睡眠剝奪對(duì)豚鼠離焦性近視及視網(wǎng)膜多巴胺代謝的影響

楊雪莉 陳堯 關(guān)宇欣 袁超群 毛俊峰

作者單位：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院眼科中心 眼科學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410008

青少年近視率在全球范圍內(nèi)呈逐年增長趨勢，已成為影響青少年身心成長的重大公共衛(wèi)生問題，造成的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)不容忽視[1]。2018年7 月，教育部發(fā)布我國首份《中國義務(wù)教育質(zhì)量檢測報(bào)告》，四、八年級(jí)學(xué)生視力不良檢出率為36.5%、65.3%，部分地區(qū)四年級(jí)超過60%、八年級(jí)超過80%，其中近視眼占比90%以上。研究發(fā)現(xiàn)，近視對(duì)青少年的生理功能及情感功能具有負(fù)向影響，生存質(zhì)量顯著下降，不利于身心健康發(fā)展[2]。關(guān)于睡眠不足與近視的關(guān)系，宋逸等[3]對(duì)我國7～22歲261 832名漢族青少年進(jìn)行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)睡眠時(shí)間不足的青少年更易出現(xiàn)近視；Jee等[4]在韓國進(jìn)行的一項(xiàng)橫斷面研究也證實(shí)，睡眠時(shí)間與青少年近視呈負(fù)相關(guān)，睡眠時(shí)間每增加1 h、近視風(fēng)險(xiǎn)降低10%?？梢?，睡眠不足與青少年近視的形成密切相關(guān)，但睡眠不足是否影響近視形成及具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究利用已建立的豚鼠透鏡誘導(dǎo)性近視（Lens-induced myopia，LIM）模型，每天給予睡眠剝奪（Sleep deprivation，SD）干預(yù)，通過觀察3，4-二羥基苯乙酸（3, 4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）和酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）研究SD對(duì)豚鼠LIM模型中近視及視網(wǎng)膜近視相關(guān)信號(hào)因子多巴胺（Dopamine，DA）的影響，為探討SD與青少年近視形成的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2022 年3 月選取30 只21 日齡健康三色豚鼠（中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供），體質(zhì)量140～170 g，性別不限。所有豚鼠飼養(yǎng)在中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持室溫25 ℃，維持12 h光照/12 h循環(huán)（7:00AM—7:00PM），光照在480～520 Lx之間，予以正常視覺環(huán)境或LIM處理，可自由進(jìn)食飲水。本研究獲中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2020sydw0084），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和喂養(yǎng)遵循中國科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 主要試劑及儀器 DA標(biāo)準(zhǔn)品（#H8502，美國Sigma-Aldrich公司）、DOPAC標(biāo)準(zhǔn)品（#850217，美國Sigma-Aldrich公司）、兔抗TH多克隆抗體（ab137721，美國Abcam公司）、兔抗β-actin多克隆抗體（ab8227，美國Abcam公司）、BCA蛋白定量試劑盒（#C05-02001，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。AUT-SD-1S動(dòng)物睡眠剝奪儀（南京奧騰工程技術(shù)有限公司，原理：在實(shí)驗(yàn)籠內(nèi)采用間歇性剝奪桿旋轉(zhuǎn)進(jìn)行觸覺刺激干擾自由行為的豚鼠實(shí)現(xiàn)SD）、-6.00 D光學(xué)樹脂凹透鏡片（直徑為12 mm，內(nèi)弧曲率為9.61 mm，香港明達(dá)眼鏡鏡片有限公司）、ARK-510A電腦驗(yàn)光角膜曲率計(jì)（日本尼德克公司）、MD-2400S眼科A/B型超聲診斷儀（天津邁達(dá)醫(yī)學(xué)科技股份有限公司）、艾沃斯-V8 數(shù)字式照度計(jì)（武漢中測宏圖測量儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 分組處理 采用隨機(jī)數(shù)表法將豚鼠分為LIM組和LIM+SD組，每組15只。所有豚鼠右眼為離焦眼，配戴-6.0 D凹透鏡片14 d，制作LIM模型，對(duì)側(cè)未處理眼為自身對(duì)照眼。LIM+SD組豚鼠在配戴凹透鏡的同時(shí)，給予每天持續(xù)SD20 h（7:00AM—3:00AM）處理。研究SD對(duì)豚鼠離焦眼屈光發(fā)育和視網(wǎng)膜DA代謝的影響。

