油莎豆水溶性糖提取工藝及生物轉(zhuǎn)化低聚果糖的研究

李晨飛, 閆曉俠, 董舒月, 刁夢雪, 盧笑雨, 于亞莉, 張鐵華

(吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,長春 130062)

油莎豆(Cyperusesculeutus,CE)作為綠色健康的多用途經(jīng)濟(jì)型油料作物,我國農(nóng)戶對其種植熱情逐年高漲,油莎豆成為一種新型待開發(fā)食品原料[1-3]。隨著油莎豆油的不斷開發(fā)提取,大量的脫脂殘留物副產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。目前,副產(chǎn)品主要用于動物飼料或直接被丟棄,是一種資源浪費(fèi)和環(huán)境污染現(xiàn)象[4,5]。油莎豆碳水化合物含量豐富,陳星等[6]分析油莎豆成分,其中糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.35%,Svitlana等[7]研究發(fā)現(xiàn)油莎豆塊莖中碳水化合物只有蔗糖。

低聚果糖由于其雙歧特性以及生物功能特性已被歸類為益生元,是一種由酶促過程產(chǎn)生的低聚糖混合物[8,9]。低聚果糖按其結(jié)構(gòu)可分為葡萄糖-果糖(GFn)型和果糖-果糖(Fn)型[10]。一般來說,Fn型FOSs主要是通過內(nèi)切菊粉酶水解菊粉得到,而GFn型FOSs可以通過β-呋喃果糖苷酶或果糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)果糖基化反應(yīng),以蔗糖為底物得到[11]。果糖基轉(zhuǎn)移酶催化果?；蛘崽欠肿踊虻途酃寝D(zhuǎn)移,果?；溨饾u增長[12]。使用純蔗糖作為底物來生產(chǎn)低聚果糖,對于牲畜飼料的應(yīng)用,使用低成本的蔗糖源更為經(jīng)濟(jì)[11]。Khatun等[11]利用新型普魯蘭短梗霉從蔗糖和糖蜜中高效生產(chǎn)低聚果糖。Sheila等[13]從一種新的天然原料甜菊廢渣中提取菊粉和低聚果糖。低聚果糖由于其較低甜度、低致癌性、低熱量值、低血糖指數(shù)和促進(jìn)雙歧桿菌增殖的營養(yǎng)和健康相關(guān)特性,越來越多地被食品工業(yè)使用[14]。李瑤等[15]通過建立小鼠肥胖模型,并進(jìn)行低聚果糖干預(yù),結(jié)果顯示低聚果糖可以一定程度上預(yù)防和控制肥胖。

超聲波輔助提取技術(shù)基于其“空化效應(yīng)”促進(jìn)可溶性成分溶出[16],主要是通過提高現(xiàn)有過程的反應(yīng)速度或引發(fā)新的反應(yīng)[17]。膜分離技術(shù)是一種新型純化技術(shù),具備環(huán)境友好、分離效率高、成本低、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),是純化多糖的理想選擇[18,19]。

研究利用油莎豆粕中豐富的蔗糖為原料合成益生元低聚果糖,將油莎豆脫脂后副產(chǎn)物開發(fā)利用創(chuàng)新得到了高價值低聚糖,為油莎豆粕的開發(fā)利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎豆粕、果糖基轉(zhuǎn)移酶(5 000 U/mL)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型);其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機(jī),超聲波破碎儀,SYWF-50水浴恒溫振蕩器,AvantiJ-E離心機(jī),隔膜真空泵、微孔過濾膜(水系),Vivaflow 200即用型切向流膜包,BioTek Synergy HT多功能酶標(biāo)儀,DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,冷凍干燥機(jī),S6000型高效液相色譜儀,ELSD-UM5800蒸發(fā)光散射檢測器。

