清熱消瘕方延緩糖尿病腎臟病大鼠腎損傷作用機制

吳巧茹,王耀獻,王奕萱,張佳樂,張 超,3,周少峰,鄭慧娟,3,崔趙麗,孫衛(wèi)衛(wèi)

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;2. 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點實驗室和北京市重點實驗室,北京 100700)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病主要的微血管病變之一,也是動脈粥樣硬化性心血管疾病的相關(guān)風(fēng)險因素［1］。目前,DKD的治療措施主要包括控制體重、血糖、血壓,使用腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑等,但這些傳統(tǒng)方法并不總能產(chǎn)生滿意療效,如何延緩DKD的進展一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的研究熱點和難點。中醫(yī)藥干預(yù)DKD有特色療效,可部分逆轉(zhuǎn)早期微量白蛋白尿。上世紀90年代國醫(yī)大師呂仁和教授針對DKD提出了“腎絡(luò)癥瘕”病機理論,王耀獻教授對此理論進行了繼承和發(fā)展,強調(diào)了熱邪在“腎絡(luò)癥瘕”發(fā)展中的重要性,并提出DKD的基本病機為“內(nèi)熱致癥”［2］。王耀獻教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗,總結(jié)出清熱消瘕方用于干預(yù)DKD早期的“瘕”階段,收獲良好臨床療效。本研究以DKD大鼠為研究對象,探討清熱消瘕方延緩DKD腎損傷的潛在機制,以期進一步闡釋“腎絡(luò)癥瘕”病機理論的科學(xué)內(nèi)涵。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠24只,6～8周齡,體重(200±30 )g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0011。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點實驗室動物實驗中心,均自由攝食并飲用純凈水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度恒定(24±2)℃,相對濕度60%～65%,12/12 h照明黑暗循環(huán)進行,室內(nèi)通風(fēng)良好。實驗過程符合北京中醫(yī)藥大學(xué)關(guān)于實驗動物管理條例,并經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理審批(倫理編號:BUCM-4-2021041304-2076)。

1.2藥物與試劑 清熱消瘕方顆粒(主要組成為生黃芪、生地、丹參、黃連、三七、降香)由北京康仁堂有限公司提供,纈沙坦膠囊(天大藥業(yè)珠海有限公司,國藥準字H20030777,規(guī)格:80 mg/粒)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥劑科提供。糖原PAS染色液(Solarbio,貨號:G1281),改良Masson三色染色液(Solarbio,貨號:G1346),抗谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)抗體(abcam,貨號:ab125066),抗溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11,又稱xCT)抗體(abcam,貨號:ab175186),兔二步法免疫組化檢測試劑盒(中杉金橋,貨號:PV-9001),DAB顯色試劑盒(中杉金橋,貨號:ZLI-9018)。

1.3分組、造模及干預(yù)方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,隨機分為假手術(shù)組、模型組、清熱消瘕方組和纈沙坦組,每組6只。各組大鼠過夜禁食12 h以上,以1%戊巴比妥鈉(40～50 mg/kg)腹腔注射麻醉后,對大鼠背部備皮,常規(guī)碘伏消毒,在左側(cè)肋骨下緣2 cm,距背部中線1 cm處縱向依次剪開皮膚和肌肉層,切口約1 cm,模型組、清熱消瘕方組和纈沙坦組充分暴露左腎,剝離左腎包膜,腎蒂部結(jié)扎后切除左腎,潔凈棉球吸干腹腔積液后關(guān)腹,逐層縫合切口(每隔0.5 cm左右一針,每針打手術(shù)結(jié)4次);假手術(shù)組開腹后直接關(guān)腹。皮層縫合完畢后使用濕潤碘伏棉球擦干血跡防止啃咬。術(shù)后1周,待所有大鼠術(shù)口完全愈合,禁食12 h以上,模型組、清熱消瘕方組和纈沙坦組大鼠單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ) 50 mg/kg(STZ臨用前溶解于0.1 mol/L、pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液,現(xiàn)用現(xiàn)配,低溫,避光,20 min內(nèi)使用),假手術(shù)組大鼠腹腔注射等體積上述緩沖液。連續(xù)3 d尾尖采血測隨機血糖,高于16.7 mmol/L視為造模成功。若血糖未達標,1周后復(fù)測血糖,仍不達標再次予STZ 50 mg/kg腹腔注射。造模成功后第2天起,清熱消瘕方組給予清熱消瘕方顆粒劑10.2 g/(kg·d)灌胃,纈沙坦組給予纈沙坦8 mg/(kg·d)灌胃,假手術(shù)組及模型組給予等量蒸餾水灌胃,灌胃劑量根據(jù)體表面積折算,每公斤體重約為人臨床用量的6.3倍,各組均連續(xù)灌胃16周。

