氣相色譜-質(zhì)譜法分析武都花椒揮發(fā)性成分及特征指紋圖譜的建立

侯瑩瑩,張宏杰,馬君義*,朱建朝,繆欣,賀清艷

1(西北師范大學 生命科學學院,甘肅 蘭州,730070)2(隴南市經(jīng)濟林研究院核桃研究所,甘肅 武都,746000)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)為成熟干燥的果皮,藥食兩用,具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗凝血和抗氧化等藥理作用[1-3]。在甘肅、陜西、四川、貴州等省份有較大規(guī)模種植。研究表明花椒主要含有揮發(fā)性成分、酰胺類物質(zhì)、生物堿、黃酮和脂肪酸等成分,其中花椒的揮發(fā)性成分主要包括醇類、萜烯類、酯類、烷類等化合物[4-6],與花椒的抑菌殺菌[7]、殺蟲[8]、抗氧化[9]、抗癌[10]等作用有關(guān)。

隴南武都花椒種植面積高達100萬畝,年產(chǎn)量3 500萬斤,花椒總產(chǎn)值達39億,被譽為“中國花椒之都”。武都花椒種植歷史悠久,但由于自然雜交、自身變異及人為因素的影響導致了花椒品種混淆、不易分辨,同時市場上也存在同物異名、同名異物及以次充好的現(xiàn)象,給消費者帶來很多困擾和損害。目前鑒定和評價武都花椒品質(zhì)的主要方法主要有理化指標、感官評審等,缺乏客觀的評價依據(jù)。因此,亟需建立一種綜合評價武都花椒的整體質(zhì)量,又能區(qū)別于其他產(chǎn)區(qū)花椒產(chǎn)品的有效途徑,為隴南優(yōu)質(zhì)花椒品牌創(chuàng)建提供依據(jù)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)常用來分析揮發(fā)性物質(zhì),如樊丹青等[11]采用GC-MS對甘肅、四川等6個產(chǎn)地紅花椒的揮發(fā)性成分含量及組成進行分析對比,陳光靜等[12]采用GC-MS對陜西、甘肅、四川3個省8個產(chǎn)地的紅花椒揮發(fā)物的化學組分和含量進行分析比較;而指紋圖譜是運用光譜、色譜等儀器檢測出能反映食品內(nèi)部特征的圖譜,強調(diào)對研究對象“共有特征性”的研究,并在共有特性中尋找個性差異,具有整體性、系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性的特點,在食品的產(chǎn)地識別、品質(zhì)檢測、品種分類等方面發(fā)揮著重要作用[13-15]。本文采用GC-MS對隴南武都16個品種的花椒揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測、分析,聚類分析和主成分分析進行分類評價,建立指紋圖譜,并用相似度分析驗證,從而建立一套完整、全面綜合的武都花椒果皮香味物質(zhì)評估體系,為武都花椒產(chǎn)地識別、品質(zhì)檢測、品種分類、進化關(guān)系及其有效應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隴南武都屬于北亞熱帶干熱河谷區(qū),干燥度為0.5～2,平均氣溫為14.6 ℃,≥10 ℃的積溫4 568.7 ℃,年日照時間1 911.7 h,土壤pH 6.5～7.5,年降水量為450～500 mm,符合花椒樹耐旱喜光的生長特點。

16個花椒樣品均采自隴南市經(jīng)濟林研究院花椒研究所花椒種質(zhì)資源基因庫,且培育條件相同,花椒果實均為正常生長發(fā)育的成熟果實,采摘時間如表1所示。石油醚、無水硫酸鈉,分析純;實驗用水為超純水。

表1 實驗材料Table 1 Experimental materials

1.2 儀器與設(shè)備

Baygene BG-Qspin微型離心機,無錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司;AL/AS1310與TRACE1300 ISQ自動進樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TR-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弱極性彈性石英毛細管色譜柱、0.45 μm有機系微孔濾膜,美國Thermo Scientific。

1.3 實驗方法

1.3.1 花椒揮發(fā)性物質(zhì)的制備

在羅凱等[16]提取方法的基礎(chǔ)上進行修改,精密稱取各樣品3.000 g于安瓿瓶中,加入10 mL石油醚浸泡,120 W超聲條件下提取15 min,傾出浸提液,無水硫酸鈉脫水干燥,5 000 r/min離心5 min,取上清液進樣分析。

