母乳中β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯分布規(guī)律研究

李韻唱,王龍瓊,何小玲,丁德勝,王元楷,周鳳蘭,蔡甜,陳科偉*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(中匈食品科學合作研究中心,重慶,400715) 3(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室,重慶,400715)4(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶,400016) 5(西南大學 化學化工學院,重慶,400715)

嬰幼兒在生長發(fā)育時期主要通過母乳或配方奶獲取所需的營養(yǎng),這一時期嬰幼兒的身體機能迅速發(fā)展。研究普遍認為母乳喂養(yǎng)不僅有利于嬰兒的健康成長、降低對各種疾病的易感性,還可以降低女性乳腺癌和卵巢癌的發(fā)病率[1]。中國營養(yǎng)學會也對母乳喂養(yǎng)進行了積極的宣傳和指導[2]。由于多方面的因素,中國目前的純母乳喂養(yǎng)率雖然在逐年增長,但仍不足40%,低于世界衛(wèi)生組織50%純母乳喂養(yǎng)率的全球營養(yǎng)目標[3]。因此,探索母乳中營養(yǎng)成分組成及其分布規(guī)律,研發(fā)更加具有針對性的嬰兒配方食品,在特殊情況下替代母乳喂養(yǎng)仍然是關乎兒童健康發(fā)展的重要研究方向。

母乳中含有特定的蛋白質(zhì)、脂類、維生素等,易于消化,在兒童發(fā)育的關鍵時期(前3個月)能提供生長發(fā)育所需的全部營養(yǎng)[1]。母乳中的微量營養(yǎng)素作為調(diào)節(jié)新陳代謝和生理作用的必需成分在嬰幼兒生長發(fā)育中起到關鍵性作用。其中維生素A主要參與生殖、視覺發(fā)育和細胞分化,進而影響嬰幼兒生長發(fā)育和免疫系統(tǒng)的完整性等生理過程[4],特別是對嬰幼兒肺的形成至關重要,有助于肺的完全成熟和維持[5]。維生素A缺乏癥是發(fā)展中國家新生兒中最常見的營養(yǎng)問題之一[6],尤其是對于早產(chǎn)兒來說,他們體內(nèi)的維生素A水平明顯低于足月新生兒,且在出生后的最初幾周內(nèi)生長代謝較高,因此對維生素A的營養(yǎng)需求更高[7]。

母乳中的維生素A類物質(zhì)及其前體主要包括維生素A、維生素A酯及β-胡蘿卜素等。β-胡蘿卜素具有維生素A活性,是人體內(nèi)維生素A的主要來源。維生素A酯是維生素A在人體內(nèi)積累的主要形式,主要包括視黃醇棕櫚酰酯、視黃醇亞油酸酯、視黃醇乙酸酯等[8]。目前,我國對不同泌乳期母乳中維生素A類物質(zhì)的研究多集中在維生素A的含量變化層面[3,6,9],對母乳中類胡蘿卜素的研究也多聚焦在不同分子結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素在母乳中的含量研究[10],對β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯的綜合研究比較少,三者在母乳中的相關性分析以及分布變化規(guī)律尚不明確。研究方法也多采用高效液相色譜技術進行定量分析[9-10],對結(jié)合了脂肪酸的維生素A酯的研究較少。

據(jù)此,本研究收集了150份不同泌乳階段的母乳,利用超高效液相色譜/四極桿飛行時間質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography/quadrupole time of flight mass spectrometry,UPLC/Q-TOF-MS)檢測技術定性定量分析母乳中的維生素A類物質(zhì)及其前體。同時探究不同泌乳階段下β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯的物質(zhì)組成和含量分布情況,以此較為全面地展現(xiàn)維生素A類物質(zhì)及其前體在母乳中的分布變化規(guī)律,為嬰兒配方食品的生產(chǎn)研發(fā)提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 母乳采集