1.3 方法

1.3.1 水溶性糖制備工藝流程

將油莎豆粕粉碎,加入10倍質(zhì)量冷水,超聲,水浴恒溫浸提得到油莎豆粕水溶性糖。

1.3.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取高速粉碎后的油莎豆粕粉末1 g,設(shè)定料液比1∶10,搖床速度100 r/min為固定條件,提取時間為1 h,提取溫度為70 ℃,分別研究超聲時間(0～30 min)對水溶性糖提取率的影響。設(shè)定超聲時間為10 min,提取溫度為70 ℃,分別研究提取時間(1～6 h)對水溶性糖提取率的影響。設(shè)定超聲時間為10 min,提取時間為3 h,研究提取溫度(40～90 ℃)對水溶性糖提取率的影響。

1.3.1.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

通過初步實(shí)驗(yàn)確定了提取率的最佳提取點(diǎn)范圍,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于評估3個因素的影響以及優(yōu)化提取工藝參數(shù),以水溶性糖提取率為響應(yīng)值,以超聲時間、提取時間、提取溫度為3個單因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì),響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平見表1,其中-1、0、1分別代表自變量的低、中、高3個水平。采用Design-Expert軟件,應(yīng)用Box-Behnken原理進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(共17 組),從而確定提取的最優(yōu)條件。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.2 水溶性糖提取率測定[20]

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品2 mg,蒸餾水溶解,20 mL容量瓶定容,得100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

蒸餾水作為空白對照,梯度吸取0、40、80、120、160、200 μL對照品溶液于2 mL離心管中,蒸餾水補(bǔ)至200 μL。依次加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液、700 μL濃硫酸后,迅速振蕩搖勻,室溫反應(yīng)20 min后,分別吸取各梯度反應(yīng)液200 μL加入96孔板中,每個濃度3個孔,采用酶標(biāo)儀測定490 nm下吸光值,橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度,縱坐標(biāo)為OD490 nm值,得回歸方程Y=0.006 2x+0.092 8,R2=0.998 8。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2.3 水溶性糖提取率

將水溶性糖提取液稀釋到一定濃度,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作,根據(jù)公式計(jì)算水溶性糖提取率：

式中：C為水溶性糖質(zhì)量濃度/μg/mL;V為提取液體積/mL;m為油莎豆粕粉質(zhì)量/μg。

1.3.3 水溶性糖的純化工藝

通過最優(yōu)提取工藝得到油莎豆粕水溶性粗糖液,采用等電點(diǎn)沉淀法與膜分離技術(shù)相結(jié)合去除粗糖液中的蛋白質(zhì)。

1.3.3.1 等電點(diǎn)沉淀法

滴加1 mol/L的鹽酸將油莎豆粕粗糖液pH調(diào)整為4和5,常溫放置4 h,12 000 r/min離心10 min,0.45 μm膜進(jìn)行超濾,除去溶液中的絮狀懸浮雜質(zhì),得到初步純化后的水溶性糖。

1.3.3.2 等電點(diǎn)沉淀法-膜分離技術(shù)聯(lián)用

滴加1 mol/L的鹽酸將油莎豆粕粗糖液pH調(diào)整為4和5,常溫放置4 h,12 000 r/min離心10 min,0.45 μm膜進(jìn)行超濾后10 ku膜進(jìn)行膜過濾,得到純化后的水溶性糖。

1.3.4 蛋白含量測定

采用BCA法測定蛋白含量。

1.3.4.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備

蒸餾水溶解牛血清白蛋白,制備0.5 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,儲藏于-20 ℃。

1.3.4.2 蛋白濃度檢測

梯度吸取不同體積的0.5 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于96孔板中,蒸餾水補(bǔ)足到20 μL,使蛋白質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL,樣品稀釋至一定倍數(shù)取20 μL加入孔中,各孔再加入200 μL BCA工作液60 ℃放置30 min,在562 nm處檢測吸光值,對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程和稀釋倍數(shù)確定蛋白濃度。

