深度測序技術(shù)在HIV感染并發(fā)眼內(nèi)機會感染臨床中的應(yīng)用

王羅梓怡 姜靖 王志良

作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院眼科，上海 200040

獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）又稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染所致。截至2022年末，全球罹患HIV/AIDS約3 840萬人，每年因AIDS死亡人數(shù)約65 萬人[1]。AIDS可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腸道、肺、肝、眼等多個器官，造成的并發(fā)癥大大降低患者生存質(zhì)量、縮短患者壽命。因此，HIV/AIDS及其相關(guān)并發(fā)癥對各科醫(yī)師而言仍然是1項嚴(yán)峻的全球性公共衛(wèi)生問題。

HIV相關(guān)眼部并發(fā)癥首次報道于1980 年，約70%艾滋病患者有眼部累及[2]。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（Highly active antiretroviral therapy，HAART）可有效抑制體內(nèi)病毒復(fù)制，但在規(guī)律HAART下，仍有20%～40%患者有眼部并發(fā)癥，包括由病毒直接侵襲引起的非感染性血管病變和免疫缺陷所致相關(guān)機會性感染，病原體復(fù)雜，臨床癥狀和體征多變，難以診斷鑒別。

快速準(zhǔn)確地鑒定病原體是治療HIV相關(guān)眼部感染、挽救視力、保住眼球的關(guān)鍵。由于眼球體積小，眼內(nèi)液中細(xì)胞含量少，取樣條件及數(shù)量有限，導(dǎo)致傳統(tǒng)培養(yǎng)、鑒定病原體存在一定困難[3]。PCR是目前最主要的分子生物學(xué)檢測方法，但存在樣品污染、定向性檢測需特異性引物等缺點。相比之下，mNGS僅憑極少細(xì)胞量即可對所有基因組序列進行廣譜、高通量、無偏移的檢測和分析，無需特異性引物，特別適用于培養(yǎng)和鏡下陰性的感染性眼病[4]，對HIV相關(guān)眼部機會性感染的早期診斷具有重要意義。筆者將分類介紹mNGS技術(shù)在并發(fā)眼內(nèi)機會性感染的AIDS患者進行無偏倚微生物檢測分析中的應(yīng)用。

1 NGS的基本原理

二代測序（Next generation sequencing，NGS）又稱為高通量測序或深度測序，1 次可對幾十萬到幾百萬條DNA片段進行序列測定和分析，主要包括全基因組測序（WGS）、靶向下一代基因測序（tNGS）和宏基因組下一代基因測序（mNGS）等。其中WGS主要為微生物基因組的測序和組裝，用于生物分型、流行病學(xué)、易感性預(yù)測和毒力分析等；tNGS則是在文庫準(zhǔn)備和測序之前使用篩選過程來富集感興趣的微生物序列，用于高細(xì)胞樣本中低數(shù)量的微生物序列[5]；而mNGS則具備高通量特性，同時對數(shù)百萬個核酸序列進行擴增和測序，一次性得到樣品中宿主和病原體的核酸序列，并與相應(yīng)基因數(shù)據(jù)庫中信息對比，進而鑒定出病原體，同時還可獲得與病原體分型、毒力特性和耐藥性、傳播軌跡等相關(guān)的線索，是一種無假設(shè)、無偏倚的廣譜檢測手段，也是目前NGS應(yīng)用于臨床病原體檢測的主要方法。

mNGS的檢測平臺眾多，如Illumia（San Diego，CA）的HiSeq、NovaSeq平臺，Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）的Ion Torrent平臺、BGI（Cambridge，MA）的BGISEQ平臺等[6]。不同平臺的檢測流程大致相同，一般分為樣本采集和運輸、核酸提取、文庫制備、生物信息學(xué)分析、結(jié)果解讀和生成報告，但硬件和軟件的差異仍然使mNGS檢測的設(shè)備操作和數(shù)據(jù)分析缺乏標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范和共識[7]。