1.4取材方法 灌胃16周后,代謝籠收集大鼠24 h尿液樣本,以4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,收集上層樣本分裝,-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。大鼠過夜禁食12 h以上,稱重后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血,分別裝于含有促凝劑和EDTAK3的采血管中,以4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,收集上層血清分裝,-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｍ暾粝掠覀?cè)腎臟,剝離包膜,稱重。分離腎皮質(zhì),部分迅速放入凍存管投入液氮中,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存;剩余部分加入4%多聚甲醛溶液于4 ℃冰箱中固定24 h以上,全自動脫水機脫水后進行石蠟包埋,切成4 μm厚度切片備用。

1.5檢測指標及方法

1.5.1一般情況 每周測量大鼠體重,觀察記錄各組大鼠精神狀態(tài)、活動情況、毛色、飲食飲水情況、尿量等。

1.5.2體重及腎重體重比 比較各組大鼠灌胃16周后體重及腎重體重比［腎重(mg)/體重(g)］。

1.5.3腎功能指標、血糖及血脂指標 24 h尿蛋白總量、血尿素氮、血肌酐、血糖及血清總膽固醇、三酰甘油水平均由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗科使用全自動生化分析儀(Beckman Coulter AU5800)進行檢測。

1.5.4腎臟組織病理形態(tài)

1.5.4.1HE染色 ①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水:60 ℃烤片1 h,二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分別脫蠟10 min,100%,100%,95%,90%,80%,70%梯度乙醇水化各3 min,自來水洗5 min;②蘇木素染核10 min,自來水沖洗多余染液,1%鹽酸乙醇分化15 s,自來水洗滌返藍10 min;③伊紅染細胞質(zhì):1%伊紅染液染色15 min,自來水沖洗1 min;④梯度乙醇上行脫水:70%,80%,90%,95%,100%,100%梯度乙醇上行脫水,各1 min;⑤透明、封片:二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分別透明10 min,中性樹膠封片。

1.5.4.2PAS染色 ①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水同前,滴加1%過碘酸溶液反應(yīng)8～10 min,流水沖洗3 min,蒸餾水浸洗2次,每次3 min;②Schiff染液陰暗處浸染1 h,流水沖洗10 min;③蘇木素染核同前;④梯度乙醇上行脫水、透明、封片同前。

1.5.4.3Masson染色 ①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水同前,60 ℃煤染液浸染1 h,流水沖洗10 min;②天青石藍染液滴染2～3 min,水洗2次,每次10～15 s;③蘇木素染核3 min,自來水沖洗多余染液,鹽酸乙醇分化至組織完全變紅,水洗終止分化,流水沖洗10 min;④麗春紅染液滴染12 min,弱酸溶液沖洗2次,每次10～15 s;⑤磷鉬酸溶液處理15～20 min,鏡下觀察血管周圍膠原亮紅色褪至淡紅色或無色為止;⑥苯胺藍染液滴染5 min,弱酸溶液洗滌并覆蓋靜置2 min;⑦梯度乙醇上行脫水、透明、封片同前。使用Image J 1.8.0軟件對病理圖片進行半定量分析,計算藍染面積即纖維化面積占比。

