新疆牛羊源金黃色葡萄球菌D353質(zhì)粒pD353序列分析

賀騰飛,劉英玉,張柳青,陳 旺,李澤亞,胡 蕓,蔣金豆,祖力胡馬爾·艾力

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】質(zhì)粒是染色體外的遺傳物質(zhì),攜帶遺傳信息,并能夠通過接合的方式有效進(jìn)行遺傳信息的水平轉(zhuǎn)移,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)能力[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)及耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(Vancomycin resistantStaphylococcusaureus,VRSA)的出現(xiàn)是有危害的。在當(dāng)前具有感染性的金黃色葡萄球菌菌株中,抗生素的耐藥性通常是由質(zhì)粒編碼的,這些質(zhì)?？梢酝ㄟ^水平DNA轉(zhuǎn)移機(jī)制在菌株之間傳播。臨床分離的金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci,CNS)通常攜帶一個(gè)或多個(gè)耐藥質(zhì)粒,這些質(zhì)粒是基因轉(zhuǎn)移的重要載體,有助于葡萄球菌耐藥關(guān)鍵基因的獲得、維持和傳播。金黃色葡萄球菌D353對(duì)苯唑西林、萬古霉素、紅霉素、克拉霉素和諾氟沙星等12種抗生素耐藥,類似這種耐多重抗生素菌株的出現(xiàn)和水平傳播增加了人類治療人畜共患疾病的困難,深入研究金黃色葡萄球菌質(zhì)粒的復(fù)制方式、攜帶耐藥基因及結(jié)構(gòu)特點(diǎn),對(duì)于揭示金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制、監(jiān)測(cè)金黃色葡萄球菌的流行性并干預(yù)其質(zhì)粒傳播具有重要意義[2-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】常見的有小滾圈復(fù)制的葡萄球菌質(zhì)粒(1-5 kb),其生物學(xué)特性已經(jīng)被詳細(xì)分析,但除了它們攜帶抗性基因外,Theta復(fù)制質(zhì)粒也攜帶抗性基因且片段較大,但對(duì)這種質(zhì)粒的關(guān)注相對(duì)較少。目前已在葡萄球菌中識(shí)別出三類Theta復(fù)制質(zhì)粒,即pSK639家族、多耐藥質(zhì)粒(重金屬/β-內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒和pSK1家族)和接合多耐藥質(zhì)粒(pSK41家族)[5]。了解質(zhì)粒復(fù)制的詳細(xì)分子機(jī)制可能會(huì)發(fā)現(xiàn)用于逆轉(zhuǎn)或減緩耐藥性發(fā)展的新方法[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期研究中,發(fā)現(xiàn)新疆牛羊源的金黃色葡萄球菌存在大量的耐藥菌株和一些MRSA菌株[7],其中D353菌株對(duì)于苯唑西林、諾氟沙星、克拉霉素、紅霉素和萬古霉素等12種抗生素耐藥。分析金黃色葡萄球菌耐甲氧西林菌株和耐萬古霉素菌株的野生型質(zhì)粒序列特征?！緮M解決的關(guān)鍵問題】提取耐藥菌株質(zhì)粒并測(cè)序,分析質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和同源性,解釋質(zhì)粒復(fù)制轉(zhuǎn)移能力和自身特性,對(duì)新疆牛羊源金黃色葡萄球菌質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

金黃色葡萄球菌D353[7],來源于新疆庫爾勒牛羊肉農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的工具拭子,樣品獲取時(shí)間為2018年10月,菌液與60%甘油1∶ 1,-20℃保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室。

質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN公司);溶菌酶(Solarbio公司);7.5% NaCl 肉湯(青島海博生物技術(shù)公司);Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)(青島海博生物技術(shù)公司);10×Loading Buffer(TaKaRa公司);1 kb Ladder(康為世紀(jì)公司)。