母乳樣品來自重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科(倫理審查批號:2020-548),由150名年齡在22～43歲的哺乳期志愿者提供。共采集到初乳樣品(1～7 d)50份、過渡乳樣品(8～15 d)50份、成熟乳樣品(16 d以后)50份。所有哺乳期志愿者均無乳頭破裂、傳染性疾病、藥物或毒品成癮、抽煙酗酒等不良嗜好。收集母乳時用熱毛巾溫敷志愿者乳房,取20 mL樣品均分為10份裝入環(huán)氧乙烷滅菌的PP材質(zhì)試管,然后迅速放至-80 ℃環(huán)境中貯存?zhèn)溆肹11]。

1.1.2 試劑

維生素A(CAS:68-26-8),南京草本源生物科技有限公司;β-胡蘿卜素(CAS:7235-40-7),上海源葉生物科技有限公司;視黃醇乙酸酯(CAS:127-47-9)、視黃醇棕櫚酸酯(CAS:79-81-2)、乙酸銨、丙酮(HPLC)和甲醇(HPLC),Sigma-Aldrich(中國,上海);甲醇(AR),上海麥克林生化有限公司;氯仿(AR)、乙醇(AR),重慶萬盛川東化工有限公司;氯化鈉、無水硫酸鈉,成都科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290 infinity Ⅱ超高效液相色譜儀,美國Agilent公司;四級桿飛行時間質(zhì)譜儀(具有Bruker Compass DataAnalysis 5.1數(shù)據(jù)處理軟Bruker Impact Ⅱ件),德國Bruker公司;Vortex-2渦旋混勻儀,上海滬析實業(yè)有限公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;SHZ-Ⅱ循環(huán)水真空泵、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;超DW-HL398低溫冷凍儲存箱,中科美菱低溫科技股份有限公司;BSA124S分析天平,德國Sartorious公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 母乳中維生素A類物質(zhì)及其前體的提取

采用課題組已經(jīng)建立的方法[12]加以改進提取母乳中的維生素A類物質(zhì)及其前體:將1 mL母乳轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,然后按照V(母乳)∶V(甲醇)∶V(三氯甲烷)=1∶5∶10的比例分別加入甲醇與三氯甲烷,混合超聲5 min,再渦旋5 min。接著將3 mL質(zhì)量分數(shù)0.9%的 NaCl溶液添加到該混合物中,再次超聲5 min,渦旋5 min。充分混勻后,于4 ℃下靜置 5 h,然后置入高速冷凍離心機中8 000 r/min,4 ℃條件下離心5 min,分離出含有β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯的下層有機相。將上層水相中加入5 mL三氯甲烷,與上述相同步驟下復提1次。將所提取的全部有機相用無水硫酸鈉進行過濾,然后在30 ℃條件下進行減壓旋蒸,直至所有有機液體全部除去,最后貯存在-20 ℃環(huán)境中備用。在進行UPLC/Q-TOF-MS分析前將樣品取出,用300 μLV(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1的混合溶劑復溶,經(jīng)尼龍濾膜(0.22 mm)過濾即可。

1.3.2 UPLC/Q-TOF-MS檢測條件

利用UPLC/Q-TOF-MS對β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯進行測定,UPLC型號為Agilent 1290,并配備了自動進樣系統(tǒng)和二極管陣列檢測器(diode array detector,DAD)。分析柱為C18柱(Poroshell 120, 1.9 mm),2.1 mm×100 mm,保護柱材質(zhì)相同。檢測方法參考實驗室已經(jīng)建立的方法進行[13]。UPLC流速為0.2 mL/min,流動相A為V(甲醇)∶V(水)=8∶2,流動相B為V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1,流動相中均加入50 mmol/L 乙酸銨。采用了0～15 min,25% B～100% B;15～20 min,100% B;20～25 min,25% B的梯度洗脫程序。DAD檢測器記錄190～800 nm波長范圍內(nèi)信號,在450 nm下檢測β-胡蘿卜素的信號強度。