1.2.2 豚鼠LIM模型的制作 按照本課題組豚鼠LIM模型的建立方法[5]制作LIM模型，以右眼為實(shí)驗(yàn)眼，把自制鏡框縫合固定于眶周軟組織，-6.00 D凹透鏡片插入固定于鏡框之中，每日擦拭鏡片以保持其清潔。配戴凹透鏡片14 d后，采用電腦驗(yàn)光角膜曲率計(jì)測定角膜曲率半徑（精確到0.01 mm）和眼球屈光度，A型超聲儀測量眼軸長度（精確到0.01 mm），每眼測量3次，取平均值，評(píng)估眼球屈光狀態(tài)變化。隨后，腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死豚鼠，摘除眼球。

1.2.3 SD干預(yù)方式 LIM+SD組豚鼠放入AUT-SD-1S動(dòng)物睡眠剝奪儀中，每個(gè)剝奪儀箱體內(nèi)放入5只豚鼠。箱體材料是透明有機(jī)玻璃，圓柱形，直徑50 cm，高40 cm，底部是46 cm長的旋轉(zhuǎn)金屬桿，金屬桿轉(zhuǎn)速可以調(diào)節(jié)。箱體內(nèi)照明達(dá)到LIM造模條件，每天用數(shù)字式照度計(jì)測量箱體內(nèi)豚鼠眼水平面的光照度，控制在480～520 Lx之間，箱內(nèi)可以自由飲水及進(jìn)食。金屬桿轉(zhuǎn)動(dòng)模式控制在每間隔10 min旋轉(zhuǎn)3圈，轉(zhuǎn)速為1圈15 s，制作豚鼠SD模型。在配戴凹透鏡期間每天持續(xù)SD20 h，結(jié)束后移入正常飼養(yǎng)箱。

1.2.4 神經(jīng)視網(wǎng)膜DA、DOPAC含量的測定 每組各取8只豚鼠16個(gè)眼球，用于高效液相色譜電化學(xué)法測定神經(jīng)視網(wǎng)膜DA和DOPAC的含量（ng/mg），具體方法參見本課題組以前的研究[6]，并計(jì)算DOPAC/DA比值。操作大致如下：Hypersil ODS2色譜柱（5 μm，250 mm × 4.6 mm），流動(dòng)相流速20 mmol/L，檸檬酸三鈉（含5 mmol/L庚烷磺酸和0.1 mmol/LEDTA，pH值為3.7），甲醇（體積比90:7），流速1.0 ml/L，柱溫箱溫度35 ℃，電化學(xué)檢測器工作電壓+750 mV，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.5 視網(wǎng)膜TH蛋白分布的檢測 每組各取2只豚鼠4 個(gè)眼球進(jìn)行視網(wǎng)膜TH蛋白檢測。將眼球置于10%中性甲醛中固定，石蠟包埋，制作5 μm厚切片，用于免疫組織化學(xué)染色，一抗是兔抗TH多克隆抗體（1:200）。染色后切片，采集圖像。

1.2.6 視網(wǎng)膜TH蛋白表達(dá)的檢測 每組各取5 只豚鼠10個(gè)眼球用于Western blot檢測。取視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層標(biāo)本，稱質(zhì)量，剪碎。加入細(xì)胞裂解液勻漿，離心后取上清液凍存。BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取蛋白樣品25 μg，進(jìn)行Western blot檢測，一抗是兔抗TH多克隆抗體（1:1 000）。利用Bandscan5.0 圖象分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作內(nèi)參，計(jì)算TH蛋白的相對(duì)表達(dá)量。TH蛋白相對(duì)表達(dá)量＝TH條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。通過SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，以±s表示。豚鼠左右眼角膜曲率半徑、眼球屈光度、眼軸長度、視網(wǎng)膜DOPAC含量、DA含量及DOPAC/DA比值、視網(wǎng)膜TH蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，LIM組與LIM+SD豚鼠組間角膜曲率半徑、屈光度、DOPAC含量和DA含量等屈光參數(shù)和神經(jīng)遞質(zhì)含量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。離焦眼視網(wǎng)膜DA含量分別與眼球屈光度、眼軸長度進(jìn)行相關(guān)分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD對(duì)豚鼠離焦性近視眼屈光狀態(tài)的影響

