CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2刺激在慢性B淋巴細胞增殖性疾病細胞遺傳學檢測中的臨床價值

賈曉冬,李建偉,毛 翠

1.天津金域醫(yī)學檢驗實驗室有限公司細胞遺傳室,天津 300392;2.廣州金域醫(yī)學檢驗集團股份有限公司實驗室管理中心,廣東廣州 510005

慢性B淋巴細胞增殖性疾病(B-CLPD)是一組可累及骨髓和外周血的成熟B淋巴細胞克隆增殖性疾病,其中慢性淋巴細胞白血病(CLL)是臨床最為常見的一類B-CLPD。細胞遺傳學分析對B-CLPD的診斷、危險分層、預后判斷及診療方案選擇均具有重要意義,但由于常規(guī)細胞遺傳學(CC)獲取的成熟B淋巴細胞有絲分裂指數(shù)低,進而導致疾病檢出率低,且熒光原位雜交(FISH)只能檢測特異位點的異常,不能全面分析染色體異常,因此,B-CLPD的診斷與鑒別診斷一直是國內(nèi)臨床工作的難點[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn),未甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)刺激CLL細胞增殖,可明顯提高染色體核型培養(yǎng)成功率和染色體核型異常檢出率[2-5],但未對非CLL的其他B-CLPD進行相關研究。因此,為提高CLL及其他B-CLPD患者的疾病檢出率,本研究進一步探討了CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2作為刺激劑對CLL和非CLL的其他B-CLPD的染色體核型培養(yǎng)成功率和染色體核型異常檢出率的影響,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年6月天津金域醫(yī)學檢驗實驗室初診的491例B-CLPD患者作為研究對象,將240例CLL患者作為CLL組,男168例,女72例;中位年齡67歲。將251例非CLL的其他B-CLPD患者作為non-CLL組,男149例,女102例;中位年齡66歲。CLL及非CLL的其他B-CLPD患者診斷符合《血液病診斷及療效標準(第4版)》[6],患者均通過流式細胞術檢測到單克隆成熟B淋巴細胞,根據(jù)英國馬斯登皇家醫(yī)院免疫標志積分系統(tǒng)[7]進行分類,CLL患者積分為4～5分,非CLL的其他B-CLPD患者積分低于3分,積分為3分時進行FISH 檢測并參考其他相關檢測以排除套細胞淋巴瘤(MCL)等。

1.2儀器與試劑 光學顯微鏡BX41購自奧林巴斯株式會社;二氧化碳培養(yǎng)箱MCO-18AC購自日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社;BSL-2生物安全柜BSC-1500ⅡB2-X購自濟南鑫貝西生物技術有限公司;醫(yī)用離心機JW-1048購自安徽嘉文儀器裝備有限公司;數(shù)顯恒溫水箱HH-W21-600購自常州澳華儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱DHG-9140A購自上海一恒科學儀器有限公司;Metasystem染色體自動掃描分析系統(tǒng)購自卡爾蔡司光學(中國)有限公司。冰醋酸購自國藥集團化學試劑有限公司;Gibco培養(yǎng)基和胰酶均購自美國賽默飛世爾科技有限公司;CpG-ODN DSP30、IL-2和秋水仙素均購自上海樂辰生物科技有限公司;DSP30堿基序列為TCGTCGCTGTCTCCGCTFCTTCTTGCC;低滲液為0.075 mmol/L氯化鉀溶液,均購自國藥集團化學試劑有限公司;固定液為冰醋酸和甲醇,按照1∶3進行配制,均購自國藥集團化學試劑有限公司;Giemsa染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1染色體培養(yǎng)與制備 采用牛鮑氏計數(shù)板對骨髓細胞進行細胞計數(shù),將每例患者標本分為2份,分別為實驗組和對照組,按照1×106/mL細胞密度種入含8 mL Gibco培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,同步進行培養(yǎng)。實驗組加入100 μL CpG-ODN DSP30和IL-2刺激劑(濃度為2 μmol/L),對照組不加刺激劑。實驗組和對照組均放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱,對照組培養(yǎng)48 h,實驗組培養(yǎng)72 h。完成培養(yǎng)后加入20 μg/mL秋水仙素0.05 mL孵育2 h,收集細胞,進行制片、染色。