生物安全柜(美國(guó)LABCONCO公司);高速離心機(jī)D2012 plus(SCILOGEX公司);恒溫振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);微量分光光度計(jì)SMA4000(Merinton 儀器公司);梯度PCR儀(美國(guó)伯樂公司)。

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存的金黃色葡萄球菌D353和7.5% NaCl 肉湯液體培養(yǎng)基按照1∶ 9混合,放入恒溫振蕩器,150 r/min 培養(yǎng)18 h ,劃線接種 Baird-Parker 平板,放入電熱恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株16S rRNA鑒定

取1 mL菌液提取基因組DNA,16S rRNA的擴(kuò)增引物序列為F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,R:ACGGCTACCTTGTTACGACTT,擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán),72℃再延伸5 min,4℃保存,將PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測(cè)序,鑒定菌株類別。

1.2.3 質(zhì)粒提取

按照質(zhì)粒提取試劑盒方法提取質(zhì)粒,取1～5 mL菌液離心,去上清,先用溶菌酶100 mg/mL,37℃,20 min恒溫處理菌體,按照試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

1.2.4 質(zhì)粒濃度

用微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的質(zhì)粒原液濃度,獲得質(zhì)粒濃度。

1.2.5 質(zhì)粒測(cè)序與組裝

將提取的質(zhì)粒送至西安擎科生物技術(shù)公司測(cè)序,采用Miseq測(cè)序法,之后利用 plasmidid(version 1.6.5)進(jìn)行組裝。

1.2.6 生物信息學(xué)

利用NCBI網(wǎng)站上的ORF Finder尋找質(zhì)粒的開放閱讀框(open reading frame,ORF)以及BLAST進(jìn)行初步注釋,利用Snap Gene(version 4.2.4)制作質(zhì)粒圖譜,使用MEGA 11軟件制作16s rRNA序列和質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白repB的Neighbor-Joining進(jìn)化樹,并利用Mauve軟件進(jìn)一步分析幾株質(zhì)粒間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株16S rRNA鑒定結(jié)果

研究表明,以葡萄球菌屬S91和表皮葡萄球菌SW-7/FSE的16S rRNA基因?yàn)閰⒄?建立ML樹。分析可知,D353與金黃色葡萄球菌 NRLFFD288以及 B0021-01R親緣關(guān)系較近,且與金黃色葡萄球菌DFI-23聚為一支。確定菌株D353為金黃色葡萄球菌。圖1

圖1 質(zhì)粒pD353 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 質(zhì)粒濃度和序列

研究表明,利用微量分光光度計(jì)測(cè)定pD353濃度為40.29 ng/μL,將pD353測(cè)序拼接序列上傳NCBI的Gene Bank數(shù)據(jù)庫,序列號(hào)為NZ_CP080004,利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST分析,其中質(zhì)粒pSaD592、pIT1-S和pIT4-R與pD353同屬于金黃色葡萄球菌質(zhì)粒,而質(zhì)粒pfas4-2和pSF2來自于海氏腸球菌和糞腸球菌。

質(zhì)粒pD353長(zhǎng)度34063 bp,其(G+C)mol含量為30.42%。pD353質(zhì)粒有47個(gè)超過200個(gè)核苷酸的ORF。ORF110編碼314 aa的復(fù)制蛋白repA,repA含有復(fù)制起始蛋白A的N端結(jié)構(gòu)域?qū)儆诔易錭l21459和復(fù)制起始蛋白A的C 端結(jié)構(gòu)域是超家族cl39431。ORF139編碼286 aa的復(fù)制蛋白repB屬于COG5527超家族結(jié)構(gòu)域。ORF41編碼一個(gè)類似于IS21元件的ISBmu3家族轉(zhuǎn)座酶istA基因,ORF13編碼一個(gè)類似于IS21元件的 IS5376 家族輔助ATPaseistB基因。在pD353發(fā)現(xiàn)了5種轉(zhuǎn)座酶,分別是IS3家族轉(zhuǎn)座酶、類IS6 ISSau6家族轉(zhuǎn)座酶、IS21家族轉(zhuǎn)座酶、IS30家族轉(zhuǎn)座酶和IS1182家族轉(zhuǎn)座酶。圖2