質(zhì)譜利用大氣壓化學電離源(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)對β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯進行測定。利用正離子模式(APCI+)和負離子模式(APCI-)進行MS和MS/MS掃描。正離子模式的設定參數(shù)為:質(zhì)量允許范圍60～3 000m/z,霧化氣流速2 Bar,干燥氣體流速8 L/min,干燥氣溫度220 ℃。毛細管電壓4 500 V,末端平板電壓500 V,裂解能量7 eV。負離子模式設置參數(shù)為:質(zhì)量范圍300～3 000m/z,霧化氣流速2 Bar,干燥氣體流速8 L/min,干燥氣溫度220 ℃。毛細管電壓3 500 V,末端平板電壓500 V,裂解能量10 eV,通過Bruker Compass Data Analysis 5.1軟件對得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行進一步的分析處理。

1.3.3 定性測定

利用UPLC/Q-TOF-MS對β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯類物質(zhì)進行定性分析,即通過UPLC分離人乳中的不同物質(zhì),得到對應的色譜峰。然后利用MS對未知物質(zhì)進行分子質(zhì)量分析,再通過標準品的信息以及MS/MS片段對相關物質(zhì)的色譜峰進行定性。

1.3.4 標準曲線繪制

取經(jīng)定性確定后的商用高純度β-胡蘿卜素(BR,97%)標準品10 mg,用無水乙醇溶解配制成1 000 mg/L的標準溶液,然后梯度稀釋為質(zhì)量濃度10～1 000 mg/L的系列標準溶液。以此標準溶液作為母乳樣品中β-胡蘿卜素定量的標準品。

取經(jīng)定性確定后的商用高純度維生素A(HPLC≥98%)標準品10 mg,用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1(質(zhì)量比)混合溶劑溶解配制成100 mg/L的標準溶液,然后梯度稀釋為質(zhì)量濃度1～100 mg/L的系列標準溶液。以此標準溶液作為母乳樣品中維生素A定量的標準品。

取經(jīng)定性確定后的商用高純度視黃醇乙酸酯(AR≥98%)、視黃醇棕櫚酸酯(AR≥98%)標準品1∶1(質(zhì)量比)混合后,取10 mg混合標準品用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1混合溶劑溶解配制成100 mg/L的標準溶液,然后梯度稀釋為質(zhì)量濃度1～100 mg/L的系列標準溶液。以此標準溶液作為母乳樣品中維生素A酯類物質(zhì)定量的標準品。

在UPLC/Q-TOF-MS的檢測條件下,將梯度稀釋后的3組標準溶液進樣分析。以峰面積為橫坐標,對應質(zhì)量濃度(mg/L)為縱坐標繪制標準曲線,得到β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯標準溶液的回歸方程和相關系數(shù)。

1.3.5 定量測定

每個母乳樣品分析2次,維生素A和β-胡蘿卜素分別根據(jù)各自的標準曲線進行定量測定,而對維生素A酯的定量測定則為相對定量測定,各種維生素A酯統(tǒng)一采用混合維生素A酯標準曲線進行定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究利用Bruker Compass Data Analysis 5.1軟件對β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯進行定性定量分析,運用ChemDraw 20.0軟件繪制相關的物質(zhì)結(jié)構(gòu)式。采用GraphPad Prism 8軟件對相關數(shù)據(jù)進行分析處理結(jié)合SPSS 27.0軟件與OmicShare平臺進行差異性分析、主成分分析、相關性分析以及聚類熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯定性分析

維生素A主要形式為視黃醇,其衍生物為視黃醛和視黃酸,結(jié)構(gòu)如圖1所示。視黃醇為不飽和一元醇,可以與脂肪酸酯化形成各種維生素A酯。維生素A酯具有較好的穩(wěn)定性,目前國內(nèi)外的嬰兒配方食品中多通過添加視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯進行維生素A營養(yǎng)強化[14],但其在母乳中的組成和分布研究還比較少。β-胡蘿卜素含有2個維生素A的環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1),在人體體內(nèi)經(jīng)過酶的作用可以有調(diào)節(jié)性地轉(zhuǎn)化為維生素A[15]。

圖1 維生素A與β-胡蘿卜素化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure formula of vitamin A and β-carotene