L I M 組豚鼠自身對(duì)照眼出現(xiàn)輕度遠(yuǎn)視（1.30±0.65）D，眼軸長度為（7.98±0.08）mm，角膜曲率為（3.56±0.05）mm。與自身對(duì)照眼比較，LIM組離焦眼眼軸延長為（8.36±0.08）mm（t=70.33，P＜0.001），形成近視眼為（-1.87±0.72）D，相對(duì)近視度數(shù)為3.17 D（t=-30.04，P＜0.001）。LIM+SD組和LIM組之間離焦眼相比較，LIM+SD組眼軸延長更大（8.48±0.09）mm、近視程度更深（-3.47±0.83）D，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.87，P=0.001；t=5.63，P＜0.001）。LIM+SD組和LIM組之間自身對(duì)照眼相比較，眼軸長度（8.01±0.06）mm和屈光度（+1.23±0.68）D，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。角膜曲率半徑在LIM組和LIM+SD組的組間及組內(nèi)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 SD對(duì)豚鼠離焦性近視眼視網(wǎng)膜DA、DOPAC含量的影響

LIM組豚鼠自身對(duì)照眼視網(wǎng)膜DA、DOPAC含量分別為（1.55±0.32）ng/mg、（0.92±0.17）ng/mg，與LIM+SD組自身對(duì)照眼比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與自身對(duì)照眼相比，LIM組及LIM+SD組離焦眼的視網(wǎng)膜DA、DOPAC含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LIM組：t=-8.64，P＜0.001；t=-13.03，P＜0.001；LIM+SD 組：t=-11.72，P＜0.001；t=-16.32，P＜0.001）。LIM組和LIM+SD組組間的DA、DOPAC差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.35，P＜0.001；t=3.80，P=0.002）。豚鼠離焦眼視網(wǎng)膜DA含量與屈光度（r=0.93，P＜0.001）、眼軸長度（r=-0.77，P=0.001）均有相關(guān)性。

視網(wǎng)膜DOPAC/DA比值在LIM組和LIM+SD組自身對(duì)照眼之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LIM組和LIM+SD組離焦眼視網(wǎng)膜DOPAC/DA比值均低于自身對(duì)照眼，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LIM組：t=-9.55，P＜0.001；LIM+SD組：t=-6.58，P＜0.001）。與LIM組比較，LIM+SD組離焦眼視網(wǎng)膜DOPAC/DA比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.60，P=0.003）。

2.3 SD對(duì)豚鼠離焦性近視眼視網(wǎng)膜TH蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，TH陽性反應(yīng)細(xì)胞主要分布在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層，外叢狀層可見少量著色；與自身對(duì)照眼相比，LIM組和LIM+SD組離焦眼視網(wǎng)膜TH蛋白均減弱（見圖1）。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，LIM組和LIM+SD組視網(wǎng)膜TH蛋白表達(dá)均低于自身對(duì)照眼，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LIM組：t=-40.25，P＜0.001；LIM+SD組：t=-17.64，P＜0.001）；但2組離焦眼之間視網(wǎng)膜TH蛋白的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.333），自身對(duì)照眼之間的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.246）（見圖2）。

圖1.免疫組織化學(xué)染色法檢測豚鼠視網(wǎng)膜TH蛋白表達(dá)Figure 1.Immunohistochemical staining of TH protein in the retina of guinea pigs

圖2.SD對(duì)豚鼠視網(wǎng)膜TH蛋白含量的影響Figure 2.Effects of SD on TH proteins in the retina of guinea pigs