圖2 pD353質(zhì)粒圈

2.3 質(zhì)粒進(jìn)化同源

研究表明,pD353與金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pIT1-S和pIT4-R結(jié)構(gòu)組成基本相同,都僅有一個(gè)模塊發(fā)生逆轉(zhuǎn)。與海氏腸球菌質(zhì)粒pfas4-2和糞腸球菌質(zhì)粒pSF2都有3個(gè)相似模塊,但也有未配對(duì)序列無相似性,所以質(zhì)粒pD353與此兩株質(zhì)粒親緣相對(duì)較近。而與金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pSaD592相比,雖然兩株質(zhì)粒都來自于金黃色葡萄球菌,但兩株質(zhì)粒含有很多的不同模塊,兩株質(zhì)粒親緣較遠(yuǎn),差異較大。pD353與pIT1-S和pIT4-R可能共同起源于海氏腸球菌和糞腸球菌質(zhì)粒,由于pD353與pIT1-S和pIT4-R有更近的親緣關(guān)系,pD353由意大利人源金黃色葡萄球菌質(zhì)粒進(jìn)化而來。圖3

A pD353與pIT1-S,pIT4-R的親緣關(guān)系比對(duì)

B pD353與pfas4-2的親緣關(guān)系比對(duì)

C pD353與pSF2的親緣關(guān)系比對(duì)

D pD353與pSaD592的親緣關(guān)系比對(duì)

2.4 質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)

研究表明,pD353質(zhì)粒的repB與pN315質(zhì)粒的rep蛋白屬于同種蛋白,兩者都與質(zhì)粒pSK639近源,預(yù)測(cè)質(zhì)粒pD353和pN315同屬于pSK639家族質(zhì)粒,采用Theta型復(fù)制。圖4

圖4 質(zhì)粒pD353 repB 系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 質(zhì)粒pD353復(fù)制起點(diǎn)

2.5 重金屬相關(guān)基因

研究表明,pD353上含有5種的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。其中在22 088～24 268 bp的ORF49編碼鎘轉(zhuǎn)運(yùn) ATP 酶cadA與已上傳的金黃色葡萄球菌MRSA252菌株染色體的cadA基因相似率為99.9%。17 780～19 069 bp的ORF100編碼亞砷酸鹽外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膜亞基arsB基因,19 383～19 069 bp的ORF131編碼一個(gè)As(III) 感應(yīng)金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄阻遏物arsR基因,這2個(gè)基因與已上傳的金黃色葡萄球菌UP322染色體的arsB和arsR基因的相似率為100%。26 344～27 777 bp的ORF120編碼一個(gè)多銅氧化酶mco基因,與已上傳的金黃色葡萄球菌ATCC 12 600染色體的mco基因相似率為99.79%。27 792～29 921 bp的ORF150編碼一個(gè)銅/銀轉(zhuǎn)運(yùn) P 型 ATP 酶copB基因,與已上傳的金黃色葡萄球菌S3染色體的copB相似率為100%。