1.3.5 蛋白脫除率、糖保留率計(jì)算公式

蛋白脫除率、糖保留率的計(jì)算參考了郭思維等[21]的方法：

式中：A1為脫蛋白前蛋白吸光度;A2為脫蛋白后蛋白吸光度;B1為脫蛋白前糖吸光度;B2為脫蛋白后糖吸光度。

1.3.6 低聚果糖制備工藝

將除蛋白后的水溶性糖液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)調(diào)整固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～7%后,添加不同比例的果糖基轉(zhuǎn)移酶,在恒溫水浴搖床中65 ℃,100 r/min 轉(zhuǎn)化12 h,于85 ℃水浴條件下滅酶15 min,冷凍干燥即得低聚果糖粉末。

1.3.7 高效液相色譜檢測

色譜柱：COSMOSIL Sugar-D(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相 ∶乙腈水=75 ∶25;流速：0.5 mL/min;柱溫：35 ℃;蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度：75 ℃,載氣流速：2.5 mL/min。

1.3.8 低聚果糖含量計(jì)算公式

低聚果糖(FOS)含量=蔗果三糖(GF2)含量+蔗果四糖(GF3)含量+蔗果五糖(GF4)含量[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采取SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析,采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析,使用Origin 9.0和GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

提取因素對提取率的影響如圖2所示,在超聲處理時間延長至15 min的過程中提取率明顯升高,超聲波的同時作用促進(jìn)了溶劑的水化破碎反應(yīng)[23],可以較快地使油莎豆粕中的水溶性糖溶出,但是隨著超聲處理時間的繼續(xù)加長,提取率提高趨于平緩,此時水溶性糖已經(jīng)基本溶于水中,考慮到提高效率及節(jié)約能源,選取15 min為單因素實(shí)驗(yàn)最理想的超聲時間。

圖2 提取因素對提取率的影響

從圖2可以看出,隨著提取時間的延長,提取率達(dá)到最大值后,提取時間超過3 h,提取率開始逐漸輕微下降。適當(dāng)?shù)奶崛r間會引起多糖的增溶作用,而過長的提取時間造成了水溶性糖的不穩(wěn)定性[24]。因此選取3 h為單因素最理想的提取時間。

圖2可見,當(dāng)溫度從40 ℃升高至70 ℃,提取率也明顯升高,水溶性糖提取率到達(dá)峰值,當(dāng)溫度從70 ℃升高至90 ℃時,這一階段在穩(wěn)定的基礎(chǔ)上略有下降。提取溫度升高伴隨著糖分子的劇烈運(yùn)動,根據(jù)平衡濃度理論,升高溫度可以加速糖的轉(zhuǎn)移,因此升高提取溫度有利于增加提取率[25,26]。但是,過高的溫度也會導(dǎo)致一些只能在低溫下才能活化的熱敏多糖變性[26],還可能會導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞[24],因此,選擇70 ℃為提取溫度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析

水溶性糖提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析見表2。利用Design-Exepert 8.0.6軟件,對響應(yīng)值和各個因素進(jìn)行二次多元回歸擬合,得該模型對應(yīng)的回歸方程。建立的數(shù)學(xué)模型為：Y=-145.22+3.41A+39.01B+2.95C+0.22AB+0.02AC-0.21BC-0.18A2-4.39B2-0.02C2(R2=0.939 5)。

表2 水溶性糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

2.2.2 回歸模型的方差分析

表3 回歸模型方差分析

由表3可以看出,在一次項(xiàng)的預(yù)測中,3個單因素對水溶性糖提取率的影響(P<0.05)均達(dá)到顯著水平;影響大小依次遞減為超聲時間、提取溫度、提取時間。在二次項(xiàng)的預(yù)測中,超聲時間和提取時間都達(dá)到了極顯著水平(P<0.01),提取溫度未達(dá)到顯著水平。在交互項(xiàng)中,提取溫度與提取時間的交互作用影響較顯著,達(dá)到了顯著水平(P<0.05),其他2組交互項(xiàng)均未達(dá)到顯著水平。