本實驗在APCI+模式下對采集到的150份母乳樣品進行UPLC/Q-TOF-MS分析。通過對保留時間、液相色譜的紫外-可見光譜特征、準確的質(zhì)量、質(zhì)譜測量的同位素模式以及ms2基反應的產(chǎn)物離子特征等因素的鑒定對維生素A相關物質(zhì)進行定性。表1以保留時間為順序展示了在30 min的進樣時間里3個泌乳階段的母乳中檢測出的全部14種不同維生素A類物質(zhì)以及β-胡蘿卜素的相關信息。其中,除檢測到視黃醇、視黃酸、β-胡蘿卜素外,共檢測出了9種維生素A酯,包括1種中鏈維生素A酯(辛酸視黃醇酯)和8種長鏈維生素A酯(十五碳烯酸視黃醇酯、棕櫚酸視黃醇酯、十七碳烯酸視黃醇酯、硬脂酸視黃醇酯、二十碳五烯酸視黃醇酯、二十二酸視黃醇酯、二十二碳烯酸視黃醇酯、二十四酸視黃醇酯)。其他學者研究也發(fā)現(xiàn)視黃醇的長鏈酰基酯是維生素A在體內(nèi)的主要化學形式[16]。

表1 母乳中維生素A、維生素A酯與β-胡蘿卜素組成Table 1 Composition of vitamin A, vitamin A esters and β-carotene in breast milk

2.2 β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯定量分析

2.2.1 不同泌乳階段的β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯

根據(jù)信噪比(S/N)為3確定檢出限(limits of detection,LOD)以及信噪比(S/N)為10確定定量限(limits of quantification,LOQ)。經(jīng)UPLC/Q-TOF-MS分析后得到β-胡蘿卜素的標準曲線為y=62.938x+359.57,其中y為質(zhì)量濃度(mg/L),x為峰面積,線性相關系數(shù)為R2=0.997。維生素A的標準曲線為y=2-5x-0.000 001 7,其中y為物質(zhì)的質(zhì)量濃度(mg/L),x為峰面積,線性相關系數(shù)為R2=0.996。混合維生素A酯的標準曲線為y=3-5x-0.000 008 9,其中y為物質(zhì)的質(zhì)量濃度(mg/L),x為峰面積,線性相關系數(shù)為R2=0.997。

根據(jù)標準曲線分別進行定量分析后,得到不同泌乳階段的β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯含量如圖2所示。由圖2可知,初乳中β-胡蘿卜素平均含量最高,隨著泌乳周期的延長,母乳中的β-胡蘿卜素逐漸減少,從初乳中的82.92 mg/L下降至過渡乳中的35.32 mg/L(初乳的42.6%),進一步下降至成熟乳中的29.19 mg/L(初乳的35.2%)。采用SPSS 27.0對不同泌乳時期的β-胡蘿卜素進行單因素方差分析,結(jié)果表明在95%的置信度下不同泌乳階段的β-胡蘿卜素含量具有顯著差異(P<0.05)。采用Duncan法結(jié)合LSD法多重比較分析組間差異,得到初乳與過渡乳間的β-胡蘿卜素含量存在極顯著差異(P<0.01),初乳與成熟乳間的β-胡蘿卜素含量也存在極顯著差異(P<0.01),而過渡乳和成熟乳間的β-胡蘿卜素含量差異并不顯著。這一發(fā)現(xiàn)與其他研究者的研究結(jié)果一致[17],β-胡蘿卜素在3個階段的母乳中含量逐漸下降,且在初乳到過渡乳階段下降幅度最大。

圖2 不同泌乳期母乳中的β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯含量Fig.2 Contents of β-carotene, vitamin A, and vitamin A ester in breast milk during different lactation periods

圖2表明母乳中維生素A的平均含量隨著泌乳周期的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,從初乳中的681.66 mg/L下降至過渡乳中的498.67 mg/L,然后下降至成熟乳中的305.82 mg/L。采用SPSS 27.0對不同泌乳時期的維生素A進行單因素方差分析,結(jié)果表明,在95%的置信度下不同泌乳階段的維生素A含量具有顯著差異(P<0.05)。采用Duncan法結(jié)合LSD法多重比較分析組間差異,得到初乳與成熟乳間的維生素A含量存在極顯著差異(P<0.01),初乳與過渡乳間的維生素A含量差異不顯著,過渡乳和成熟乳間的維生素A含量差異也并不顯著。其他研究者也得到了相似的結(jié)論[9],說明隨著泌乳期的延長,母乳中維生素A含量逐步下降,且下降趨勢較為穩(wěn)定。

