反復(fù)種植失敗患者慢性子宮內(nèi)膜炎的組織學(xué)診斷及治療價值*

房 格,劉 雯,劉菲菲,于瑞梅,王丹丹,趙 雪,韓 婷

山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院)/生殖內(nèi)分泌教育部重點實驗室(山東大學(xué))/山東省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室/山東省生殖健康臨床醫(yī)學(xué)研究中心/山東省生殖健康技術(shù)創(chuàng)新中心/國家輔助生殖與優(yōu)生工程技術(shù)研究中心病理科,山東濟(jì)南 250012

女性月經(jīng)周期中,子宮內(nèi)膜經(jīng)歷周期性的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)變化,對胚胎著床至關(guān)重要。目前,在子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)了許多與不良妊娠結(jié)局相關(guān)的生物體,這些微生物破壞了子宮內(nèi)膜乳酸菌群[1]。慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)是一種持續(xù)性子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng),引起CE的原因尚不清楚,CE對妊娠結(jié)局的影響可能是因為感染持續(xù)存在,干擾了子宮內(nèi)膜菌群平衡并且破壞著床[2]。CE常無癥狀或僅伴有輕微非特異性表現(xiàn),如疼痛、功能性子宮出血、性交困難、白斑病等,使其診斷具有挑戰(zhàn)性[3]。據(jù)文獻(xiàn)報道,15%～50%的女性子宮內(nèi)膜長期受炎癥反應(yīng)的影響,引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險和植入失敗風(fēng)險升高[4]。因此,提供準(zhǔn)確、有效的篩選方法是非常必要的。目前,幾種診斷方法已建議用于CE篩查,包括宮腔鏡和組織病理學(xué)檢查等常規(guī)方法,還有微生物培養(yǎng)及反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等[5],其中典型CE組織學(xué)表現(xiàn)是由GREENWOOD等[6]發(fā)現(xiàn)的以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主的炎癥浸潤和間質(zhì)水腫。然而,CE的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚無共識,例如有的研究將整個切片中出現(xiàn)1個漿細(xì)胞診斷為CE,而有的研究將整個切片中漿細(xì)胞數(shù)≥5個/10HFP診斷為CE,且不同標(biāo)本的切片面積差異較大;同時,不同子宮內(nèi)膜活檢方法及不同病理切片制作和讀取方法也會導(dǎo)致CE診斷率波動較大。采用免疫組織化學(xué)CD138細(xì)胞特異性標(biāo)記物已被證實是一種更準(zhǔn)確的測試方法[7]。目前,只有少數(shù)小型研究評估了組織學(xué)篩選,且對于伴有CE的反復(fù)種植失敗(RIF)患者,全劑量、全周期使用抗菌藥物是否能提高其胚胎著床率有待進(jìn)一步證實[8]。此外,年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、月經(jīng)周期、不孕年限、不孕類型(原發(fā)性和繼發(fā)性)、移植失敗次數(shù)及凍胚移植前的子宮內(nèi)膜厚度均可能會影響妊娠結(jié)局[9]。本研究對進(jìn)行宮腔鏡檢查并接受子宮內(nèi)膜活檢的60例RIF患者進(jìn)行分析,結(jié)合蘇木精-伊紅(HE)染色及CD138免疫組織化學(xué)染色結(jié)果,對CD138陽性并接受抗菌藥物治療的CE患者不同妊娠結(jié)局進(jìn)行分析,闡明RIF患者中CE的發(fā)生率及對妊娠的影響,并對抗菌藥物治療的臨床意義進(jìn)行評估,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年1月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院(下稱本院)就診的60例RIF患者作為研究對象,年齡23～41歲,平均(31.4±3.6)歲,均同意并接受本院的體外受精-胚胎移植(IVF-ET)方案,最終將成功妊娠的30例RIF患者作為妊娠組,未妊娠的30例RIF患者作為非妊娠組。所有患者均通過CD138免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行CE篩查,其中CD138陽性的CE患者均進(jìn)行抗菌藥物治療,治療后進(jìn)行凍胚移植。RIF定義為移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數(shù)4～6個或高評分囊胚數(shù)3個及以上均未妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn):子宮異常(子宮縱隔,單角子宮等)、黏膜下子宮平滑肌瘤、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜增生、結(jié)核、子宮內(nèi)膜息肉、輸卵管積水、子宮腺肌癥、遺傳性疾病、內(nèi)分泌疾病和自身免疫性疾病等。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過(2021-017)。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 Leica ASP200全自動真空組織脫水機、Leica EG1150組織包埋機、Leica Biocut手動輪轉(zhuǎn)切片機、HE染色儀、Ultra Path全自動免疫組織化學(xué)儀、BX-43光學(xué)顯微鏡。