1.3.2染色體核型分析 采用Metasystem染色體自動掃描分析系統(tǒng)分析,每份標本分析20個以上染色體處于中期分裂相的培養(yǎng)細胞。核型異常根據(jù)文獻[8]進行詳細描述。1個異?？寺⌒铦M足以下條件之一:(1)≥2個細胞有同樣的染色體數(shù)目增加或結構重排;(2)≥3個細胞有同樣的染色體數(shù)目減少。在CLL中,3個或4個不相關的染色體畸變定義為復雜核型(CK),5個或5個以上的異常(+ 12、+19和其他與預后良好相關的異常除外)定義為高水平復雜核型(high-CK)。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗,當單組n<5時采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1染色體核型培養(yǎng)成功率和異常檢出率比較 在240例CLL患者和251例非CLL的其他B-CLPD患者中,實驗組染色體核型培養(yǎng)成功率及異常檢出率均明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。進一步分析發(fā)現(xiàn),在采用CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2刺激后,CLL患者與non-CLL患者染色體核型培養(yǎng)成功率及異常檢出率比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 實驗組和對照組CLL和non-CLL患者染色體核型培養(yǎng)成功率和異常檢出率比較[%(n/n)]

2.2CLL組和non-CLL組采用CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2刺激后染色體核型異常檢出情況比較 進一步比較CLL組和non-CLL組采用CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2刺激后染色體核型異常檢出情況,包括染色體數(shù)目異常和結構異常。結果顯示,non-CLL組high-CK及CK比例均明顯高于CLL組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。CLL組常見的染色體核型異常由高至低依次為+12、13q-、abn(17p)、14q32(IGH)重排、11q-、6q-等,而non-CLL組常見的染色體核型異常由高至低依次為IGH重排、6q-、+12、7q-、13q-、abn(17p)、+3、+18等。與CLL組比較,non-CLL組更易出現(xiàn)IGH重排、6q-、7q-、+3及+18,見圖2。

圖2 CLL組和non-CLL組常見的染色體核型異常檢出情況比較

表2 CLL組和non-CLL組使用CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2刺激后染色體核型異常檢出率比較[%(n/n)]

3 討 論

B-CLPD的細胞遺傳學異常對于判斷疾病進展、評價臨床預后及制訂治療方案等均具有重要臨床意義。細胞遺傳學分析是檢測細胞遺傳學異常的常用方法,但由于成熟B淋巴細胞屬于終末分化期B細胞,增殖分化能力差,大多數(shù)處于分裂間期,常規(guī)培養(yǎng)不易獲得中期分裂相。目前,已有研究探討了各類刺激劑對提高常規(guī)培養(yǎng)中B淋巴細胞中期分裂相獲得率的不同影響,包括脂多糖、美洲商陸有絲分裂原及植物血凝素(PHA)等,但這些刺激劑對染色體核型異常檢出率的提升效果不佳[8-10]。因此,尋找合適的刺激劑對提升染色體核型培養(yǎng)成功率及異常檢出率均具有重要臨床意義。

