dá)量較低；500和750 lx處理的mcwc1-c表達(dá)量持續(xù)上升；1000 lx處理的mcwc1-c表達(dá)量在6 h時(shí)達(dá)到最高值后逐漸下降，在培養(yǎng)結(jié)束(24 h)時(shí)，分別僅為500和750 lx處理的0.61和0.39倍。

2.3 不同光照時(shí)間對(duì)卷枝毛霉CBS277.49的影響

2.3.1 對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響 由圖5A可知：光照6 h處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量較低，在6 h時(shí)達(dá)到高峰，之后開始下降且顯著低于其他3個(gè)處理的；其余3個(gè)光照時(shí)間處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量也呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，均在12 h時(shí)達(dá)到最高值，且相互間無顯著差異；培養(yǎng)至24 h時(shí)，18和24 h處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量居前2位，且顯著高于其他2個(gè)處理的。

圖5 不同光照時(shí)間對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產(chǎn)量和基因表達(dá)的影響

2.3.2 對(duì)卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖5B～圖BD所示，所有處理的3個(gè)基因的表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；光照6 h處理的carB、carRP和mcwc1-c表達(dá)量的峰值均出現(xiàn)在6 h時(shí)，其余處理的峰值則均出現(xiàn)在12 h時(shí)；培養(yǎng)12 h后所有處理的carB、carRP和mcwc1-c表達(dá)量開始下降；在培養(yǎng)至24 h時(shí)，光照12 h處理的carB、carRP和mcwc1-c表達(dá)量最高，且顯著高于其他3個(gè)處理的。

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，光照可以顯著促進(jìn)卷枝毛霉CBS277.49的菌體生長，且該菌株具有藍(lán)/綠光趨光性，在其他真菌中也有類似發(fā)現(xiàn)［14］。此外，藍(lán)光處理加深了CBS277.49的菌體顏色，暗示其促進(jìn)了類胡蘿卜素的積累。測(cè)定發(fā)現(xiàn)藍(lán)光照射12 h后的類胡蘿卜素產(chǎn)量分別是綠光、紅光處理和黑暗對(duì)照的2.90、2.19和22.08倍；藍(lán)光處理的carB和carRP表達(dá)量在6和12 h時(shí)均顯著高于其他處理的，說明藍(lán)光通過上調(diào)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)促進(jìn)了類胡蘿卜素的合成。這與Jing等［15］在培養(yǎng)基中添加醋酸鹽促進(jìn)carB的表達(dá)，從而提升三孢布拉霉類胡蘿卜素產(chǎn)量的結(jié)果相似。

以藍(lán)光為前提篩選最適光強(qiáng)。首先通過觀察表型發(fā)現(xiàn)，250 lx藍(lán)光處理的菌落顏色較淡，其余處理的菌落均為橙黃色。進(jìn)一步測(cè)定類胡蘿卜素產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，1000 lx處理的產(chǎn)量最高，750和500 lx處理的產(chǎn)量次之，說明提高光強(qiáng)可以促進(jìn)類胡蘿卜素的積累，這可能是因?yàn)轭惡}卜素產(chǎn)量增加可以應(yīng)對(duì)強(qiáng)光照造成的細(xì)胞氧化損傷［16］。結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果顯示在培養(yǎng)前期1000 lx處理的基因表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)處理的，說明1000 lx處理通過提高carB和carRP基因的表達(dá)量促進(jìn)了類胡蘿卜素的合成。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，carB和carRP的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，這與高光照處理三孢布拉霉后類胡蘿卜素合成基因出現(xiàn)短暫高表達(dá)的結(jié)果［17］相似，推測(cè)與生物為保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而形成的一種內(nèi)在“光適應(yīng)”機(jī)制有關(guān)［18］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在1000 lx藍(lán)光處理下調(diào)控基因mcwc1-c的表達(dá)量在6 h時(shí)達(dá)到峰值，但隨著光照時(shí)間的增加，其表達(dá)量持續(xù)下降，這進(jìn)一步證實(shí)了類胡蘿卜素合成在高光強(qiáng)下的“光適應(yīng)”機(jī)制。

以藍(lán)光1000 lx為前提進(jìn)行光照時(shí)間的篩選。本結(jié)果表明：培養(yǎng)至18～24 h時(shí)，光照18和24 h處理的類胡蘿卜素產(chǎn)量居前2位，且顯著高于其他2個(gè)處理的；carB和mcwc1-c的表達(dá)量總體上以12～18 h光照處理較高，而carRP的表達(dá)量總體上以12 h光照處理較高；所有處理3個(gè)基因的表達(dá)量均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。說明長時(shí)間光照處理后基因的表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致下游光調(diào)控基因carB和carRP的表達(dá)量顯著降低。這在其他物種中也有發(fā)現(xiàn)，例如在集胞藻(Synechocysticsp.)PCC 6803中，長時(shí)間持續(xù)光照顯著抑制了葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)［19］；在糙脈孢霉中，光照2 h后wc-1基因的表達(dá)量達(dá)到峰值后顯著下降，藍(lán)光感受器WC-1蛋白的合成受到抑制，類胡蘿卜素合成受阻［20］。這些結(jié)果均表明光照時(shí)間過長可能導(dǎo)致“光適應(yīng)”，抑制下游色素的合成［21］。綜合類胡蘿卜素的產(chǎn)量以及能耗，本文最終選擇18 h作為卷枝毛霉CBS277.49的最適光照時(shí)間。

綜上所述，光照可以促進(jìn)卷枝毛霉CBS277.49的菌體生長，其中藍(lán)光可以顯著促進(jìn)類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而增加類胡蘿卜素的合成量。但是長時(shí)間、高光強(qiáng)處理會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因在短暫高表達(dá)后迅速降低，阻礙類胡蘿卜素產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。因此，光照誘導(dǎo)卷枝毛霉CBS277.49菌株產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳條件為1000 lx藍(lán)光持續(xù)照射18 h。