2 NGS在HIV相關(guān)眼部機會性感染中的具體應(yīng)用

HIV的眼部機會性感染主要包括病毒感染、細(xì)菌感染、真菌感染和寄生蟲感染等。

2.1 病毒感染

2.1.1 CMVR 巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎（Cytomegalovirus retinitis，CMVR）是AIDS患者最常見的眼部機會性感染，也是引起視力下降最嚴(yán)重的原因。隨著HAART的普及，CMVR的發(fā)生率從30%降至22%[8]。根據(jù)病變的位置分為外周型、中心型和混合型。其典型眼底改變?yōu)檫M行性壞死性全層視網(wǎng)膜炎，眼底可見棉絨斑，伴不同程度的視網(wǎng)膜內(nèi)出血[9]，即“番茄奶酪樣病變”。

血清學(xué)抗體對診斷CMVR無幫助，抗體滴度陽性只可反映既往感染，不能作為CMVR活動性的標(biāo)志，陰性也不能完全排除CMVR，因AIDS患者的免疫抑制狀態(tài)使CMVR可能無法達(dá)到檢測的滴度。眼內(nèi)液PCR分析是目前眼內(nèi)CMVR感染的主要分子生物學(xué)檢測手段。但由于PCR需要使用病原體的特異性引物進行擴增，因此檢測往往是定向的。相比PCR，mNGS的高通量特性可在有限的標(biāo)本中對所有基因組內(nèi)容和轉(zhuǎn)錄組進行表征，特別是對于HIV眼部繼發(fā)感染的患者，由于眼內(nèi)液采集量有限，mNGS較傳統(tǒng)檢測手段能夠?qū)赡艽嬖诘牟≡w進行更早、更全面的篩查，盡早預(yù)防感染，針對性治療，避免嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。

對于眼內(nèi)液的檢測，研究表明mNGS優(yōu)于PCR。Doan等[10]對36 個PCR檢查為陰性的玻璃體液樣本進行mNGS，篩選出8例陽性樣本，病原體包括CMVR、HSV、克雷伯桿菌等。此外，PCR檢測陽性的12/41 例房水/玻璃體液樣本均可在mNGS中測得陽性結(jié)果，還額外篩選出4例陽性樣本，包括CMVR、弓形蟲、風(fēng)疹和紙樣皮氏霉菌[11]，充分體現(xiàn)了mNGS廣譜、高通量、更高靈敏度的特點。

此外，NGS還可在檢測病原體的同時，將其基因與耐藥數(shù)據(jù)庫中的基因進行比對，進而發(fā)現(xiàn)病原體的突變位點，提供準(zhǔn)確的耐藥信息。mNGS對微小變異的檢測更加靈敏，具有更強的復(fù)用能力[12]。Doan等[10]對7例CMVR的樣本進行mNGS分析，發(fā)現(xiàn)3例具有更昔洛韋和纈更昔洛韋耐藥性突變，這是傳統(tǒng)檢測和PCR所無法實現(xiàn)的。

2.1.2 VZV和HSV 皰疹病毒包括水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-Zoster virus，VZV）和單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV），可在HIV感染的各個階段被激活并迅速進展、累及全身各個器官。HAART前HIV相關(guān)VZV的發(fā)生率為0.7%～1%，HAART治療后約0.6%。臨床表現(xiàn)主要為眼部帶狀皰疹、并發(fā)或遲發(fā)性角膜炎、鞏膜炎、葡萄膜炎和視網(wǎng)膜炎。偶有局部無皮膚表現(xiàn)的雙側(cè)帶狀皰疹性視網(wǎng)膜炎（1%），4%～17%的患者最終發(fā)展為壞死性皰疹性視網(wǎng)膜病變：急性視網(wǎng)膜壞死綜合征（Acute retinal necrosis syndrome，ARN）和進行性外層視網(wǎng)膜壞死綜合征（Progressive outer retinal necrosis，PORN）[13]。

