高效液相色譜法對(duì)土壤中抗生素殘留檢測(cè)研究

顏 潔,張群英

(1.貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心,貴州 貴陽(yáng) 550002;2.貴州省植物園,貴州 貴陽(yáng) 550001)

抗生素類藥物可長(zhǎng)時(shí)間存在于土壤中不被降解,部分抗生素隨著水流滲透到地下和地下水,造成水質(zhì)污染,最終對(duì)人的身體健康造成傷害。為降低抗生素對(duì)環(huán)境的影響,對(duì)土壤中抗生素進(jìn)行檢測(cè)非常必要,這就需要建立一種新檢測(cè)方法彌補(bǔ)原來(lái)檢測(cè)方法中準(zhǔn)確度不高的缺陷。本次實(shí)驗(yàn)以養(yǎng)殖場(chǎng)周圍的土壤作為實(shí)驗(yàn)的材料對(duì)兩類抗生素進(jìn)行研究。選擇4種喹諾酮類抗生素以及2種磺胺類的抗生素作為主要檢測(cè)目標(biāo),再利用超聲波進(jìn)行輔助提取,以提高樣品中目標(biāo)物質(zhì)的回收率,提取后的樣品用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

本次實(shí)驗(yàn)研究樣品來(lái)自魚(yú)場(chǎng)周圍的土壤。主要實(shí)驗(yàn)儀器如下：Waters高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司;DN-24W恒溫水浴氮?dú)獯蹈蓛x,上海比朗儀器制造有限公司;KQ5200E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;德國(guó)IKA VORTEX 渦旋混勻器,廣州儀科實(shí)驗(yàn)室有限公司;電子天平JY10002,上海舜宇恒平有限公司;Oasis HLB固相萃取柱,美國(guó)Waters公司;TG16.5臺(tái)式高速離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

實(shí)驗(yàn)試劑及標(biāo)準(zhǔn)品：一水合檸檬酸,分析純;無(wú)水磷酸氫二鉀,分析純;乙腈,化學(xué)純;甲酸,色譜級(jí);乙二胺四乙酸二鈉鹽,分析純;乙二胺四乙酸,分析純;甲醇,分析純;氨水,優(yōu)級(jí)純?？股貥?biāo)準(zhǔn)品：磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星,純度>98%,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別稱取0.01 g的6種抗生素環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和磺胺甲噁唑抗生素到10.0 mL燒杯中,用少量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移到10.0 mL容量瓶中,用甲醇清洗燒杯2～3次;清洗后的甲醇也轉(zhuǎn)移到該容量瓶中,然后用甲醇定容至刻度,混合均勻,配成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃的冰箱中保存,有效期3個(gè)月。

1.2.2流動(dòng)相

0.1%甲酸溶液：在1 L的容量瓶里準(zhǔn)確加入1.0 mL純度>99%的甲酸,用超純水定容至刻度,混合均勻,用0.22 μm的水系膜過(guò)濾。

1.2.3提取液

0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液：在325 mL的純水中加入稱取好的4.2 g的檸檬酸和8.95 g的磷酸二氫鉀,混合充分之后用鹽酸(或氫氧化鈉)調(diào)節(jié)pH值到4.0±0.05。加入12.1 g的乙二胺四乙酸二鈉鹽,制成的325 mL濃度0.1 mol/L的EDTA-Mcllvaine緩沖液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)前處理

毛澤東在吸收和發(fā)展湖湘學(xué)派“力行第一”知行觀的基礎(chǔ)上，非常注重對(duì)各種理論的實(shí)踐與力行，這在他的一生都得到比較充分的體現(xiàn)。在1920年，毛澤東創(chuàng)辦文化書(shū)社，在湖南傳播新文化、新思想，使之不僅是一個(gè)傳播馬克思主義的機(jī)構(gòu)，而且是建立共產(chǎn)黨的一個(gè)秘密機(jī)構(gòu)，為建立共產(chǎn)黨做了巨大的貢獻(xiàn)。在領(lǐng)導(dǎo)湖南自治運(yùn)動(dòng)失敗后，毛澤東投入巨大的精力組建湖南社會(huì)主義青年團(tuán)和長(zhǎng)沙共產(chǎn)主義小組，把青年團(tuán)創(chuàng)建同黨的創(chuàng)建緊密聯(lián)系在一起。深入農(nóng)村，在充分調(diào)查了解之后創(chuàng)作了《湖南農(nóng)民運(yùn)動(dòng)調(diào)查報(bào)告》，領(lǐng)導(dǎo)秋收起義等。