1.2.2試劑 4%中性甲醛、二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、助染液、蘇木素染液、分化液、返藍(lán)液、伊紅染液、CD138抗體、Ultra DAB染液。

1.3方法

1.3.1CD138陽性計數(shù) 于月經(jīng)周期的增殖期對60例RIF患者進(jìn)行宮腔鏡檢查獲取子宮內(nèi)膜標(biāo)本并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查(病理切片HE染色及CD138免疫組織化學(xué))。病理學(xué)醫(yī)生檢查組織以確定子宮內(nèi)膜間質(zhì)區(qū)在10個高倍鏡視野(HPF,BX-43光學(xué)顯微鏡,HPF直徑=0.55 mm,HPF面積=0.24 mm2)中漿細(xì)胞的數(shù)量。依據(jù)每10個HPF間質(zhì)區(qū)域存在的漿細(xì)胞數(shù)量設(shè)置5個CE診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)漿細(xì)胞數(shù)≥1個/10HPF時診斷為CE;(2)漿細(xì)胞數(shù)≥2個/10HPF時診斷為CE;(3)漿細(xì)胞數(shù)≥3個/10HPF時診斷為CE;(4)漿細(xì)胞數(shù)≥4個/10HPF時診斷為CE;(5)漿細(xì)胞數(shù)≥5個/10HPF時診斷為CE。診斷計數(shù)漿細(xì)胞時只計算子宮內(nèi)膜間質(zhì)區(qū)的漿細(xì)胞個數(shù),宮頸間質(zhì)組織中的漿細(xì)胞不計數(shù)。

1.3.2資料收集 包括年齡、BMI、月經(jīng)周期、不孕年限、不孕類型(原發(fā)性和繼發(fā)性)、移植失敗次數(shù)、CD138陽性率、凍胚移植前的子宮內(nèi)膜厚度。

1.3.3抗菌藥物治療 所有漿細(xì)胞數(shù)≥1個/10HPF的患者均接受了抗菌藥物治療,具體方案為口服左氧氟沙星0.5 g+甲硝唑1 g,1次/天,療程14 d。

2 結(jié) 果

2.15種診斷標(biāo)準(zhǔn)陽性與陰性臨床妊娠率比較 統(tǒng)計5種診斷標(biāo)準(zhǔn)的陽性與陰性例數(shù),以及陽性與陰性間患者臨床妊娠率差異發(fā)現(xiàn),漿細(xì)胞數(shù)≥1個/10HPF時診斷為CE。具體見圖1、表1。

表1 5種診斷標(biāo)準(zhǔn)陽性與陰性例數(shù)及陽性與陰性間臨床妊娠率比較[%(n/n)]

注:A為HE染色(×100);B為HE染色(×200);C為HE染色(×400);D為CD138免疫組織化學(xué)染色(×100),箭頭處為漿細(xì)胞;E、F為CD138免疫組織化學(xué)染色(×400),箭頭處為漿細(xì)胞。

2.23種不同漿細(xì)胞數(shù)量的RIF患者抗菌藥物治療后臨床妊娠及活產(chǎn)結(jié)果比較 60例RIF患者中,36.7%(22/60)的患者發(fā)現(xiàn)組織學(xué)CE,并接受了抗菌藥物治療,而后成功妊娠14例。3種不同漿細(xì)胞數(shù)量的RIF患者抗菌藥物治療后的臨床妊娠及活產(chǎn)結(jié)果比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3種不同漿細(xì)胞數(shù)量的RIF患者抗菌藥物治療后臨床妊娠及活產(chǎn)結(jié)果比較[n(%)]

2.3兩組一般資料及CD138陽性率比較 兩組年齡和CD138陽性率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);兩組BMI、月經(jīng)周期、不孕類型、不孕年限、移植失敗次數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組一般資料及CD138陽性率比較或n(%)或M(P25,P75)]