研究發(fā)現(xiàn),母乳中的維生素A酯含量較少,部分母乳中甚至沒有檢測到維生素A酯的存在。初乳中維生素A酯平均含量為114.60 mg/L,過渡乳中維生素A酯平均含量為159.10 mg/L,成熟乳中維生素A酯平均含量為129.04 mg/L。采用SPSS 27.0對不同泌乳時期的維生素A酯進行單因素方差分析,結(jié)果表明,在 95%的置信度下不同泌乳階段的維生素A酯含量并不具有顯著差異,這說明不同泌乳階段下母乳中的維生素A酯含量較為穩(wěn)定。母乳中的脂質(zhì)主要由甘油三酯、磷脂以及其他低豐度脂組成,其中甘油三酯含量越占脂質(zhì)總量的98%～99%[18]。由此可見母乳中的脂肪酸大多以游離形式或甘油三酯形式存在,僅存在少量脂肪酸能夠與維生素A結(jié)合形成維生素A酯。

母乳中的維生素A類物質(zhì)的含量受多重因素的影響,包括產(chǎn)婦的飲食情況、健康情況、生活狀態(tài)、泌乳階段、乳樣采集方法等[6]。因此,由圖2可知母乳中各組分含量具有很大的個體差異,泌乳初期的母乳中含有大量的β-胡蘿卜素和維生素A,隨著泌乳期延長均逐漸減少,這可能是因為在嬰兒發(fā)育初期需要攝入較高水平的維生素A類物質(zhì)以供生長發(fā)育以及肝臟儲積[19]。而且母親在分娩后初期普遍會加強營養(yǎng)攝入,食物種類以肉、禽、蛋等高脂高蛋白食物為主,這也會對母乳中維生素A類物質(zhì)的含量產(chǎn)生一定的影響[20]。

2.2.2 三個泌乳階段母乳中維生素A酯的類型分布

維生素A酯的形成和水解是脂溶性微量營養(yǎng)素維生素A代謝的關鍵過程。不同泌乳期的母乳中維生素A酯的含量大致相似,但組成成分有所不同。如圖3所示,通過UPLC/Q-TOF-MS在3個階段的母乳中共檢測到9種維生素A酯。其中初乳中檢測到了5種維生素A酯,棕櫚酸視黃醇酯(C16∶0)和二十四酸視黃醇酯(C24∶0)的含量相對較高。過渡乳中檢測到了8種維生素A酯,十五碳烯酸視黃醇酯(C15∶1)、硬脂酸視黃醇酯(C18∶0)和二十四酸視黃醇酯(C24∶0)的含量相對較高。成熟乳中檢測到了5種維生素A酯,棕櫚酸視黃醇酯(C16∶0)和二十四酸視黃醇酯(C24∶0)的含量相對較高。3個泌乳階段均檢測到了棕櫚酸視黃醇酯(C16∶0)、十七碳烯酸視黃醇酯(C17∶1)、硬脂酸視黃醇酯(C18∶0)、二十四酸視黃醇酯(C24∶0)。HARRISON[16]研究發(fā)現(xiàn),在維生素A含量充足的情況下,人體內(nèi)的視黃醇酯形式主要為棕櫚酸視黃醇酯和硬脂酸視黃醇酯。而母乳中除了這2種維生素A酯含量較高外,發(fā)現(xiàn)二十四酸視黃醇酯(C24∶0)是整個泌乳階段中含量最高的維生素A酯,這說明母乳中視黃醇酯存在形式可能與人體內(nèi)略有差異,以此滿足嬰幼兒生長初期的特殊營養(yǎng)需要。

圖3 不同泌乳期母乳中的不同結(jié)構(gòu)維生素A酯含量分布Fig.3 Distribution of different structural vitamin A esters in breast milk during different lactation periods

