基于RNA-Seq技術分析大腸埃希菌誘導陰道上皮細胞炎癥反應分子機制

王冬納?何淑明

【摘要】目的 研究大腸埃希菌感染誘導陰道上皮細胞炎癥反應的分子機制。方法 制備大腸埃希菌刺激陰道上皮細胞炎癥反應模型，采用RNA測序（RNA-Seq）獲取對照組和大腸埃希菌刺激組間的差異表達基因譜，進而使用生物信息學分析差異表達基因的富集信號通路，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證測序結果。結果 在對照組和大腸埃希菌刺激組間共發(fā)現4 899個差異表達基因，其中上調和下調基因分別為1 531和 3 368個。基因本體論（GO）分析顯示，其功能富集在生物學行為控制模塊的血小板衍生生長因子結合和輔助因子結合、細胞組成模塊的內質網伴侶復合物，以及分子功能模塊的內質網折疊蛋白方面。京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析顯示這些基因富集于39條信號通路，如核因子-κB（NF-κB）通路。RT-qPCR結果與RNA-Seq結果一致，證實大腸埃希菌刺激組細胞TNF-α表達上調（P < 0.05）。結論 TNF-α調控NF-κB信號通路可能是大腸埃希菌誘導陰道上皮細胞炎癥反應關鍵分子機制。

【關鍵詞】RNA測序；大腸埃希菌；需氧菌性陰道炎；炎癥反應

Molecular mechanism of Escherichia coli-induced inflammatory response in vaginal epithelial cells using RNA-Seq analysisWang Dongna△， He Shuming. △The Second School of Clinical Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510280， China

Corresponding author， He Shuming， E-mail： 756497548@qq.com

【Abstract】Objective To investigate the molecular mechanism of inflammatory response in vaginal epithelial cells induced by Escherichia coli infection. Methods An inflammatory response model in vaginal epithelial cells stimulated by Escherichia coli was established. Then， differentially-expressed gene profiles between the control and Escherichia coli stimulation groups were obtained by RNA sequencing （RNA-Seq）. The enrichment signaling pathways of differentially-expressed genes were identified by bioinformatic analysis. The sequencing results were validated by quantitative fluorescent real-time PCR （RT-qPCR）. Results A total of 4899 differentially-expressed genes were found between the control and the Escherichia coli stimulation groups， including 1531 up-regulated genes and 3368 down-regulated genes. Gene Ontology （GO） showed that the functions of differentially-expressed genes were dominantly enriched in platelet-derived growth factor binding and co-receptor binding in the biological process term， endoplasmic reticulum chaperone complex in the cellular component term and protein folding in endoplasmic reticulum in the molecular functional term， respectively. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） showed that these differentially-expressed genes were enriched in 39 signaling pathways， such as the NF-κB signaling pathway. The upregulation of differentially-expressed gene TNF-α was validated by RT-qPCR （P < 0.05）， which was consistent with the RNA-Seq results. Conclusion TNF-α regulating the NF-κB signaling pathway is a critical molecular mechanism of Escherichia coli-induced inflammatory response in vaginal epithelial cells.

【Key words】RNA sequencing； Escherichia coli； Aerobic vaginitis； Inflammatory response

