鉻脅迫對(duì)油桐幼苗生理特性及葉片結(jié)構(gòu)的影響

楊昕悅，左文中，張帆航，米小琴，譚曉風(fēng)，李樹戰(zhàn)，李樂生，李 澤

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.湖南省南方丘陵山地生態(tài)經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心；c.湖南省“一帶一路”熱帶干旱經(jīng)濟(jì)林國(guó)際聯(lián)合研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湘西自治州森林生態(tài)研究實(shí)驗(yàn)站，湖南 永順 416700；3.武岡市樂生種養(yǎng)農(nóng)民專業(yè)合作社，湖南 武岡 422409）

鉻是常見的工業(yè)金屬原料，具有長(zhǎng)期性、隱匿性、難消逝和不可逆等特點(diǎn)[1]。鉻在土壤中的常見形式為Cr3+和Cr6+[2]，主要以Cr3+的形式存在[3]。隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，鉻被廣泛應(yīng)用于化工、冶金和機(jī)械制造等行業(yè)，在環(huán)境中的排放速度也隨之增加。經(jīng)過冶煉、電鍍等加工的工業(yè)廢水用于灌溉農(nóng)田會(huì)引起重金屬鉻污染[4]，鉻（Cr）污染正日益對(duì)環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重威脅，成為對(duì)生物群的主要健康危害[5]。王娜娜等[6]研究桃樹對(duì)鉻脅迫的響應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，隨著鉻脅迫程度的加劇，桃樹光合系統(tǒng)受到破壞，阻礙了PS Ⅱ電子傳遞過程，導(dǎo)致桃樹光合作用減弱，干物質(zhì)積累減少。Adhikari等[7]的研究表明，鉻脅迫下，玉米的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，其株高和生物量都顯著降低。Ahmad 等[8]通過研究鉻脅迫對(duì)甜菜的影響發(fā)現(xiàn)鉻影響其光合作用，降低了甜菜植株有機(jī)物的積累，阻礙其生長(zhǎng)；鉻脅迫可能導(dǎo)致葉綠體的超微結(jié)構(gòu)改變，抑制或降解葉綠素的酶活性升高，造成光合色素減少。同時(shí)，鉻脅迫會(huì)降低抗氧化酶活性，使細(xì)胞內(nèi)氧化物積累，產(chǎn)生氧化脅迫，導(dǎo)致丙二醛（MDA）含量增加，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。不同植物對(duì)脅迫的反應(yīng)有所不同，周希琴等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)鉻脅迫下木麻黃種子中SOD 含量先增后減，CAT、POD 含量增加，這是由于高濃度鉻引起的膜及酶系統(tǒng)破壞使其代謝紊亂。Nascimento等[10]對(duì)可可豆的研究中發(fā)現(xiàn)，鉻脅迫造成過量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）積累，使葉綠體遭到破壞，細(xì)胞壁破裂，降低了可可葉片的光合作用，損傷膜結(jié)構(gòu)，還破壞了葉片和根細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響了可可的生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)，在Adhikari 等[7]和Nascimento 等[10]的研究中均發(fā)現(xiàn)植物對(duì)鉻的積累主要在根部，這是一種植物對(duì)金屬的排斥反應(yīng)，即植物阻止有毒的重金屬向上部運(yùn)輸，以降低對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的危害。