1.5.5腎臟組織中GPX4、xCT表達情況 免疫組化染色觀察:①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水同前,PBS浸洗3次,每次5 min;②水浴鍋預(yù)熱檸檬酸鹽修復(fù)液(pH 6.0)至95 ℃以上,切片浸入修復(fù)液修復(fù)20 min,自然恢復(fù)至室溫,PBS浸洗3次,每次5 min;③滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑50 μL,避光孵育20 min,PBS浸洗3次,每次5 min;④擦干組織周圍液體,組化筆圍繞組織畫圈;⑤一抗孵育組織(rabbit anti-GPX4抗體1∶250,rabbit anti-xCT抗體1∶50,稀釋濃度根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇),置于濕盒4 ℃過夜;⑥次日,室溫放置1 h,PBS浸洗6次,每次5 min;⑦滴加反應(yīng)增強液100 μL,37 ℃孵育20 min,PBS浸洗3次,每次5 min;⑧滴加二抗孵育組織,37 ℃孵育20 min,PBS浸洗3次,每次5 min;⑨DAB顯色,鏡下觀察并記錄顯色時間,保證各指標不同組別切片顯色時間一致,水洗終止顯色;⑩蘇木素核染5 s,自來水沖洗多余染液,鹽酸乙醇分化15 s,流水沖洗10 min返藍;梯度乙醇上行脫水、透明、封片同前。使用Image J 1.8.0軟件對病理圖片進行半定量分析,計算GPX4、xCT陽性表達面積占比。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。首先檢測樣本的正態(tài)性,計量資料符合正態(tài)分布及方差齊性,組間兩兩比較采用Student’st檢驗,多組間比較使用單因素方差分析;非正態(tài)分布或方差不齊組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗,多組間比較使用Kruskal-WallisH檢驗。檢驗水平α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況比較 假手術(shù)組大鼠狀態(tài)良好,活動自如,反應(yīng)敏捷,毛色光亮;模型組大鼠精神欠佳,活動減少,反應(yīng)遲緩,明顯消瘦,毛色蠟黃且無光澤,飲水、飲食、尿量較假手術(shù)組明顯增多;與模型組比較,清熱消瘕方組及纈沙坦組大鼠整體情況略好。

2.2各組大鼠體重、腎重體重比比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠體重明顯降低(P<0.05),腎重體重比明顯增高(P<0.05)。與模型組比較,清熱消瘕方組大鼠腎重體重比明顯降低(P<0.05),體重變化不明顯(P>0.05);纈沙坦組大鼠體重明顯升高(P<0.05),腎重體重比變化不明顯(P>0.05)。 見表1。

表1 假手術(shù)組和糖尿病腎臟病各組大鼠體重及腎重體重比比較

2.3各組大鼠腎功能指標比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠24 h尿蛋白總量和血尿素氮水平均明顯升高(P均<0.05),血肌酐水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,清熱消瘕方組大鼠24 h尿蛋白總量和血尿素氮水平均明顯降低(P均<0.05),血肌酐水平明顯升高(P<0.05);纈沙坦組大鼠24 h尿蛋白總量明顯降低(P<0.05),血肌酐水平明顯升高(P<0.05),血尿素氮水平降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和糖尿病腎臟病各組大鼠腎功能指標比較

2.4各組大鼠糖脂代謝指標比較 模型組、清熱消瘕方組和纈沙坦組大鼠在整個實驗期間血糖均維持在16.7 mmol/L以上。灌胃16周后,模型組大鼠血糖及血膽固醇、三酰甘油水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05);清熱消瘕方組大鼠血膽固醇水平和纈沙坦組大鼠三酰甘油水平均明顯低于模型組(P均<0.05),清熱消瘕方組和纈沙坦組其余指標與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 假手術(shù)組和糖尿病腎臟病各組大鼠糖脂代謝指標比較