需氧菌性陰道炎與胎兒感染、性交困難和早產有關，是育齡婦女最常見的生殖道感染之一。目前，臨床上對于需氧菌性陰道炎治療主要采取抗菌治療、益生菌以及局部雌激素治療等，尚未達成最佳治療方案共識，其發(fā)病分子機制及干預靶點有待進一步研究［1］。需氧菌性陰道炎的發(fā)生與陰道菌群失調有關。陰道失去以乳酸菌為主的菌群生態(tài)，出現異常陰道菌群，其中以大腸埃希菌最為常見，占比7.5%；其他菌群次之，如金黃色葡萄球菌占4.5%［2-3］。宋伶俐等［4］研究也表明，需氧菌性陰道炎中以大腸埃希菌為最多見的需氧菌。需氧菌性陰道炎表現為明顯的陰道炎癥和陰道上皮破壞。異常需氧菌明顯增加與陰道炎癥密切相關。研究表明，需氧菌性陰道炎患者陰道IL-1β和IL-10升高［5］。人陰道上皮細胞在大腸埃希菌刺激下，VK2/E6E7的Toll樣受體2（TLR2）、TLR4和核因子-κB（NF-κB）表達上調，表明需氧菌性陰道炎常見致病菌可刺激陰道上皮細胞釋放炎癥因子［6］。然而，需氧菌性陰道炎的炎癥反應分子機制尚未完全闡明。本研究采用RNA測序（RNA-Seq）技術，研究大腸埃希菌刺激陰道上皮細胞炎癥反應的差異表達基因譜，并采用生物信息學手段分析差異表達基因功能和參與調控信號通路，為治療需氧性陰道炎的非抗菌性措施提供潛在干預靶點。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)及處理

人陰道上皮細胞VK2/E6E7細胞由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司提供。采用添加胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）和雙抗（青霉素和鏈霉素，100 U/mL，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，中國）的Keratinocyte-sFM（Thermo Fisher公司，美國）在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。取對數生長期細胞在細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)過夜后，隨機分為對照組（Con組）和大腸埃希菌感染組（E. coli I組）。

E. coli I組加入大腸埃希菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，中國）與細胞共孵育24 h，同時Con組加入等量生理鹽水。大腸埃希菌的感染復數為100。

二、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測

細胞處理結束后，采用高純度總RNA快速提取試劑盒（BIOTEKE，中國）提取總RNA和HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒（Vazyme，中國）

進行RT-qPCR檢測。然后采用HieffTM qPCRSYBR? Green Master Mix試劑盒［翊圣生物科技（上海）股份有限公司，中國］準備20 μL反應體系：ddH2O 7.4 ?L，

SYBR反應預混液10 ?L，模板DNA 1 ?L和引物

1.6 ?L。qPCR在熒光定量PCR儀（杭州博日科技有限公司，中國）上進行，反應參數為：預變性94 ℃，

1 min；40個循環(huán)（變性94 ℃ 15 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s）。引物序列為：IL-1β（產物長度為118 bp），正向5′-CCTATGTCTTGCCCGTGGAG-3′，反向5′-CACACACTAGCAGGTCGTCA-3′；IL-6（產物長度為

175 bp），正向5′-TGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGC-3′， 反向5′-CGGAACTCCAGAAGACCAGA-3′；TNF-α（產物長度為144 bp），正向5′-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3′，反向5′-GTTTGCTACGACGTGGGCTA-3′；ACTB（產物長度為171 bp），正向5′-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCCT-3′，反向5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCT-3′。

三、RNA-Seq

RNA-Seq由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司完成?；玖鞒倘缦拢翰捎肦Neasy Mini Kit（QIAGEN，中國）提取對照組和大腸埃希菌感染組細胞的總RNA。在確定RNA總量和完整性符合標準后，采用磁珠富集mRNA并對mRNA片段化。然后采用VAHTS mRNA-Seq V3 Library Prep Kit for Illumina（Vazyme，中國）構建轉錄組文庫。經過純化和PCR擴增后，在Illunima Novaseq 6000 高通量測序儀進行PE150測序，下機得到樣本的Fastq格式的堿基序列。

四、生物信息學分析

完成上述RNA-Seq后，將所獲取的原始測序數據采用Fsatp軟件過濾。過濾處理后，采用FastQC（v0.11.5）去除低質量和拼頭序列，獲得清潔reads，采用bowtir2軟件（v2.2.9）去除殘留核糖體RNA（rRNA）和轉運RNA（tRNA）序列；過濾后的reads采用HIASAT2軟件（2.2.1）比對該物種的參考基因組，定位每條reads的位置；采用StringTie軟件（v2.1.5）對每個reads所在基因位置計數并將所有樣本結果合并。使用DESeq2軟件（1.30.1）進行組件差異分析，獲取差異表達基因譜，并對差異表達基因進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。