1.3.2 GC-MS分析方法

GC條件:TR-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);采用程序升溫法:起始溫度50 ℃保持1 min,以3 ℃/min升溫到至100 ℃,保持2 min,再以8 ℃/min升溫到250 ℃,保持2 min。進樣量1 μL,分流比200∶1,進樣口溫度280 ℃,載氣流速1 mL/min。

MS條件:溶劑延遲3 min,離子源溫度250 ℃,掃描范圍50～650m/z。

樣品經(jīng)GC-MS分析后,利用NIST11版標準質(zhì)譜檢索庫進行定性分析,并進一步利用保留指數(shù)法對花椒提取物的主要成分進行定性驗證。

1.3.3 參照峰的選擇

建立指紋圖譜的第一步是找到參照峰和特征峰,一般選擇峰面積較大且相對穩(wěn)定的峰作為參照峰,特征峰則是根據(jù)色譜峰的保留時間來確定[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)保留時間為12.39 min的峰面積最大且相對穩(wěn)定作為參照峰,結(jié)合GC-MS分析發(fā)現(xiàn)此峰對應(yīng)的化合物為檸檬烯。將參照峰的保留時間和峰面積皆定為1,其他峰的相對峰面積為該峰峰面積與參照峰峰面積之比。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”構(gòu)建指紋圖譜,IBM SPSS Statistic 23.0軟件進行相似度分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考查結(jié)果

2.1.1 精密度試驗

稱取組培梅花椒(ZPMHJ)樣品,在“1.3.1”節(jié)條件下制備供試品,依“1.3.2”節(jié)條件測定,連續(xù)進樣5次,進樣量2 μm,以檸檬烯為參照峰(S),計算得到其他色譜峰的相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)值小于1%,相對峰面積的RSD值小于2%,說明該儀器精密度良好。

2.1.2 重復性試驗

精密稱取組培梅花椒(ZPMHJ)樣品3份,在“1.3.1”節(jié)下制備供試品溶液,依“1.3.2”節(jié)條件下檢測,每份重復檢測3次,以檸檬烯為參照峰(S),記算共有峰的相對保留時間和相對峰面積,測得相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于0.1%,結(jié)果表明該方法的重復性較好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“1.3.1”節(jié)下制備的組培梅花椒(ZPMHJ)供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h按“1.3.2”節(jié)色譜條件檢測,并以檸檬烯為參照峰(S),計算得出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 16個花椒品種的揮發(fā)性物質(zhì)成分的分析與鑒定

本研究在相同栽培環(huán)境下,對隴南武都的16個品種花椒樣品進行GC-MS測定分析,發(fā)現(xiàn)各花椒樣品的總離子流圖色譜峰分離較好且整體較相似,說明武都花椒樣品中的揮發(fā)性成分相近,揮發(fā)性物質(zhì)種類差別較小?；ń窊]發(fā)性成分包括醇類、烯烴類、酯類、酮類、醛類、烷烴類和苯類(圖1),共同構(gòu)成了花椒的香味物質(zhì)。16個花椒品種所測揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)量如圖2所示,結(jié)果表明醇類和烯烴類物質(zhì)不僅種類最多,其相對含量也最高,這些醇類和烯烴類化合物成分,具有明顯的香氣呈香特性,構(gòu)成了武都花椒香氣成分的重要特色。16個品種的花椒主要揮發(fā)性物質(zhì)D-檸檬烯、α-水芹烯、α-蒎烯、羅勒烯、芳樟醇、桉葉醇及乙酸芳樟酯的相對含量較高(表2),與霍歸國等[18]所測甘肅武都‘大紅袍’花椒的D-檸檬烯、芳樟醇和羅勒烯等主要特征成分的相對含量較高的結(jié)果一致。但花椒揮發(fā)性成分的相對百分含量之間存在著差異,說明各揮發(fā)性成分對武都花椒的香味貢獻大小存在著差異,如云華七葉青(YHQYQ)相對含量最高的揮發(fā)性化合物是芳樟醇,而D-檸檬烯在其他花椒品種相對含量最高。云華七葉青(YHQYQ)和漢源青椒(HYQJ)均為青花椒,相對含量也存在差異,可能是地域接壤、地域相近的地區(qū)的花椒生長環(huán)境差別小,而較遠地區(qū)的花椒由于長期地域環(huán)境差異而產(chǎn)生較大的自然變異[19],也可能是因為花粉的傳播造成種源遺傳信息的混合,促進了種源間的基因交流有關(guān)[20]。

圖1 不同品種花椒所含揮發(fā)性成分堆積圖Fig.1 The accumulation diagram of volatile components in different kinds of Zanthoxylum bungeanum