目前皰疹病毒常用的診斷方法有定量PCR與IgM檢測等。同仁醫(yī)院梁慶豐團隊成功使用NGS技術(shù)對眼內(nèi)感染的玻璃體樣本進行測序，成功檢測出包括HSV、VZV等在內(nèi)的多種病原體，其結(jié)果也可被PCR驗證[14]。此外，通過對病毒序列的進一步分析，還可以探究病毒耐藥機制、指導(dǎo)臨床用藥策略。早在2013 年，Andrei等[15]就從1 例接受過阿昔洛韋、更昔洛韋和膦甲酸鈉治療后復(fù)發(fā)的HSV患者中分離出HSV毒株，通過NGS發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶基因的2處突變與該毒株的耐藥性有關(guān)?；贜GS快速、靈敏的檢測方法將改進對耐藥病毒中異質(zhì)病毒群的篩選，監(jiān)測其在抗病毒治療期間的實時變化，從而更好調(diào)整治療策略，改善抗病毒效果[16]。Koujah等[17]還通過NGS，發(fā)現(xiàn)不同臨床表現(xiàn)的眼部HSV感染患者，其毒株的遺傳序列存在的一些細(xì)微區(qū)別，導(dǎo)致病毒生長特性、侵入細(xì)胞能力以及細(xì)胞間傳播能力的顯著差異，導(dǎo)致臨床癥狀嚴(yán)重程度的明顯區(qū)別。由此可見，借助NGS對病毒遺傳特性的全面檢測，結(jié)合病毒表型與臨床表現(xiàn)，可以對病毒的致病力展開進一步探索，通過評估病毒之間的遺傳差異，預(yù)測可能的進化分歧及毒力、耐藥表現(xiàn)。

2.2 真菌感染

2.2.1 念珠菌 念珠菌性眼內(nèi)炎總體發(fā)病率較低，在HIV患者中總體感染率不超過1%，多發(fā)生于患者接受化療、留置中心靜脈導(dǎo)管、頻繁使用抗生素、接受骨髓移植等情況時。念珠菌可累及雙眼并侵襲脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜，引起真菌性脈絡(luò)膜炎和視網(wǎng)膜炎，表現(xiàn)為白點狀病灶，通常累及視網(wǎng)膜內(nèi)表面，邊界不清，并可蔓延至玻璃體，因此可有輕度或彌漫性玻璃炎，更有甚者出現(xiàn)內(nèi)源性眼內(nèi)炎。

2.2.2 新型隱球菌 新型隱球菌常侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，繼發(fā)腦膜炎及眼后節(jié)、視神經(jīng)炎癥，表現(xiàn)為脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、眼內(nèi)炎、視神經(jīng)炎、腦神經(jīng)麻痹和視乳頭水腫（＜1%）。眼底表現(xiàn)呈多發(fā)黃色病灶，直徑500～3 000 μm，還可表現(xiàn)為伴羊脂樣KP的前葡萄膜炎、玻璃體炎，視網(wǎng)膜血管血管炎和視乳頭水腫。一旦累及視神經(jīng)、交叉和視神經(jīng)束，則可造成視力喪失。

2.2.3 肺孢子蟲 肺孢子蟲是一種非典型的酵母樣真菌，主要引起肺孢子蟲肺炎，也可播散到其他器官導(dǎo)致肺外疾病[18]。累及眼部通常為雙眼受累，典型臨床特征為位于后極部單個或多個圓形黃白色扁平脈絡(luò)膜病變。大部分患者通常無明顯視覺癥狀。

目前，對眼部真菌感染的檢查手段主要有標(biāo)本培養(yǎng)和共聚焦顯微鏡，分子生物學(xué)檢查主要依賴PCR。其中標(biāo)本培養(yǎng)雖然被視為金標(biāo)準(zhǔn)，但經(jīng)常受采樣和培養(yǎng)條件限制，出現(xiàn)假陽性及假陰性，且培養(yǎng)周期往往較長；共聚焦顯微鏡檢查的優(yōu)勢在于快速和無創(chuàng)，但無法對菌種進行鑒別，且只適用于眼表；PCR檢測受限于采樣位置病原體載量的差異，檢測結(jié)果可能因樣本來源不同而出現(xiàn)較大誤差[19]，且定向性的PCR檢查容易造成誤診、漏診。相比之下，mNGS廣譜、高通量檢測的特性就顯得尤為重要。Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)mNGS在快速、精準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對免疫低下患者痰樣本中肺孢子蟲的檢出率高達(dá)71.4%，而傳統(tǒng)檢測方法僅為23.8%[14]。Qian等[21]對15份可疑眼內(nèi)感染的眼內(nèi)液樣本進行了NGS，發(fā)現(xiàn)部分患者存在真菌感染，然而，其中1例NGS檢測時出現(xiàn)了假陰性，可能與采樣及操作中的疏漏或差錯有關(guān)。由此可見，眼內(nèi)液的NGS檢測有助于發(fā)現(xiàn)疑似眼內(nèi)炎病例的病原體，但是其應(yīng)用流程仍需進一步優(yōu)化和規(guī)范以提高準(zhǔn)確率和靈敏度。