五、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 22.0分析研究數據。經Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，定量資料均符合正態(tài)分布，以表示，組間比較采用t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、大腸埃希菌刺激引導陰道上皮細胞炎癥反應

大腸埃希菌刺激24 h后，Con組和E. coli I組VK2/E6E7細胞中炎癥因子（IL-6和IL-1β）mRNA相對表達量比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05），提示大腸埃希菌誘導了陰道上皮細胞炎癥反應。見圖1。

二、測序質量評價

樣品經高通量測序后，Con組樣本1和樣本2得到讀序（reads總數分別為5.713×107條和5.451×107條），采用Fsatp軟件過濾后，得到高質量的干凈reads分別為5.675×107條和5.41×107條。E. coli I組樣本1和樣本2得到reads總數分別為5.342×107條和5.607×107條，過濾后分別得到5.308×107條和5.574×107條。所有樣品過濾后堿基總數占過濾前堿基總數的百分比均在98%以上。所有樣品過濾前和過濾后的質量值20（Q20）和質量值30（Q30）均大于90%。將過濾后reads進行核糖體和基因組比對。去除rRNA和tRNA的reads數后得到最終reads，所有樣品的最終reads占干凈reads百分比均大于99%，而基因組比對匹配reads的百分比均在97%以上。以上結果表明本研究獲取了高質量測序數據，為后續(xù)RNA-Seq分析提供保障。

三、差異表達基因分析

Con組和E. coli I組間共有4 899個差異表達基因。其中，上調基因1 531個（包括NF-κB信號通路相關基因），下調基因3 368個（包括囊性纖維化調節(jié)因子CFTR）。差異表達基因的火山圖和熱力圖見圖2A、B。

排在上調基因的前9位依次為TNF-α誘導蛋白6（TNFIP6）、蛇毒素1（VNN1）、蛇毒素3（VNN3）、卵透明帶糖蛋白（ZP4）、TRIM6-TRIM34、LOC105377989、LOC105377991、LOC107986515和水解酶結構域16B（ABHD16B），而Top10的下調基因分別為Gamma-丁基甜菜堿羥化酶1（BBOX1）、胰島素樣生長因子結合蛋白5（IGFBP5）、LOC105378231、Neurofilament Medium Chain（NEFM）、激肽素相關肽酶2（KLK2）、激肽素相關肽酶8（KLK8）、醛酮還原酶家族1成員B10（AKR1B10）、富亮氨酸重復神經元1（LRRN1）和磷脂酶A2 四類（ⅣF，即PLA2G4F）。見圖3。

四、差異表達基因的GO和KEGG富集分析

1. GO富集分析

GO功能性富集分析結果見圖4A，該結果顯示差異表達基因在生物行為調控（BP）板塊主要富集在血小板衍生生長因子結合和輔助因子結合等；在細胞組成（CC）模塊主要富集在內質網伴侶復合體和寡糖轉移酶復合體等；而在分子功能（MF）模塊則主要富集在內質網折疊蛋白和前列腺芽形成等。

2. KEGG富集分析

KEGG富集分析顯示差異表達基因富集的信號通路共計39條，前25條包括氮代謝、內質網蛋白加工、蛋白輸出、鞘磷脂生物合成——乳酸和新乳酸系列、PI3K-Akt信號通路、轉化生長因子-β信號通路、NF-κB信號通路和p53信號通路。NF-κB信號通路與炎癥反應密切相關。見圖4B。28個差異表達基因參與調控NF-κB信號通路。上調差異表達基因TNF-α在NF-κB信號通路的上游，通過信號級聯(lián)激活NF-κB信號通路，進一步促進TNF-α和其他炎癥因子釋放，如IL-1β，從而促進炎癥反應。