圖2 不同品種花椒所含揮發(fā)性成分數(shù)量Fig.2 Number of volatile components in different varieties of Zanthoxylum bungeanum

表2 不同品種花椒主要揮發(fā)性物質(zhì)相對含量Table 2 Relative contents of main volatile components in different cultivars of Zanthoxylum bungeanum

2.3 16種花椒揮發(fā)性物質(zhì)的聚類分析

為了建立穩(wěn)定的花椒指紋圖譜,需要排除揮發(fā)性成分和含量差異較大的花椒樣品,實驗中采用GC-MS對花椒揮發(fā)性成分進行分析,將16種花椒揮發(fā)性物質(zhì)的共有峰面積為原始數(shù)據(jù)導入SPSS 22.0軟件,以系統(tǒng)聚類法結(jié)合歐氏距離(d)為測度獲得花椒揮發(fā)性成分聚類譜系圖,如圖3所示。d=10時,16個花椒樣品可聚為兩類,云華七葉青(YHQYQ)為單獨一類,可能與云華七葉青的芳樟醇的含量最高有關(guān);d=5時,后一類又可聚為兩類,林州大紅袍(LZDHP)、長把子(CBZ)、實生大紅袍(SSDHP)、秦安一號(QAYH)、漢源青椒(HYQJ)、無刺大紅袍母株(WCDHPMZ)聚為一類,嫁接無刺大紅袍(JJWCDHP)、組培梅花椒(ZPMHJ)、嫁接梅花椒(JJMHJ)、茂汶大紅袍(MWDHP)、郭嘉大紅袍(GJDHP)、韓城無刺(HCWC)、七月椒(QYJ)、獅子頭(SZT)、八月椒(BYJ)為一類。聚類分析將16個品種的花椒進行分類,得到不同品種的花椒在揮發(fā)性物質(zhì)上存在差異,但從整體上看,不存在差異性較大的品種,這與花椒所處于相同的地理位置和栽培環(huán)境具有一定的相關(guān)性,也可能與長期以來人為地從不同種源地進行引種有關(guān),從而造成種源遺傳信息的混合,促進了種源間的基因交流有關(guān)[21]。聚類分析結(jié)果表明,花椒親緣關(guān)系與化學成分相似性存在一定的關(guān)系,16個花椒中不存在差異性較大的品種,滿足構(gòu)建指紋圖譜的要求。

圖3 不同品種花椒聚類分析Fig.3 Cluster analysis in different kinds of Zanthoxylum bungeanum

2.4 16種花椒揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析

主成分分析利用降維的思想,將原來多個變量通過線性轉(zhuǎn)變?yōu)閹讉€較少變量的一種多元統(tǒng)計方法。將16種花椒樣品共有揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積數(shù)據(jù)導入IBM SPSS Statistic 22.0軟件中,選擇分析-降維-因子分析,得到其特征值和方差貢獻率,結(jié)果可知,特征值大于1的主成分有3個,累計貢獻率為80.24%,表明3個主成分能夠較好反映出16種花椒揮發(fā)性成分的基本特征值和主要信息,具有良好的代表性。

如圖4所示,由空間散點的距離可知,云華七葉青(YHQYQ)為單獨一類,林州大紅袍(LZDHP)、長把子(CBZ)、實生大紅袍(SSDHP)、秦安一號(QAYH)、漢源青椒(HYQJ)、無刺大紅袍母株(WCDHPMZ)距離較為相近,聚為一類,嫁接無刺大紅袍(JJWCDHP)、組培梅花椒(ZPMHJ)、嫁接梅花椒(JJMHJ)、茂汶大紅袍(MWDHP)、郭嘉大紅袍(GJDHP)、韓城無刺(HCWC)、七月椒(QYJ)距離相近聚為一類,獅子頭(SZT)、八月椒(BYJ)聚為一類,這與聚類結(jié)果相一致,進一步說明2種分析方法的結(jié)果較為一致,16種花椒滿足現(xiàn)行構(gòu)建指紋圖譜的要求。

圖4 花椒樣品揮發(fā)性成分的PCA得分圖Fig.4 PCA score plot of volatile components in Zanthoxylum bungeanum