現(xiàn)有研究表明,人工合成的CpG-ODN DSP30能夠直接激活B淋巴細胞,提高其增殖能力和細胞因子的分泌速率[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn),IL-2具有抗凋亡作用,可促進成熟B淋巴細胞增殖、分化,從而提高中期細胞培養(yǎng)成功率[11]。因此,CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2可以刺激成熟B淋巴細胞有絲分裂,從而可以提高B淋巴細胞染色體核型培養(yǎng)成功率及異常檢出率。多項研究發(fā)現(xiàn),CpG-ODN聯(lián)合IL-2共同刺激B淋巴細胞可將染色體核型異常檢出率提高至64%～83%[4-5,10-13]。王冬梅[14]等應用CpG-ODN DSP30及IL-2刺激對115例CLL患者的骨髓標本培養(yǎng)后進行R顯帶分析,其染色體核型培養(yǎng)成功率為74.8%,異常檢出率為58.1%。買地娜·艾爾肯等[15]應用PHA、CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2刺激劑對82例CLL患者的骨髓標本進行培養(yǎng)制片,其染色體核型培養(yǎng)成功率分別為90.2%和68.3%,異常檢出率分別為13.5%和46.4%。有研究發(fā)現(xiàn),CpG-ODN DSP30和IL-2聯(lián)合刺激對于CLL的細胞遺傳學分析效果極佳,但對于非CLL的其他B-CLPD研究仍涉及較少[10-13]。本研究進一步探討在CLL及非CLL的其他B-CLPD的細胞遺傳學分析診斷中使用CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL-2刺激對疾病染色體核型檢測的影響發(fā)現(xiàn),CLL和非CLL的其他B-CLPD患者骨髓細胞經(jīng)CpG-ODN DSP30和IL-2聯(lián)合刺激培養(yǎng)的染色體核型培養(yǎng)成功率分別為98.33%和97.61%,異常檢出率分別為53.39%和59.18%。本研究與國內(nèi)之前報道比較,新增了對非CLL的其他B-CLPD的對照研究,且增加了病例數(shù),染色體核型培養(yǎng)成功率及異常檢出率均明顯提高,染色體核型培養(yǎng)成功率接近或高于部分國外數(shù)據(jù),但異常檢出率相比國外數(shù)據(jù)稍低,考慮是因為種族差異及地域差異因素影響[10-13]。

B-CLPD是一組異質性很強的疾病,已有研究表明,染色體核型分析對B-CLPD患者診斷、準確危險分層、評估預后及制訂治療方案等方面均具有重要臨床意義[9]。本研究發(fā)現(xiàn),CLL組常見的染色體核型異常為+12、13q-、abn(17p)、IGH重排、11q-、6q-等;non-CLL組常見的染色體核型異常為IGH重排、6q-、+12、7q-、13q-、abn(17p)、+3、+18。既往有文獻報道,+12是CLL中最頻繁的染色體畸變[16],與本研究結果一致,常與不典型CLL細胞形態(tài)和免疫表型有關,但出現(xiàn)+12的CLL患者生存期與正常核型患者無差異。單純13q缺失預后較好,生存期長,不需要過多治療[17]。abn(17p)往往提示存在p53基因缺失,在疾病復發(fā)或惡性進展時其水平較高,疾病進展較快,患者預后差,生存期短[15]。本研究發(fā)現(xiàn),CLL組檢出CK患者占9.52%,high-CK占12.70%,而non-CLL組檢出CK占21.38%,high-CK占33.79%。既往研究發(fā)現(xiàn),CK與CLL患者不良預后相關,特別是high-CK與CLL中不良預后和對治療(包括新藥物)的不良反應有關[18]。而在B-CLPD患者中,多由特定和常見的染色體易位來解除對已知致癌基因的控制,如濾泡性淋巴瘤的t(14;18)(q32;q21)(涉及IGH::BCL2融合基因),伯基特淋巴瘤的t(8;14)(q24;q32)(涉及IGH::MYC),以及MCL的t(11;14)(q13;q32)(涉及IGH::CCND1融合基因),平衡易位在CLL中很少見[19]。

綜上所述,CpG-ODN DSP30聯(lián)合IL2刺激可成為成熟B淋巴細胞染色體培養(yǎng)的首選刺激劑,可明顯提高B-CLPD的染色體核型培養(yǎng)成功率及異常檢出率,有助于更加全面地檢出B-CLPD的遺傳學異常,并且在非CLL的B-CLPD患者細胞遺傳學檢測中同樣具有重要價值。與CLL患者比較,非CLL的B-CLPD患者更易出現(xiàn)復雜核型,預后更差,應進一步加強對B-CLPD遺傳學復雜性及多樣性的認識。