喹諾酮類土壤樣品預(yù)處理：在50 mL離心管中加入0.5 g的樣品土樣,再加入4 mL乙腈、0.7 mL 20%氨水溶液以及0.3 mL 10%EDTA溶液,蓋好離心管蓋,將離心管渦旋30 s;然后放入超聲清洗器中超聲提取10 min,取出放入離心機(jī)中以4 000 r/min的速度離心6 min。將離心管的上層清液收集起來(lái)對(duì)殘留物再一次地提取之后合并上層的清液,再在40 ℃的氮?dú)獯蹈蓛x中將其氮吹到近干,將試管倒扣后不會(huì)有液體流出即可。然后加入0.5 mL的原始流動(dòng)相,用注射器取出注射到0.22 μm濾膜上后用機(jī)器分析結(jié)果?；前奉愅寥罉悠奉A(yù)處理：在50 mL離心管中加入0.5 g的樣品土樣,再加入體積比為1∶1的甲醇和5 mL EDTA-Mcllvaine的混合溶液進(jìn)行溶解。將離心管渦旋30 s,然后放入超聲清洗器中超聲提取10 min,取出放入離心機(jī)中以4 000 r/min的速度離心6 min。將離心管的上層清液收集起來(lái)對(duì)殘留物再一次的提取之后,合并上層的清液并濃縮至5 mL。用6 mL甲醇和6 mL純水活化柱子,再將5 mL濃縮液過(guò)HLB小柱,分別用6 mL超純水和3 mL甲醇進(jìn)行洗脫,再將洗脫好的溶液收集到試管當(dāng)中。再在40 ℃的氮?dú)獯蹈蓛x中將其氮吹到近干,將試管進(jìn)行倒扣后不會(huì)有液體流出即可。最后用0.5 mL的甲醇與純水6∶4的混合液進(jìn)行定容,然后用注射器取出注射到0.22 μm濾膜上后用機(jī)器分析結(jié)果。

1.3.2色譜條件

喹諾酮類抗生素液相色譜條件：色譜柱,ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm);柱溫,35 ℃;流速,0.3 mL/min;進(jìn)樣量,10 μL;流動(dòng)相,0.1%甲酸水溶液-乙腈(87∶13)。

磺胺類抗生素液相色譜條件：色譜柱,ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm);柱溫,35 ℃;流速,0.3 mL/min;進(jìn)樣量,10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng),270 nm;流動(dòng)相,0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20)。

2 結(jié)果分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1提取液的選擇

實(shí)驗(yàn)中在對(duì)喹諾酮類的藥物進(jìn)行提取時(shí)比較了純乙腈提取液(M1)和乙腈與EDTA溶液和氨水混合液提取液(M2)兩種提取液對(duì)抗生素的回收率所產(chǎn)生的影響。在抗生素中加入兩種提取液各5 mL然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同提取劑對(duì)抗生素的添加回收率

從表1可以看出,兩種提取液的差別,其中M2的提取液效果要比M1好很多,并且由于同極斥的原理,喹諾酮類藥物在與土壤進(jìn)行反應(yīng)后也是互相排斥的,且更容易在土壤中進(jìn)行分離,所以M2的效果更優(yōu)于M1。

2.1.2濃縮方法的優(yōu)化

2.1.3提取操作和次數(shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中采用了超聲波提取并渦旋了兩種溶液,能夠看出操作時(shí)間對(duì)于兩種磺胺類藥品回收率是有一定影響的,同時(shí)也對(duì)提取次數(shù)的提取效果進(jìn)行了對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同提取方法對(duì)2種磺胺類藥物的添加回收率