油桐Verniciafordii是大戟科油桐屬的落葉經(jīng)濟(jì)樹種，與油茶Camelliaoleifera、核桃Juglans regia和烏桕Sapiumsebiferum并稱我國(guó)四大木本油料樹種。從油桐種子中提取的桐油是制造綠色、環(huán)保和無污染涂料的優(yōu)質(zhì)原料，具有干燥快、附著性強(qiáng)、富有光澤、耐酸堿和耐高溫等優(yōu)良特性，具有廣泛的用途[11]。桐油可用作建筑材料的防腐、防銹涂料，也可以用于制作肥皂、農(nóng)藥和醫(yī)用嘔吐劑等[12]。隨著人們環(huán)境意識(shí)增強(qiáng)，桐油作為制造環(huán)保型油漆最適宜的原料之一，其需求量正日益增長(zhǎng)；同時(shí)，油桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)于帶動(dòng)我國(guó)貧困地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展有極大作用，對(duì)于鄉(xiāng)村振興的實(shí)施具有重要的戰(zhàn)略意義[13]。此外，油桐是一種潛在的生物質(zhì)能源樹種，在當(dāng)今國(guó)際化石油能源緊張的背景下，可能會(huì)成為緩解世界能源緊張的理想材料之一，具有廣闊的發(fā)展前景[14]。然而，國(guó)內(nèi)外現(xiàn)在對(duì)油桐的研究主要集中在如何提高油桐產(chǎn)量和種子含油率等經(jīng)濟(jì)效益上，暫時(shí)還未見關(guān)于油桐對(duì)土壤鉻脅迫響應(yīng)等方面的報(bào)道。湖南省礦產(chǎn)資源豐富，近年來，梁玉峰[15]監(jiān)測(cè)到工業(yè)鉻排放呈上升趨勢(shì)，且多數(shù)排放的鉻富集在土壤中，可能會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成不利影響。一方面，土壤鉻含量的增加會(huì)導(dǎo)致農(nóng)林業(yè)用地減少；另一方面湖南省作為全國(guó)油桐的主產(chǎn)區(qū)，土壤鉻污染可能會(huì)阻礙油桐的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致油桐產(chǎn)量降低，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究油桐對(duì)鉻脅迫的生理響應(yīng)以及探究不同部位對(duì)鉻的富集程度，在油桐對(duì)重金屬的修復(fù)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展等方面具有重要的實(shí)踐推廣價(jià)值。

本研究通過盆栽試驗(yàn)?zāi)M大田鉻污染的土壤環(huán)境條件，研究了4 種鉻濃度對(duì)油桐幼苗光合生理特性、葉片解剖結(jié)構(gòu)以及不同器官中的鉻含量的影響，明確了油桐吸收鉻元素后的富集部位，可為今后油桐在鉻污染環(huán)境中的栽培及對(duì)鉻污染土壤修復(fù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料‘華桐1 號(hào)’為當(dāng)年生的實(shí)生苗，2018 年11 月在湖南湘西永順縣青坪鎮(zhèn)國(guó)家油桐種質(zhì)資源保存庫(kù)采集成熟的果實(shí)，果實(shí)去果皮后在室內(nèi)陰干，然后種子浸入0.3%的高錳酸鉀中消毒40 min 后沙藏備用。

1.2 試驗(yàn)方法

于2019 年4—10 月在中南林業(yè)科技大學(xué)樹木樓樓頂進(jìn)行試驗(yàn)。4 月1 日選擇沙藏露白后長(zhǎng)勢(shì)一致的油桐種子播種于30 cm×30 cm×50 cm的塑料盆中，基質(zhì)為蛭石∶珍珠巖∶黃土=1∶1∶3（V∶V∶V）。正常生長(zhǎng)2 個(gè)月后于6 月1 日添加鉻溶液處理，以不添加Cr3+作為對(duì)照，添加不同濃度氯化鉻（CrCl3+·6H2O）水溶液作為處理，按照盆中土壤質(zhì)量計(jì)算，在每千克土壤中分別施加50、100、200 和500 mg Cr3+水溶液，盆下方放一個(gè)托盤，流出來少量的液體第2 天繼續(xù)澆到盆子中，分別用C50、C100、C200 和C500 表示。每個(gè)處理18 盆，總共90 盆植株。分別在30 和60 d 后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，試驗(yàn)期間其他水肥條件正常管理。

1.3 光合生理指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 光合生理特征參數(shù)的測(cè)定