2.3 細(xì)菌感染

相比病毒，細(xì)菌導(dǎo)致的機會感染在AIDS患者中發(fā)病率相對較低，但眼部細(xì)菌的分布和菌群可能發(fā)生變化，導(dǎo)致患者眼部并發(fā)癥風(fēng)險增加。Liu等[22]通過16S rRNA測序，對AIDS患者眼表刮片中的細(xì)菌進行了篩查，發(fā)現(xiàn)在HIV陰性、HIV陽性未治療和HIV接受HAART的3 組被檢者中，假單胞菌在眼表細(xì)菌中占絕對主導(dǎo)地位，且無論是否接受HAART，眼表微生物的總體豐度并無顯著影響，但種類組成可不同。對36 例感染性眼內(nèi)炎對玻璃體液或前房水同時進行傳統(tǒng)的細(xì)菌真菌培養(yǎng)聯(lián)合藥敏試驗和mNGS檢測，結(jié)果顯示mNGS的陽性率（88.89%）顯著高于微生物培養(yǎng)（27.78%），同時mNGS共在9個病例中檢出耐藥基因。可見NGS能有效監(jiān)測眼部微生物種群，并對眼部機會感染做出評估分析[23]。

HIV合并分枝桿菌眼內(nèi)感染較為少見，主要包括結(jié)核類分枝桿菌和非結(jié)核類分枝桿菌（NTM）。結(jié)核分枝桿菌對眼部的損傷通過直接侵襲或炎癥反應(yīng)實現(xiàn)，可單眼或雙眼累及，表現(xiàn)為明顯的前房肉芽腫性炎癥反應(yīng)，伴瞳孔后粘連、玻璃體炎、視網(wǎng)膜血管炎、視神經(jīng)炎、脈絡(luò)膜炎和脈絡(luò)膜結(jié)核[24]。NTM眼內(nèi)感染以往更為罕見，但近年隨著抗生素的大量使用、免疫缺陷人群的擴大、社區(qū)/醫(yī)院獲得性肺炎的增加，其發(fā)病率明顯上升。與結(jié)核分枝桿菌類似，NTM感染眼部可表現(xiàn)為角膜炎、鞏膜炎、淚囊炎以及后節(jié)的脈絡(luò)膜炎和眼內(nèi)炎等。

T-spot是臨床中廣泛用于檢測結(jié)核感染的指標(biāo)，敏感性高但特異性低，PCR（Xpert）用于結(jié)核病疑似的初步診斷，其敏感性也僅約為45.8%。mNGS的敏感性與Xpert近似，約為47.9%，但聯(lián)合Xpert組合診出率可提高至56.3%?？梢姡琺NGS在結(jié)核分支桿菌檢測的應(yīng)用還需要更多的技術(shù)優(yōu)化[25]。而對于NTM的NGS檢測，目前主要集中在毒力、分型、基因多樣性等研究層面，臨床應(yīng)用鮮有報道。本研究團隊曾診治過1例眼內(nèi)炎病例，患者免疫功能低下，通過對玻璃體液的mNGS檢測，最終診斷為NTM肺外播散感染，并根據(jù)NGS提供的耐藥性分析及時使用了敏感藥物利福布汀和克拉霉素，挽救了患者的視力。

2.4 梅毒螺旋體

眼梅毒是慢性梅毒的一種，病原體為蒼白螺旋體，可累及所有眼部結(jié)構(gòu)，在AIDS患者中進展更快，范圍更廣，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，漏診和誤診較高[26]。傳統(tǒng)檢測方法包括病原學(xué)檢測和血清學(xué)試驗，前者是梅毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，缺點是需要檢驗醫(yī)師經(jīng)驗豐富，且培養(yǎng)困難，靈敏性差[27-28]，后者包括非密螺旋體和密螺旋體檢測，缺點是特異性不強、成本高、耗時長[29]。此外，有研究表明，患活動性梅毒的HIV感染者中高達(dá)38%的個體在梅毒血清學(xué)試驗中呈假陰性[30]。PCR用于早期梅毒的診斷靈敏性和特異性較好，也可檢測出扁桃體、脊椎和眼部梅毒的非典型病例，但對潛伏期或慢性梅毒的檢測仍存在缺陷，而mNGS可以檢測培養(yǎng)條件苛刻的病原體，尤其是非典型病原體[31]。