母乳中的常量脂肪酸包括油酸、亞油酸、棕櫚酸,它們約占母乳脂肪酸總量的70%左右[21]。但是研究在母乳中僅發(fā)現(xiàn)了部分棕櫚酸視黃醇酯(C16∶0)及硬脂酸視黃醇酯(C18∶0),并未發(fā)現(xiàn)油酸視黃醇酯(C18∶1)與亞油酸視黃醇酯(C18∶2)。本課題組在進行膽固醇酯組成分布時也觀察到相似情況,母乳中含量較高的常量脂肪酸組分相對應的膽固醇酯含量并不高[12]。這可能是因為在嬰幼兒生長發(fā)育初期,身體器官快速發(fā)育,需要大量能量供給。因此母乳中的大部分脂肪酸會選擇性結(jié)合甘油sn-2位的羥基,這種分布位點有利于嬰兒吸收利用,更好地提供能量以供生長發(fā)育[22]。

母乳中的維生素A酯以及甘油酯的脂肪酸組成可以在一定程度上影響母乳的營養(yǎng)成分和理化性質(zhì)。采用SPSS 27.0對不同階段母乳中的9種維生素A酯含量進行主成分分析。首先標準化(Z-score法)處理原始數(shù)據(jù),通過KOM檢驗法和Bartlett球體檢驗法進行因子分析的實用性檢驗。得到KOM值為0.779(≥0.6),Bartlett球體檢驗值為576.505,Sig值<0.001,說明主成分分析適用于研究母乳中的維生素A酯分布。由表2可知,提取前2個成分可以解釋全部維生素A酯的87.384%,因此提取這2個主成分分別記為Y1和Y2以反映母乳中各種維生素A酯對主成分載荷的相對大小和影響的方向。根據(jù)Y1和Y2主成分方程計算出主成分得分和以各個主成分方差貢獻率占2個主成分總方差貢獻率的比率為權重計算得到的綜合得分。表3得到的主成分得分及綜合得分可以看出主成分Y1得分較高的維生素A酯為二十四酸視黃醇酯(C24∶0)和十五碳烯酸視黃醇酯(C15∶1),主成分Y2得分較高的維生素A酯為棕櫚酸視黃醇酯(C16∶0)。

表2 主成分分析結(jié)果Table 2 Results of principal component analysis

表3 主成分得分及綜合得分Table 3 Principal component score and composite score

2.3 相關性分析

2.3.1 β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯的相關性分析

維生素A原類胡蘿卜素是人體攝入維生素A的重要途徑,其中β-胡蘿卜素占86%,是最主要的維生素A前體物質(zhì)[23]。β-胡蘿卜素在可溶性胞質(zhì)酶BCMO1的作用下分解代謝形成視黃醛,然后在視黃醛脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為視黃醇(維生素A),未被人體吸收利用的維生素A會以脂肪酸酯的形式貯存在肝星狀細胞中[24]。視黃酸可以通過負反饋機制調(diào)節(jié)β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化效率,從而控制人體內(nèi)維生素A水平。因此可知三者之間具有一定的相關性,通過SPSS 27.0軟件對母乳中三者的含量進行相關性分析,結(jié)果見表4。

表4 母乳中β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯與相關性分析Table 4 Analysis of the correlation between vitamin A, vitamin A esters, and β-carotene in breast milk

由表4可知,母乳中β-胡蘿卜素與維生素A之間顯著性概率值<0.001,說明二者在母乳中的含量變化具有顯著相關性;皮爾遜相關系數(shù)為0.416,說明二者存在較弱的正相關關系。可見在母乳中β-胡蘿卜素可以轉(zhuǎn)化為維生素A,且轉(zhuǎn)化情況受到負反饋機制動態(tài)調(diào)節(jié)影響,并不是單純的線性轉(zhuǎn)化關系。而維生素A酯與β-胡蘿卜素和維生素A之間均不具有相關性(顯著性>0.05),說明β-胡蘿卜素和維生素A并不是調(diào)節(jié)維生素A酯含量的主要因素。維生素A酯的含量變化受到飲食狀況、維生素A水平、脂質(zhì)水平、視黃醇酯水解酶等多種因素的影響,由于維生素A酯是維生素A在體內(nèi)的主要貯存形式,因此其含量也會受生長發(fā)育情況動態(tài)調(diào)節(jié),所以在3個母乳階段均處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài),并不會在單一條件的影響下產(chǎn)生顯著變化[25]。