3 討論

目前嚙齒類動(dòng)物廣泛應(yīng)用于睡眠研究當(dāng)中，豚鼠出生時(shí)其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相對(duì)完善，1 周后睡眠-覺醒周期即呈現(xiàn)成年豚鼠的睡眠模式，常用于睡眠的神經(jīng)生理學(xué)及睡眠-覺醒機(jī)制研究。予以豚鼠SD 6 h即可表現(xiàn)為明顯的非快速眼動(dòng)睡眠增加，慢波睡眠增強(qiáng)，睡眠碎片化程度增加[7]。我們?cè)谝延械腖IM模型基礎(chǔ)上，每天給予SD 20 h，建立豚鼠LIM+SD模型，發(fā)現(xiàn)SD可顯著加深離焦眼近視程度，延長眼軸，但對(duì)于自身對(duì)照眼的屈光狀態(tài)并無影響，表明SD在豚鼠離焦眼中加速近視進(jìn)展，對(duì)正常屈光狀態(tài)眼的屈光發(fā)育無影響，即單獨(dú)SD并不能誘導(dǎo)豚鼠正常眼形成近視。在隨后的近視相關(guān)因素研究中，我們發(fā)現(xiàn)SD會(huì)加快LIM形成，LIM+SD組離焦眼的近視程度大于LIM組的離焦眼。因此，我們推測單純SD并不足以誘導(dǎo)豚鼠正常眼形成近視，但能增加豚鼠離焦眼對(duì)負(fù)透鏡引起的光學(xué)離焦信號(hào)的敏感性，從而促進(jìn)LIM形成。

DA是一種公認(rèn)的屈光發(fā)育調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，與抑制近視形成密切相關(guān)[8]。體內(nèi)DA由酪氨酸合成，TH和芳香族L-氨基酸脫羧酶參與催化輔助。其中TH是DA合成的限速酶，常被用作評(píng)估DA合成的重要指標(biāo)。在細(xì)胞質(zhì)中合成的DA被2 型囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，通過胞吐作用從DA能神經(jīng)元軸突末端釋放，并與靶受體作用，隨后被突觸間兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和單胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）降解為DOPAC或被突觸前膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Dopamine transporter，DAT）再攝取，通過2 型囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入囊泡中以重復(fù)利用[9]。DOPAC是DA的主要代謝產(chǎn)物，DOPAC/DA比值常作為評(píng)估DA分解代謝的敏感指標(biāo)，DOPAC/DA增加表示該組織區(qū)域DA能神經(jīng)元分解代謝旺盛、活性增強(qiáng)。在形覺剝奪性近視研究中發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜DA及DOPAC水平減低[10-11]，外源性予以DA或激動(dòng)/拮抗DA受體可有效抑制形覺剝奪性近視形成[12-14]；而減少小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)DA含量可使正常視覺發(fā)育小鼠產(chǎn)生近視屈光[15]。LIM中同樣如此，離焦眼視網(wǎng)膜DA含量顯著下降[16]，Thomson等[17]發(fā)現(xiàn)無論是給予玻璃體腔注射還是局部滴眼給藥，左旋多巴均可明顯延緩眼軸生長并呈現(xiàn)劑量依賴性顯著抑制LIM發(fā)展。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)LIM組和LIM+SD組豚鼠視網(wǎng)膜DA含量均低于自身對(duì)照眼，且LIM+SD組視網(wǎng)膜DA含量較LIM組更低，離焦眼視網(wǎng)膜DA含量與屈光度、眼軸長度均具有相關(guān)性，表明視網(wǎng)膜DA含量降低不但參與豚鼠LIM形成過程，還在SD促進(jìn)豚鼠LIM形成中發(fā)揮作用。我們進(jìn)一步檢測了視網(wǎng)膜TH蛋白和DOPAC含量的變化，觀察豚鼠視網(wǎng)膜DA合成及分解代謝的變化，分析豚鼠LIM視網(wǎng)膜DA含量變化的原因，發(fā)現(xiàn)LIM組和LIM+SD組之間離焦眼視網(wǎng)膜TH蛋白表達(dá)無顯著性差異，但LIM+SD組DOPAC/DA比值高于LIM組，表明SD對(duì)視網(wǎng)膜DA的合成代謝無明顯影響，但能引起視網(wǎng)膜DA分解代謝加快，是SD引起豚鼠LIM視網(wǎng)膜DA含量進(jìn)一步下降的原因，促進(jìn)LIM的進(jìn)展。