3 討 論

小于10 kb的質(zhì)粒使用RC機(jī)制,大于14.5 kb的質(zhì)粒使用Theta模式復(fù)制,中等10至14.5 kb大小范圍內(nèi)的質(zhì)粒使用這2個(gè)機(jī)制中的任一種[6]。近年來,金黃色葡萄球菌的耐藥性日益嚴(yán)重[8,9],試驗(yàn)通過16S rRNA基因引物[10,11]確定D353為金黃色葡萄球菌之后,提取D353質(zhì)粒測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析,在序列上研究發(fā)現(xiàn)了大量的酶切位點(diǎn)及豐富的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,將測(cè)得的質(zhì)粒pD353歸類于重金屬質(zhì)粒。類似的重金屬質(zhì)粒也被白鳳嵐的牦牛源MASR菌株和張赫的黃河污泥源的金黃色葡萄球菌報(bào)道[12, 13]。20世紀(jì)60年代和70年代的金黃色葡萄球菌菌株通常含有對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素和重金屬或其他無機(jī)離子產(chǎn)生抗藥性的質(zhì)粒[14]。大量的重金屬抗性基因能夠幫助細(xì)菌更好的適應(yīng)惡劣的環(huán)境[15]。序列共線性分析結(jié)果表明,測(cè)得的質(zhì)粒pD353與海氏腸球菌和糞腸球菌質(zhì)粒存在一定的序列同源性,溯源分析發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pD353與意大利金黃色葡萄球菌質(zhì)粒[16]的起源相同。通過對(duì)質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白repB的研究,了解到該質(zhì)粒與pSK639家族質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白同源[17-23],質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)普遍具有3個(gè)特點(diǎn):支持質(zhì)粒自主復(fù)制的最小的順式作用元件;前導(dǎo)鏈合成的起始位置;打開 DNA 雙鏈,啟動(dòng)復(fù)制機(jī)制的區(qū)域[24,25]。Theta型復(fù)制質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)還包括 AT 豐富區(qū)和 Rep 蛋白結(jié)合位點(diǎn),后者含有相鄰或是被插入序列間隔的串聯(lián)重復(fù)序列[26],所以串聯(lián)重復(fù)序列是復(fù)制的活性起始點(diǎn)所必需的[27],分析復(fù)制起始蛋白上游的串聯(lián)重復(fù)序列,判斷出質(zhì)粒pD353為重金屬Theta型復(fù)制質(zhì)粒。

序列的基因分析發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pD353上存在一定數(shù)量的轉(zhuǎn)座酶和插入序列,其中包括IS3家族轉(zhuǎn)座酶、類IS6 ISSau6家族轉(zhuǎn)座酶、IS21家族轉(zhuǎn)座酶、IS30家族轉(zhuǎn)座酶和IS1182家族轉(zhuǎn)座酶。介導(dǎo)DNA細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)的插入序列和轉(zhuǎn)座子,以及促進(jìn)細(xì)胞間DNA移動(dòng)的質(zhì)粒、噬菌體和整合接合元件之間的相互作用[28]。這些序列元件促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的基因遷移,使得基因水平之間的交換成為可能[19],并且還被發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和基因組重排方面發(fā)揮著額外的作用[29],但其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

串聯(lián)重復(fù)序列對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)的調(diào)控具有重要意義,例如質(zhì)粒R6K的復(fù)制起點(diǎn)γ中移除7個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列中的1個(gè),對(duì)復(fù)制并無影響,但是當(dāng)刪除2個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列會(huì)降低DNA的復(fù)制效率,刪除3個(gè)或以上就會(huì)停止質(zhì)粒的復(fù)制,這似乎使得阻斷耐藥質(zhì)粒的傳播獲得了可能,分析金黃色葡萄球菌質(zhì)粒的rep蛋白復(fù)制方式,具有一定的指導(dǎo)意義。

4 結(jié) 論

質(zhì)粒pD353與Genebank庫中的意大利人源金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pIT1-S,pIT4-R有較少的模塊逆轉(zhuǎn),具有非常近的親緣關(guān)系。pD353的repB與pSK639的repB近源,trf串聯(lián)重復(fù)序列發(fā)現(xiàn)pD353的repB序列前存在Theta型復(fù)制結(jié)構(gòu)的LTR和sTR,由此鑒定質(zhì)粒pD353為Theta型復(fù)制pSK639家族質(zhì)粒,富含3種復(fù)制起始蛋白和豐富的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。未在該質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)任何的抗生素抗性基因,但該質(zhì)粒特殊的Theta型復(fù)制結(jié)構(gòu)對(duì)于阻斷基因遷移具有較高的研究?jī)r(jià)值。