2.5 指紋圖譜的構(gòu)建

2.5.1 指紋圖譜測定

將16種花椒色譜峰的保留時間和峰面積等參數(shù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A版),經(jīng)多點校正后進行色譜峰匹配生成指紋圖譜(圖5)。結(jié)果顯示,在35 min內(nèi)出峰較多,對圖譜進行比較、分析,最終篩選出11個共有峰為指紋峰,由于2號峰(D-檸檬烯)峰面積最大,分離最好且最穩(wěn)定,設(shè)定為參照峰,將保留時間和峰面積設(shè)為1,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,結(jié)果表明16種花椒揮發(fā)性成分的GC-MS指紋圖譜共有峰的相對保留時間差別較小,RSD在1.8%～4.41%,說明16種花椒樣品揮發(fā)性特征成分基本相同;但共有峰的相對峰面積差別較大,RSD在30.35%～169.96%,說明16種花椒果皮揮發(fā)性物質(zhì)的主要特征成分含量差別較大?？赡苁且驗榛ń窊]發(fā)性成分含量隨品種、栽培條件、成熟時間、遺傳背景、貯藏和提取方法的不同而不同有關(guān)[22-24]。

圖5 不同品種花椒揮發(fā)性成分的GC-MS 指紋圖譜Fig.5 GC-MS fingerprinting of volatile components in different kinds of Zanthoxylum bungeanum

所建立的白龍江武都區(qū)段花椒指紋圖譜不同于葉洵等[25]以漢源花椒、武都花椒及茂縣花椒的10批樣品建立的GC-MS指紋圖譜,漢源花椒歸為一類,茂縣與武都花椒聚為一類;不同于課凈璇等[26]以17個不同產(chǎn)區(qū)的花椒為樣品建立花椒揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜,紅花椒和青花椒之間存在明顯差異;說明武都區(qū)段16個品種的花椒在品種之間具有一定相似性,這與處于相同的栽培環(huán)境相關(guān)。利用NIST11譜庫的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行檢索,為驗證質(zhì)譜檢索結(jié)果,并對花椒的主要揮發(fā)性組分進行了保留指數(shù)定性,11種化合物主要為3種烯烴類、5種醇類、1種脂類和2種烷類,按出峰時間依次為α-水芹烯、D-檸檬烯、順式-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己醇、芳樟醇、萜品烯-4-醇、乙酸-4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、乙酸芳樟酯、乙酸-α,α,4-三甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醇、順式-α-法呢烯、(E,Z)-5,6-雙(2,2-二甲基亞丙基)-癸烷、二十一烷。不同于葉洵等[25]、課凈璇等[26]所測共有峰物質(zhì),11種物質(zhì)可作為白龍江武都區(qū)段花椒的特征性物質(zhì)。

2.5.2 相似度分析

本研究采用夾角余弦和皮爾遜相關(guān)系數(shù)對各色譜峰進行相似度分析,結(jié)果見表3。夾角余弦法的結(jié)果在0.938 0～0.988 5,相關(guān)系數(shù)法的結(jié)果在0.909 6～0.979 6,2種算法的結(jié)果都大于0.9,說明16種花椒樣品相似性較好,所得到的GC-MS標準指紋圖譜(R)能較全面地表述花椒GC-MS中有效成分的信息,故所構(gòu)建的16個品種的花椒的特征指紋圖譜信息具有可靠性。

表3 十六個品種花椒果皮香味物質(zhì)的相似度Table 3 Similarity of peel aroma components in 16 varieties of Zanthoxylum bungeanum

3 結(jié)論

16個品種花椒種植于隴南武都特定的生長區(qū)域,依賴于得天獨厚的地理環(huán)境和適宜的氣候條件,成為了區(qū)域特色農(nóng)產(chǎn)品。本研究對16種花椒揮發(fā)性成分進行分析,發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性成分相近,種類差別較小,按化學結(jié)構(gòu)性質(zhì)可分為醇類、烯烴類、酯類、酮類、醛類及苯類,其中醇類、烯烴類的成分數(shù)量較多,其相對含量也比較高。聚類分析和主成分分析結(jié)果顯示,不存在差異性較大的品種。GC-MS指紋圖譜標定了α-水芹烯、D-檸檬烯、順式-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己醇、芳樟醇、萜品烯-4-醇、乙酸-4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、乙酸芳樟酯、乙酸-α,α,4-三甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醇、順式-α-法呢烯、(E,Z)-5,6-雙(2,2-二甲基亞丙基)-癸烷、二十一烷物質(zhì)作為花椒的特征性物質(zhì)。結(jié)合夾角余弦和皮爾遜相關(guān)系數(shù)對各色譜峰進行相似度分析,結(jié)果表示兩者均在0.9以上,表明指紋圖譜建立的方法有效,可為武都花椒的產(chǎn)地識別、品質(zhì)檢測、品種分類、探討進化關(guān)系等等提供一定的科學依據(jù)。