2.3.2 各維生素A酯間的相關性分析

將不同泌乳階段下母乳中的各維生素A酯含量進行Z-score歸一化處理后,采用Pearson相關系數(shù)進行聚類熱圖分析,分析結(jié)果如圖4所示。母乳中的九類維生素A酯呈現(xiàn)出一定的聚類性,可以劃分為兩類。一類為棕櫚酸視黃醇酯(C16∶0)和二十碳五烯酸視黃醇酯(C20∶5),它們與其他7種維生素A酯大多無相關性,或呈負相關。另一類為剩下的7種維生素A酯,它們相互之間均呈顯著的正相關,其中辛酸視黃醇酯(C8∶0)、二十二酸視黃醇酯(C22∶0)、二十二碳烯酸視黃醇酯(C22∶1)兩兩之間的代謝關聯(lián)性最強,呈十分顯著正相關(P≤0.001),且具有極強的相關性(皮爾遜相關系數(shù)為0.91)。這說明在不同的泌乳階段下三者含量變化影響因素以及影響程度基本一致,但具體的內(nèi)在關聯(lián)性還需要進行更為深入的代謝組學研究。

圖4 九種維生素A酯的聚類熱圖分析Fig.4 Cluster heat map analysis of nine vitamin A esters

3 討論與結(jié)論

本研究利用UPLC/Q-TOF-MS檢測技術定性定量分析不同泌乳階段的母乳中β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯類物質(zhì)。在3個階段的母乳中共發(fā)現(xiàn)9種維生素A酯,其中初乳中檢測到了5種,過渡乳中檢測到了8種,成熟乳中檢測到了5種。通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)這9種維生素A酯中只有1種中鏈維生素A酯,其余8種都是長鏈維生素A酯,這說明長鏈視黃醇酯是維生素A酯在母乳內(nèi)的主要化學形式。通過定量分析發(fā)現(xiàn)母乳中含量較高的維生素A酯為棕櫚酸視黃醇酯(C16∶0)、硬脂酸視黃醇酯(C18∶0)和二十四酸視黃醇酯(C24∶0),其中二十四酸視黃醇酯(C24∶0)是整個泌乳階段中含量最高的維生素A酯,說明母乳中視黃醇酯存在形式具有獨特性,以此滿足嬰幼兒生長初期的特殊營養(yǎng)需要。

利用SPSS 27.0分別對3個泌乳階段的母乳中β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯含量進行差異性分析,發(fā)現(xiàn)在95%的置信度下不同泌乳階段的β-胡蘿卜素和維生素A含量均具有顯著差異(P<0.05),且隨著泌乳期的延長逐漸減少,而維生素A酯在3個泌乳階段間不具有顯著差異,說明隨著泌乳期的延長維生素A酯含量較為穩(wěn)定。對三者間含量進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素與維生素A含量變化呈現(xiàn)正相關關系(皮爾遜相關系數(shù)為0.416),維生素A酯含量與另外2種物質(zhì)并不具有相關性。以此推測母乳中β-胡蘿卜素與維生素A含量變化受到負反饋機制動態(tài)調(diào)節(jié)影響,而維生素A酯含量受多種因素影響,并不會在單一條件的影響下產(chǎn)生顯著變化。對9種維生素A酯進行主成分分析提取出2個主成分可以解釋全部維生素A酯的87.384%,聚類熱圖分析也發(fā)現(xiàn)母乳中的維生素A酯可以大致分為兩類,其中7種維生素A酯間呈顯著的正相關,另外2種與它們大多無相關性,或呈負相關。本項研究主要分析了不同泌乳階段的母乳中β-胡蘿卜素、維生素A及維生素A酯含量變化以及相互關系,為嬰幼兒配方食品的配方研發(fā)提供借鑒與參考。同時,母乳中不同維生素A酯之間表現(xiàn)出一定的相關性,但它們的關聯(lián)性依據(jù)及影響因素還需要進一步研究。