2.5各組大鼠腎臟病理形態(tài)比較 HE染色:假手術(shù)組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整,小管致密;模型組大鼠腎小球體積增大,腎小管上皮細胞廣泛空泡變性壞死,小管上皮細胞大面積損傷脫落;與模型組比較,清熱消瘕方組、纈沙坦組大鼠腎小球體積稍有恢復(fù),腎小管損傷明顯改善。PAS染色:假手術(shù)組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整,無明顯系膜基質(zhì)增生;模型組大鼠腎小球體積增大,系膜區(qū)明顯增寬、系膜基質(zhì)廣泛增生,腎小球硬化明顯;與模型組比較,清熱消瘕方組、纈沙坦組大鼠腎小球體積稍有恢復(fù),系膜基質(zhì)增生明顯減少,散發(fā)K-W結(jié)節(jié)形成。Masson染色:假手術(shù)組大鼠腎間質(zhì)未見明顯膠原物質(zhì)沉積,纖維化面積占比為(2.26±1.00)%;模型組大鼠腎間質(zhì)存在大量膠原物質(zhì)沉積,纖維化改變明顯,纖維化面積占比為(13.23±4.23)%,明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);與模型組比較,清熱消瘕方組、纈沙坦組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度有所緩解,纖維化面積占比分別為(5.56±1.13)%和(6.34±1.43)%,均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和糖尿病腎臟病各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)

2.6各組大鼠腎臟組織中GPX4、xCT陽性表達情況比較 GPX4、xCT在腎小球、腎小管均有表達,腎小管表達更為明顯;模型組GPX4、xCT陽性表達較假手術(shù)組少,二者陽性表達面積占比均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05);清熱消瘕方組、纈沙坦組GPX4、xCT陽性表達較模型組多,二者陽性表達面積占比均明顯高于模型組(P均<0.05)。見圖2及表4。

圖2 假手術(shù)組和糖尿病腎臟病各組大鼠腎臟組織中GPX4、xCT陽性表達情況(免疫組化染色)

表4 假手術(shù)組和糖尿病腎臟病各組大鼠腎臟組織中GPX4、xCT陽性表達面積占比比較

3 討 論

DKD已成為全球終末期腎臟病(end-stage renal disease, ESRD)的主要病因［3］,據(jù)報道,2017年全球有6.975億ESRD患者,其中中國和印度的患者占將近1/3［4］?？梢?DKD是一項嚴峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn),并可能造成巨大的社會和經(jīng)濟負擔。DKD的發(fā)病機制復(fù)雜,至今尚未完全闡明。糖脂代謝紊亂、腎臟血流動力學(xué)改變、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增強、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等均與DKD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［5］。中醫(yī)藥干預(yù)DKD有一定療效,調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、抗纖維化、抗氧化等已被證實為中醫(yī)藥治療DKD的重要機制［6］。

腎纖維化是DKD終末期不可逆的病理改變,王耀獻教授指出,腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化均是腎絡(luò)癥瘕的客觀表現(xiàn)。腎絡(luò)癥瘕的形成可細化為三態(tài)［7］,在“聚散消長態(tài)”中,機體正氣有所虧損,但尚有抗邪能力,此時痰、瘀、濁、毒等病理產(chǎn)物的形成與消散處于動態(tài)變化過程,治療的得宜決定著疾病的轉(zhuǎn)歸。正如DKD早期,機體腎氣仍充,邪熱未盛,邪氣未傷及腎絡(luò),此時腎臟處于高濾過、高灌注狀態(tài),臨床上可見微量白蛋白尿等,若治療得當,白蛋白尿可以部分甚至完全逆轉(zhuǎn);若邪熱不解,蓄積加重,熏灼腎臟,致腎關(guān)開多合少,精微物質(zhì)從小便漏出,蛋白尿進一步加重。隨著病情進展,邪熱依附于有形實邪,固定不移,導(dǎo)致腎絡(luò)癥瘕正式形成,腎臟出現(xiàn)不可逆的損傷。清熱消瘕方是針對DKD早期的“瘕”階段病機特點而設(shè),此期虛實夾雜,既有氣陰兩虛,又有血熱血瘀,兼氣郁熱郁,治宜益氣養(yǎng)陰、涼血化瘀、理氣透熱散瘕。故用生黃芪益氣養(yǎng)陰,生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津,丹參涼血活血、祛瘀通絡(luò),黃連清除氣分郁熱,降香理氣化瘀,三七活血散瘀,降香、三七偏溫,避免全方過涼克伐脾土而損傷正氣。清熱消瘕方中多種藥物的有效成分已被證實可緩解DKD腎損傷,其中黃芪的重要活性成分黃芪甲苷可通過緩解氧化應(yīng)激、延緩腎纖維化、抗細胞凋亡和抗炎等延緩DKD的進展［8］;地黃中的地黃多糖能有效減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的高血糖、高血脂、微血管炎癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)［9］;丹參中的丹參多酚酸鹽可阻斷高糖環(huán)境下超氧化物的生成,從而抑制足細胞凋亡［10］。