由表2可知,超聲和渦旋組合提取能夠明顯提高藥品回收率,采用渦旋法能夠?qū)⒃噭┡c沉積在離心管下面的藥物進(jìn)行充分且均勻的混合,而超聲的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)于藥品的回收率來(lái)說(shuō)并沒(méi)有特別明顯的影響。雖然超聲10 min加上渦旋30 s的組合提取時(shí)間是最短的,但是效果卻是最好的,對(duì)于實(shí)驗(yàn)的效率提升也非常明顯。不同提取次數(shù)對(duì)抗生素的添加回收率見(jiàn)表3。

表3 不同提取次數(shù)對(duì)抗生素的添加回收率

由表3可知,提取3次的回收率最高,提取2次回收率與它并沒(méi)有差很多,所以實(shí)驗(yàn)選擇上會(huì)選擇最具效率的方法,即超聲10 min渦旋30 s,提取2次的前處理方式。

2.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

2.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

6種抗生素在進(jìn)行紫外線檢測(cè)掃描時(shí)能夠發(fā)現(xiàn),在180～380 nm這個(gè)波長(zhǎng)的區(qū)間進(jìn)行全段掃描是最佳的。從參考文獻(xiàn)中能夠發(fā)現(xiàn)磺胺類的檢測(cè)波長(zhǎng)在265～272 nm,大多數(shù)選擇270 nm作為最佳波長(zhǎng),喹諾酮類檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm,所以在進(jìn)行選擇時(shí)本實(shí)驗(yàn)選擇了磺胺類檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm,喹諾酮類檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm。

2.2.2抗生素的高效液相色譜分離圖

根據(jù)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到最優(yōu)分離檢測(cè)的液相分離條件。各抗生素添加濃度為5 mg/L時(shí)液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 六種抗生素的高效液相色譜分離圖

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用空白樣品溶液進(jìn)行稀釋,將其變成質(zhì)量濃度分別為0.05、1、5、10、20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣,將工作溶液濃度作為橫坐標(biāo),液相峰面積作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而得到每個(gè)組份的線性關(guān)系。6種抗生素的線性方程及相關(guān)系數(shù)R2見(jiàn)表4。得到結(jié)果的相關(guān)系數(shù)都>0.99。

表4 4種氟喹諾酮和2種磺胺類抗生素的線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.3.2準(zhǔn)確度與精密度

稱取0.5 g土壤樣品3份,向其中分別加入1.0 mL 3種濃度(0.05、0.5、5 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后進(jìn)行平行的3組實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表5所示。由表5可知,加標(biāo)回收的平均回收率在71.8%～94.3%,而實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～15.5%,所以該提取、檢測(cè)的方法可行。

表5 6種抗生素在不同濃度下的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本文實(shí)驗(yàn)將土壤作為實(shí)驗(yàn)材料,將比較常見(jiàn)的6種抗生素作為實(shí)際的檢測(cè)對(duì)象,通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可得到以下結(jié)論：①高效液相色譜技術(shù)對(duì)4種喹諾酮類藥物的檢測(cè),流動(dòng)相采用0.1%甲酸水和

乙腈(87∶13)作為液相條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4種抗生素完全分離只需要5 min,每個(gè)組的濃度和峰面積之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均>0.99,抗生素的標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～15.4%。②高效液相色譜技術(shù)對(duì)2種磺胺類進(jìn)行檢測(cè),流動(dòng)相采用為0.1%甲酸水和乙腈(80∶20)作為液相條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4種抗生素完全分離需要3 min,每組的濃度和峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均>0.99,抗生素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在0.9%～15.5%。③本實(shí)驗(yàn)對(duì)于土壤中6種抗生素不同的濃縮方法對(duì)回收率影響進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)氮?dú)鉂饪s為最佳方法,雖然耗時(shí)長(zhǎng),但是損耗低,峰型也好。