但是SD引起視網(wǎng)膜DA含量下降，繼而促進(jìn)豚鼠LIM形成及進(jìn)展的具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。一方面可能與下丘腦-垂體-腎上腺軸激活和各種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)[18]相互作用有關(guān)，如SD可改變?nèi)ゼ啄I上腺素能、5-HT能傳遞等，增加神經(jīng)元放電率，增加DA傳遞[19-20]；另一方面，DAT定位于多巴胺能神經(jīng)元突觸前膜，參與維持神經(jīng)元內(nèi)外DA穩(wěn)態(tài)，也參與了睡眠-覺醒穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，SD可顯著降低DAT可用性[21-22]，另外SD已被證明可降低紋狀體D2受體活性，減弱對(duì)DAT轉(zhuǎn)運(yùn)功能的促進(jìn)作用[23-24]，其對(duì)視網(wǎng)膜多巴胺受體活性調(diào)節(jié)作用還有待研究；MAO是單胺類代謝的關(guān)鍵酶，DA主要由MAO轉(zhuǎn)化DOPAC，研究發(fā)現(xiàn)SD還可影響MAO活性，提高對(duì)DA激動(dòng)劑敏感性，促進(jìn)DA能神經(jīng)元傳遞[25]。由此可見，SD可通過降低DAT功能抑制DA向神經(jīng)元內(nèi)轉(zhuǎn)入以及改變MAO活性促進(jìn)DA轉(zhuǎn)換，增強(qiáng)DA能神經(jīng)元活動(dòng)。此外，SD引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等也可能在其中發(fā)揮作用[26]。除DA外，近視信號(hào)通路中轉(zhuǎn)化生長因子-β、類胰島素生長因子、視黃酸等[27]也扮演著重要角色，其與SD在近視的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性還有待進(jìn)一步關(guān)注和研究。

關(guān)于SD和近視進(jìn)展之間存在復(fù)雜關(guān)系的證據(jù)越來越多，本研究強(qiáng)調(diào)了SD對(duì)近視形成及進(jìn)展的促進(jìn)作用，可能通過提高DA代謝水平，增強(qiáng)DA能神經(jīng)傳遞降低DA含量，促進(jìn)近視進(jìn)展。本研究中存在以下幾點(diǎn)不足：第一，該項(xiàng)研究應(yīng)用豚鼠造模，在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生近視改變，然而人的眼睛生長發(fā)育較慢，其屈光改變和視網(wǎng)膜神經(jīng)回路不盡相同，甚至更加復(fù)雜，因此還需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃腕w外研究；第二，我們并沒有檢測DAT和MAO等相關(guān)因子濃度變化，尚需進(jìn)一步研究晝夜節(jié)律在近視中的作用機(jī)制及信號(hào)通路，有助于闡明以上觀察到的SD、近視和DA之間的關(guān)聯(lián)。此外，SD與視黃酸、轉(zhuǎn)化生長因子-β等其他近視相關(guān)信號(hào)因子關(guān)聯(lián)也將是今后關(guān)注的內(nèi)容，我們將進(jìn)一步探討SD在近視進(jìn)展中的作用和機(jī)制，為近視的預(yù)防和干預(yù)提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明楊雪莉：收集數(shù)據(jù)，參與選題設(shè)計(jì)、資料分析及解釋，撰寫論文，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。陳堯：參與選題設(shè)計(jì)和修改論文的結(jié)果結(jié)論。關(guān)宇欣、袁超群：參與收集數(shù)據(jù)，修改論文并參與編輯部修改意見的修改。毛俊峰：參與選題設(shè)計(jì)、資料分析解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論