2.4多因素Logistic回歸分析 將年齡、BMI、月經(jīng)周期、不孕年限、不孕類型、移植失敗次數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、CD138陽性作為自變量,臨床妊娠率作為因變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,年齡和CD138陽性是RIF患者成功妊娠的主要影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析

3 討 論

著床是一個高度復(fù)雜的過程,涉及母親和胚胎2個方面,許多與著床相關(guān)的因素還未完全了解,其中子宮內(nèi)膜起重要作用,在卵巢激素作用下,子宮內(nèi)膜進(jìn)行周期性變化[10]。CE因癥狀不明顯可能導(dǎo)致漏診,但是越來越多的證據(jù)表明,其與流產(chǎn)、足月出生率下降等不良生殖結(jié)果有關(guān)[11]。CE患病率因調(diào)查的患者群體和診斷方法不同而有差異。有研究顯示,CE在人群中的患病率為24.4%～46.0%,不孕女性患CE的比例為40.8%～57.0%,而在RIF患者中CE發(fā)生率為14.0%～57.6%[12]。

有臨床研究表明,子宮內(nèi)膜是持續(xù)暴露于生殖道細(xì)菌中的,疾病的存在取決于感染因子與子宮內(nèi)膜微環(huán)境間的相互作用[12]。子宮內(nèi)膜含有多種免疫活性細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞,其周期依賴性變化可能在植入過程中起關(guān)鍵作用。在正常子宮內(nèi)膜中,只有基底層存在B淋巴細(xì)胞,發(fā)生CE時大量B淋巴細(xì)胞進(jìn)入子宮內(nèi)膜的基底層和子宮內(nèi)膜腺腔內(nèi),由于子宮內(nèi)膜的革蘭陰性菌誘導(dǎo)異常免疫反應(yīng),使B淋巴細(xì)胞遷移到子宮內(nèi)膜間質(zhì)內(nèi)[14]。診斷CE的“金標(biāo)準(zhǔn)”是在子宮內(nèi)膜間質(zhì)區(qū)找到漿細(xì)胞,典型漿細(xì)胞呈高核質(zhì)比,細(xì)胞質(zhì)嗜堿性,細(xì)胞核呈車輻狀,由于一些原因,如子宮內(nèi)膜間質(zhì)區(qū)漿細(xì)胞表現(xiàn)出類似人子宮內(nèi)膜間質(zhì)成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞外觀,此外,分泌期子宮內(nèi)膜組織學(xué)特征,如淺表水腫和間質(zhì)細(xì)胞密度升高,影響了間質(zhì)區(qū)漿細(xì)胞的識別,所以不容易通過常規(guī)組織染色識別子宮內(nèi)膜間質(zhì)區(qū)漿細(xì)胞。為了克服上述問題,引入了更精確的免疫組織化學(xué)法診斷CE。CD138又稱為syndecan-1,是一種跨膜型硫酸肝素蛋白聚糖,經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后在診斷者間一致性較高,表明CD138免疫組織化學(xué)是檢測CE子宮內(nèi)膜間質(zhì)區(qū)漿細(xì)胞的有效工具[15]。但是目前CD138免疫組織化學(xué)染色診斷的標(biāo)準(zhǔn)尚不一致,診斷標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)本選擇偏差造成CE患病率不同[16]。有研究報道,在月經(jīng)周期的第6～12天,即子宮內(nèi)膜增殖期進(jìn)行子宮內(nèi)膜活檢,設(shè)置CE的診斷標(biāo)準(zhǔn)為漿細(xì)胞數(shù)≥5個/10 HPF時,CE患病率為14.0%[15]。在一項RIF的回顧性子宮內(nèi)膜活檢和免疫組織化學(xué)CD138研究中,設(shè)置診斷標(biāo)準(zhǔn)為每個HPF中至少存在1個漿細(xì)胞,CE患病率為30.3%[17]。根據(jù)既往文獻(xiàn)報道,本研究重新確定活檢所需要的漿細(xì)胞數(shù)量,為每10個HPF間質(zhì)區(qū)存在的漿細(xì)胞數(shù)量設(shè)置了5種不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn),將陽性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為漿細(xì)胞數(shù)≥1個/10 HPF時,陽性與陰性患者的臨床妊娠率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。雖然將陽性標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)置為漿細(xì)胞數(shù)≥2、3、4個/10 HPF時,臨床妊娠率差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但是將陽性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定在較低水平,可以使臨床盡可能多地檢出CE,以便及時干預(yù)、治療,避免不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。本研究不同漿細(xì)胞數(shù)量的RIF患者治療后臨床妊娠率和活產(chǎn)率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明子宮內(nèi)膜間質(zhì)區(qū)漿細(xì)胞數(shù)量與CE的嚴(yán)重程度無關(guān)。