2.2.3 模擬驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,理想最優(yōu)工藝參數(shù)：超聲時間16.27 min、提取時間3.10 h、提取溫度74.51 ℃,在此條件下,預(yù)測提取率為52.88%?？紤]到實(shí)際操作、能耗及效率等因素,將理論最優(yōu)條件調(diào)整為：超聲時間為16 min、提取溫度為75 ℃、提取時間為3 h。在調(diào)整后優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證調(diào)整后的提取率,得到提取率為(52.61±0.51)%,差異不顯著。

2.2.4 油莎豆粕水溶性糖的純化工藝

不同方法除蛋白效果如圖3所示,采用等電點(diǎn)沉淀法處理過后的水溶性糖液進(jìn)行超濾后膜分離處理時效率更高。膜分離技術(shù)顯著提高了蛋白質(zhì)清除率,達(dá)到了更好的脫除蛋白效果。2種等電點(diǎn)沉淀法與膜分離技術(shù)聯(lián)用的蛋白質(zhì)清除率以及糖保留率差距不大,但是考慮后續(xù)實(shí)驗(yàn)中果糖基轉(zhuǎn)移酶作用的最適pH為5。在保證實(shí)驗(yàn)效果的同時,出于精簡實(shí)驗(yàn)步驟,提高實(shí)驗(yàn)效率,節(jié)約能源的綜合考慮,油莎豆粕水溶性糖的純化工藝采用實(shí)驗(yàn)組E法,在此基礎(chǔ)上,繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：A為未處理組;B為等電點(diǎn)法pH=4;C為等電點(diǎn)法pH=5;D為等電點(diǎn)法pH=4-膜分離技術(shù);E為等電點(diǎn)法pH=5-膜分離技術(shù)。圖3 不同方法除蛋白效果

2.2.5 生物轉(zhuǎn)化低聚果糖工藝優(yōu)化

低聚果糖組分含量見表4。油莎豆粕水溶性糖中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)97.80%,果糖與葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.64%以及1.40%,證明了油莎豆粕可以作為低成本的蔗糖源;隨著果糖基轉(zhuǎn)移酶添加比例的不斷增大,蔗糖含量顯著減少,果糖和葡萄糖持續(xù)增多,GF2和GF3含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,GF4在酶比例為1∶100時才被檢測到,FOS含量總體先升高后降低。當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶的濃度時,酶的反應(yīng)速度隨酶濃度增加而增加,果糖基轉(zhuǎn)移酶作用于蔗糖分子中的葡萄糖和果糖之間的β(2-1)糖苷鍵,使游離的果糖基連接到另一個蔗糖分子的果糖殘基上形成GF2,并逐步形成GF3[27],但當(dāng)?shù)孜锱c酶的活力中心結(jié)合飽和后,低聚果糖含量就不再增加,酶絕對過量時,GF2的一個果糖基會被轉(zhuǎn)移到另一個GF2上生成蔗糖和GF3[28],說明當(dāng)酶比例為1∶100時酶絕對過量。當(dāng)酶比例為1∶1 000時,低聚果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到30.25%,主要為蔗果三糖與蔗果四糖,分別為27.53%和2.72%,此時轉(zhuǎn)化率最高,FOS含量最高。

表4 低聚果糖組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

3 結(jié)論

以油莎豆粕為原料,浸提油莎豆粕中豐富的糖類,運(yùn)用超聲波輔助熱水提取技術(shù),建立了3種因素相互作用的響應(yīng)面模型,得到了提取油莎豆粕水溶性糖的最優(yōu)工藝;脫除蛋白進(jìn)一步提高水溶性糖純度,比較5種純化工藝,確定了等電點(diǎn)沉淀法與膜分離技術(shù)聯(lián)用脫除蛋白工藝,達(dá)到了有效脫除蛋白和保留糖含量的效果,為有效脫除蛋白提供了一條新思路;高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn),油莎豆粕中蔗糖含量豐富,可以作為低聚果糖生產(chǎn)低成本的蔗糖源,采用果糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化蔗糖為低聚果糖,合理有效地回收利用了農(nóng)副產(chǎn)品資源,具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。