本實驗以單側(cè)腎切除術(shù)聯(lián)合STZ單次腹腔注射二聯(lián)法構(gòu)建DKD大鼠模型,在整個干預(yù)期間大鼠血糖水平均維持在16.7 mmol/L以上,隨后的尿蛋白檢測及病理觀察結(jié)果均表明DKD模型構(gòu)建成功。在缺乏病理學(xué)診斷的情況下,持續(xù)性蛋白尿是全球公認的DKD主要診斷標準［11］。本實驗中,模型組大鼠24 h尿蛋白總量明顯高于假手術(shù)組,大鼠腎臟腎小球體積增大,系膜區(qū)明顯增寬、系膜基質(zhì)廣泛增生,腎小管上皮細胞廣泛空泡變性壞死,小管上皮細胞大面積損傷脫落,腎間質(zhì)存在大量膠原物質(zhì)沉積,纖維化改變明顯;清熱消瘕方干預(yù)可降低24 h尿蛋白總量,可一定程度上緩解上述損傷。值得注意的是,模型組大鼠血尿素氮水平明顯高于假手術(shù)組,而血肌酐水平明顯低于假手術(shù)組;清熱消瘕方干預(yù)可明顯降低血尿素氮水平,升高血肌酐水平。肌酐是骨骼肌中磷酸肌酸的唯一代謝產(chǎn)物,與機體骨骼肌總量相關(guān)［12］。血肌酐不僅會隨著腎小球濾過率的變化而變化,也會隨著肌肉總量的變化而變化［13］。有研究發(fā)現(xiàn),低血肌酐水平可以增加2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險［14］,這可能與肌肉含量減少相關(guān)的胰島素抵抗有關(guān)［12］。故推測模型組大鼠血肌酐水平降低可能與大鼠體重低、肌肉含量低有關(guān);清熱消瘕方干預(yù)上調(diào)了血肌酐水平,可能與其延緩肌肉總量下降和改善胰島素抵抗有關(guān)。

鐵死亡是一種區(qū)別于細胞凋亡、壞死、焦亡、自噬等的細胞程序性死亡方式,與鐵(Fe2+)介導(dǎo)、活性氧誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)［15］,可能由氧化應(yīng)激和抗氧化系統(tǒng)之間的失衡驅(qū)動［16］。近年越來越多的研究表明,鐵死亡可能在糖尿病及其并發(fā)癥(如DKD、糖尿病心肌病、糖尿病心肌缺血再灌注損傷和動脈粥樣硬化等)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用［17］。調(diào)控鐵死亡可以有效減輕高糖環(huán)境中的足細胞損傷［18］,抑制鐵死亡可以減輕腎間質(zhì)纖維化和炎癥細胞聚集［19］,鐵死亡可能是DKD治療的新方向。system xc-谷胱甘肽-GPX4軸是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控通路,Kim等［20］研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者的腎活檢標本中GPX4和xCT的mRNA表達水平下降。本實驗中,模型組大鼠腎組織中GPX4、xCT陽性表達較假手術(shù)組少,清熱消瘕方干預(yù)可上調(diào)GPX4、xCT表達,提示清熱消瘕方可能通過調(diào)控鐵死亡延緩DKD的進展。

綜上所述,“腎絡(luò)癥瘕”病機指導(dǎo)下的清熱消瘕方可有效緩解DKD腎損傷和上調(diào)腎臟中GPX4、xCT表達,該方可能通過調(diào)控鐵死亡延緩DKD的進展,其確切機制及相關(guān)靶點仍需進一步體內(nèi)外實驗以驗證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。