五、大腸埃希菌刺激對人陰道上皮細胞TNF-α mRNA表達的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，大腸埃希菌刺激人陰道上皮細胞后，TNF-α mRNA相對表達量上調，進一步驗證了RNA-Seq測序結果。見圖5。

討論

RNA-Seq技術能全面獲取生物樣本幾乎全部轉錄本序列信息，為篩選疾病相關候選基因的重要手段。本研究首次通過RNA-Seq技術分析大腸埃希菌誘導人陰道細胞炎癥反應的基因表達譜，結合生物信息學分析揭示差異表達基因的潛在生物學功能及其參與的信號通路。測序結果顯示，E. coli I組和Con組陰道上皮細胞間共有4 899個差異表達基因，其中下調基因占多數（3 368個），上調基因為1 531個。GO和KEGG分析顯示這些差異表達基因主要富集于39條信號通路，與多個細胞生物行為調控、細胞組成和分子功能密切相關。

炎癥反應是需氧菌性陰道炎的主要特征之一。NF-κB信號通路與炎癥反應密切相關［7］。研究表明，細菌性陰道炎大鼠陰道組織中TNF-α升高，NF-κB信號通路被激活，抑制該通路可改善陰道炎癥狀［8-9］。本研究顯示總計28個差異表達基因參與調控NF-κB信號通路，其中絕大部分為上調。KEGG信號通路圖可見TNF-α在NF-κB信號通路中發(fā)揮重要作用，它為該信號通路的關鍵上游基因之一，通過激活NF-κB而進一步促進TNF-α釋放，形成惡性循環(huán)，加重炎癥反應。本研究通過RT-qPCR驗證了測序結果，即大腸埃希菌刺激上皮細胞炎癥促進TNF-α基因表達。李會陽［6］研究也表明，大腸埃希菌刺激促進VK2/E6E7細胞的IL-1β、IL-6和TNF-α表達，激活NF-κB信號通路。因此，NF-κB信號通路可能為治療大腸埃希菌相關需氧菌性陰道炎提供治療靶點。

在排名前9位的上調基因當中，TNFIP6在蛋白酶網絡中發(fā)揮重要作用，與α間抑制蛋白（I alpha I）形成穩(wěn)定復合物，增強I alpha I的蛋白酶抑制活性。TNF-α和IL-1等炎癥因子可誘導TNFIP6表達，與骨關節(jié)炎和類風濕關節(jié)炎發(fā)生密切相關［10-11］。本研究顯示，差異表達基因富集于類風濕關節(jié)炎信號通路，進一步提示TNF-α在大腸埃希菌誘導人陰道上皮細胞炎癥反應扮演重要角色。目前尚未有研究表明TNFIP6是否參與需氧菌性陰道炎的炎癥反應，有待深入研究探討。

研究顯示，毛滴蟲感染下調人陰道內皮細胞CFTR表達，促進細胞內氯離子聚集，與滴蟲誘發(fā)陰道炎癥和免疫反應密切相關［12］。本研究顯示，CFTR為下調差異表達基因之一。CFTR通過增強TNF 1型相關死亡結構域蛋白（TRADD），從而抑制TNF-α介導NF-κB信號通路激活［13］。CFTR是否能成為干預需氧菌性陰道炎的靶點有待進一步研究揭示。

本研究通過RNA-Seq高通量測序，闡明大腸埃希菌刺激人陰道上皮細胞炎癥反應與對照細胞的差異表達基因譜及其潛在生物學功能與參與調控的信號通路，為進一步闡明大腸埃希菌介導的需氧菌性陰道炎的分子機制提供初步實驗依據。研究結果初步揭示CFTR及TNF-α等多個環(huán)節(jié)調控NF-κB信號通路是大腸埃希菌誘導陰道上皮細胞炎癥反應關鍵分子機制。其他差異表達基因及相應信號通路在需氧菌性陰道炎中的作用有待今后研究進一步闡明。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2023-05-08）

（本文編輯：林燕薇）