在IVF-ET過程中,年齡、月經(jīng)周期、不孕年限、不孕類型、移植失敗次數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度對成功臨床妊娠至關(guān)重要。本研究對妊娠組和非妊娠組的上述影響因素及CD138陽性率進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,兩組年齡和CD138陽性率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),由此說明年齡是主要的影響因素,妊娠組平均年齡小于非妊娠組,與既往研究結(jié)論一致[18]。提示隨著年齡增長,卵巢儲備功能呈不可逆性下降。本研究60例RIF患者中,36.7%(22/60)的患者CD138陽性,被診斷為CE并接受抗菌藥物治療,而后成功妊娠14例,明顯高于非妊娠組的8例。雖然抗菌藥物治療對臨床妊娠的影響目前尚存在爭議,但宮腔內(nèi)感染原的持續(xù)存在對子宮內(nèi)膜環(huán)境有潛在有害影響,治療后明顯提高了臨床妊娠率。因CD138陽性治療后未再次進(jìn)行子宮內(nèi)膜組織學(xué)復(fù)查,推測可能部分CE對抗菌藥物治療不敏感,所以未能獲得成功臨床妊娠,但抗菌藥物治療后敏感的婦女臨床妊娠率比不敏感的婦女高,說明CD138陽性接受抗菌藥物治療是有意義的,與LIU等[19]的研究結(jié)果相似,該研究發(fā)現(xiàn)CD138陽性婦女接受多西環(huán)素治療后,妊娠結(jié)局可以得到有效改善。有研究報道表明,RIF合并CE的病例經(jīng)抗菌藥物治療后臨床和持續(xù)妊娠率提高,病理性CE即使未經(jīng)治療,也不會影響臨床試管授精結(jié)果[20]。目前,針對CE的抗菌藥物治療尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),本研究經(jīng)抗菌藥物治療后的CE患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率均提高,推測抗菌藥物治療有一定意義。

為進(jìn)一步分析各因素對臨床妊娠的影響,進(jìn)一步做多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,年齡和CD138陽性是RIF患者成功妊娠的主要影響因素。因此,RIF患者應(yīng)及時就醫(yī),積極治療,減少因年齡增長和CE引起的不良妊娠結(jié)局。但是組織學(xué)檢查也有局限性,比如子宮內(nèi)膜活檢基于有限的樣本收集,不能顯示整個宮腔和子宮內(nèi)膜狀態(tài),分析子宮內(nèi)膜樣本的依賴性,取決于染色的穩(wěn)定性、觀察者的經(jīng)驗、樣本收集的月經(jīng)周期階段等。雖然各研究中CE對生育影響的結(jié)果有差異,推測可能是因為不同患者背景和不同研究對象及對CE診斷標(biāo)準(zhǔn)有差異,但更重要的是RIF可能有更復(fù)雜和深層的原因。但是部分非CE患者也成功獲得臨床妊娠,說明診斷性宮腔鏡本身和子宮內(nèi)膜活檢也可能發(fā)揮積極作用,宮腔鏡可以物理去除CE病理生理中涉及的細(xì)菌生物膜,同時,子宮內(nèi)膜活檢和隨后恢復(fù)過程可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜中參與胚胎著床的細(xì)胞因子和生長因子分泌[21]。

綜上所述,RIF患者中CE發(fā)生率較高,在CD138陽性并通過抗菌藥物治療后,再次胚胎移植更容易獲得臨床妊娠。但是本研究為回顧性研究,樣本量相對較小,今后需進(jìn)行大樣本的前瞻性研究,并且除了應(yīng)用宮腔鏡檢查和組織學(xué)檢查外,還要針對CE進(jìn)行微生物培養(yǎng),以及使用RT-PCR選用敏感的抗菌藥物治療,不斷提高RIF患者的臨床妊娠率。