2.5 寄生蟲

眼部弓形體病是此類患者最常見的眼部寄生蟲感染，由弓形蟲所致，可無明顯癥狀，但在免疫抑制或免疫缺陷情況下，眼部弓形體病通常表現(xiàn)為后葡萄膜炎，典型的視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎和局灶性壞死性肉芽腫性視網(wǎng)膜炎[32]。

眼弓形體病的診斷有賴于典型臨床表現(xiàn)。弓形體的傳統(tǒng)血清學(xué)檢測靈敏度、特異性低[33]。PCR目前是弓形體感染的主要診斷工具，但眼弓形體病的PCR檢測目前尚未標(biāo)準(zhǔn)化，對水和玻璃體的PCR檢測陽性率僅為57%[34]。mNGS目前在弓形體的診斷中應(yīng)用較少，Kruse等[35]對1例意識模糊、行為改變、抽搐的患者腦膿腫樣本進行mNGS，意外發(fā)現(xiàn)99%（16S）和100%（D2LSU）的弓形蟲序列，同時還測出HIV序列。這表明，在無法通過臨床癥狀或臨床檢測尋找病原體的復(fù)雜感染患者中，NGS可能能夠精確地尋找到少見的機會性致病原。

3 結(jié)論

NGS檢測范圍廣譜，對多重感染的發(fā)現(xiàn)具有積極意義，對及早發(fā)現(xiàn)罕見病原體亦有重要價值，能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)手段無法檢出和鑒定的病原體。同時，在測序覆蓋度足夠高的情況下，陰性結(jié)果有助于排除發(fā)生感染性疾病的可能。傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)耗時長，NGS測序周轉(zhuǎn)時間根據(jù)平臺而有所差異，能較早得知病原微生物結(jié)果，及時調(diào)整用藥。

目前，mNGS的局限性在于：①標(biāo)本在采集、運輸及處理過程中的污染導(dǎo)致對分析結(jié)果造成干擾；②完整的NGS檢測平臺造價昂貴、操作復(fù)雜，尚不能廣泛普及；③對于檢測數(shù)據(jù)的分析有賴于龐大的數(shù)據(jù)背景以及合適的數(shù)學(xué)算法，技術(shù)門檻較高；④測序結(jié)果復(fù)雜，臨床醫(yī)師在既往臨床理論和經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，需具備相關(guān)生物信息學(xué)知識，才能對測序結(jié)果進行正確的判斷和解讀。

機會性感染是HIV眼病最主要的病因，常因起病隱匿、癥狀不典型而難以察覺，一旦爆發(fā)又難以控制，引起不可逆轉(zhuǎn)的視力損害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此對眼部機會感染病原體的篩查是控制HIV眼病發(fā)生和進展、提高患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵。NGS的出現(xiàn)使簡單、快速獲得高通量、高精準(zhǔn)度病原體遺傳數(shù)據(jù)成為了可能，對HIV相關(guān)機會性感染眼病的病原體檢測具有重大意義，通過對眼內(nèi)液中病原體的檢測，及早識別眼內(nèi)感染的病原體，為臨床診療、針對性用藥提供幫助，控制病情進一步發(fā)展。誠然，這一技術(shù)目前仍存在一些缺點，離廣泛應(yīng)用尚存差距，但隨著硬件設(shè)備的不斷提升和軟件支持的進一步完善，未來NGS有望成為HIV感染或AIDS患者眼部檢查的常規(guī)選擇，為HIV眼病的診斷和治療提供確鑿的依據(jù)和關(guān)鍵性線索。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明王羅梓怡：收集資料，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。姜靖：收集資料，參與選題、設(shè)計并修改論文。王志良：參與選題、設(shè)計、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進行核修