于2019 年7 月初及8 月初的晴天9:00—11:00（最高氣溫36 ℃），選取成熟葉片，測(cè)定葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）及蒸騰速率（Tr）等參數(shù)[16]，光照強(qiáng)度統(tǒng)一設(shè)定為油桐幼苗的飽和光合有效輻射1 500 μmol·m·s-1[17]，CO2由小鋼瓶提供，濃度統(tǒng)一設(shè)定為400 mg/m3，相對(duì)濕度為70%。氣孔限制值（Ls）根據(jù)Farquhar 和Sharkey 的研究計(jì)算為1-Ci/Ca（Ca為大氣中CO2濃度）[18]；水分利用效率（WUE）=Pn/Tr。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定用6400XT 光合儀（LI-COR，USA）熒光葉室測(cè)定。測(cè)定當(dāng)天白天在每個(gè)處理選取成熟健康的葉片，掛好標(biāo)簽標(biāo)記，在21:00—23:00 測(cè)定初始熒光F0，然后施加脈沖為7 200 μmol·mol-2·s-1的光強(qiáng)下0.8 s，測(cè)得暗適應(yīng)下最大熒光Fm及最大光化學(xué)效率Fv/Fm[19]。

1.3.3 葉綠素含量的測(cè)定

采用成熟健康的鮮葉，去除主脈后稱量0.2 g葉片剪成細(xì)絲，浸泡在15 mL丙酮乙醇（V∶V=1∶1）溶液中。在黑暗中放置24 h 后在4 ℃下冰箱中待葉子中葉綠素溶于提取液后，用分光光度計(jì)（Specord 50 Plus）記錄吸光度，分別在波長(zhǎng)為663 和645 nm 時(shí)測(cè)定OD 值，最后根據(jù)如下公示計(jì)算：

Chl a(mg·dm-2)=12.72A663-2.59A645，

Chl b(mg·dm-2)=22.88A645-4.68A663，

Chl a+b(mg·dm-2)=Chl a+Chl b。

1.4 干物質(zhì)測(cè)定

在生理生化指標(biāo)全部測(cè)定完成后，用分析天平（0.1 mg 精度）測(cè)量葉、葉柄、莖和根（稱質(zhì)量前清洗的根）的鮮質(zhì)量，再放入烘箱中105 ℃下殺青30 min，65 ℃下烘72 h 直至恒質(zhì)量后稱取干質(zhì)量。葉片含水率=（鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/鮮質(zhì)量×100%。

1.5 生理生化指標(biāo)與方法

施加鉻溶液30 d 后，隨機(jī)選取油桐幼苗由上往下數(shù)第3～5 片葉片進(jìn)行第一次取樣，60 d時(shí)第二次取樣。用萬分之一的電子天平精確稱取0.5 g，用錫箔紙包裹，浸入液氮冷凍30 min 后放進(jìn)冰箱中-80 ℃下儲(chǔ)存，每個(gè)處理18 份樣。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）使用南京建成公司的試劑盒進(jìn)行POD、SOD 的測(cè)定；丙二醛（MDA）活性采用硫代巴比妥酸顯色法[20]；采摘鮮樣，使用電導(dǎo)率儀測(cè)定葉片相對(duì)電導(dǎo)率；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.6 葉片氣孔開度測(cè)定

分別于第30 天和第60 天上午9:00 采摘新鮮葉片，在葉背面涂一層纖維素膠液，凝固后輕輕撕下，置于滴水的載玻片上，放在顯微鏡下觀察拍照。統(tǒng)計(jì)氣孔數(shù)量和開閉情況。

1.7 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察

從新鮮植物成熟葉片的中下部靠近主脈處切取0.5 cm×0.5 cm 的組織。每組處理采集2 個(gè)材料。切下后立刻放入FAA（福爾馬林∶冰乙酸∶乙醇=1∶1∶18）中固定，再放入冰箱中4 ℃下保存24 h。接下來經(jīng)過一系列濃度梯度（70%、85%、95%和100%）的酒精脫水，用石蠟進(jìn)行包埋，切片機(jī)切片，厚度為8 μm，每個(gè)樣品3 張。番紅固綠染色，中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察。所用公式如下：

葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%；

葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（SR）=海綿組織厚度/葉片厚度×100%。

1.8 鉻含量的測(cè)定

待所有取樣工作完成后，將不同處理的油桐幼苗移出并進(jìn)行盆栽，按葉、莖、根、土壤分別稱取鮮質(zhì)量。包入油紙后放進(jìn)烘箱中105 ℃下干燥30 min，然后在65 ℃下干燥至恒質(zhì)量。將處理好的干樣送交成都栢暉檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行鉻元素測(cè)定。

將干樣風(fēng)干過篩。土壤樣本取0.5～1.0 g，油桐根、莖、葉樣本均取0.2 g，分別置于50 mL消煮管中（勿將樣品黏附在瓶頸上）。先滴入少些水濕潤(rùn)樣品，然后加8 mL 濃硫酸，2 mL 72 %的高氯酸，于石墨爐上400 ℃消煮至澄清（2 h 左右），轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶定容，備用?？瞻兹芤撼患釉嚇油?，應(yīng)用的試劑和操作步驟同上。將標(biāo)準(zhǔn)溶液、試劑空白和樣本溶液過濾后，使用ICP-oes 測(cè)定。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖；采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析。表中和圖中的結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有數(shù)據(jù)每次均測(cè)定3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的鉻含量對(duì)油桐幼苗生理特性的影響

2.1.1 不同濃度的鉻含量對(duì)油桐幼苗光合參數(shù)及葉片含水率的影響

由圖1 可以看出，隨著鉻濃度的升高，各處理組油桐幼苗葉片的Pn、Gs、Tr都呈下降趨勢(shì)。處理時(shí)長(zhǎng)為30 和60 d 時(shí)，C50 處理組油桐葉片Pn相比對(duì)照略有降低，但差異不顯著（P＞0.05）；在30 d 時(shí)，C100、C200 和C500 處理組分別比對(duì)照降低了31.04%、38.24%和54.25%，差異顯著（P＜0.05）；在60 d 時(shí)，C100、C200 和C500處理組分別比對(duì)照降低了37.15%、41.03% 和89.02%（圖1A），差異顯著（P＜0.05）。Gs和Tr的變化趨勢(shì)與Pn基本一致，均隨著鉻濃度的增加及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。在60 d 時(shí)，C100、C200 和C500 處理組相比對(duì)照Gs分別降低了25.64%、34.29%和87.02%（圖1B）；Tr分別降低了33.40%、40.75%和89.45%（圖1C），差異顯著（P＜0.05）。在30 d 時(shí)，Ci隨著鉻濃度的增加逐漸降低；相比對(duì)照，在60 d 時(shí)，各處理組Ci的值稍有升高，變化無明顯規(guī)律（圖1D）；在30 d 時(shí)，隨著鉻濃度增加，WUE 呈上升趨勢(shì)，C50、C100、C200 和C500 處理組相比于對(duì)照分別升高了10.59%、24.04%、33.07%和77.13%（圖1E），差異顯著（P＜0.05）。在60 d 時(shí)，C50、C100、C200 和C500 處理組與對(duì)照無顯著性差異（P＞0.05）。隨著鉻濃度的增加，油桐幼苗的葉片含水率呈先下降后上升的趨勢(shì)，在C50 組達(dá)到最低值，相比對(duì)照降低了6.75%，差異顯著（P＜0.05）；在C500 組達(dá)到最高值，相比對(duì)照升高1.43%（圖1F），差異顯著（P＜0.05）。

圖1 不同濃度的鉻處理對(duì)油桐幼苗葉片光合參數(shù)及葉片含水率的影響Fig.1 Effects of different Cr3+ concentrations on the photosynthetic parameters and leaf water content of tung tree leaves

2.1.2 不同濃度的鉻含量對(duì)油桐幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖2 可以看出，鉻脅迫30 d 時(shí)，與對(duì)照相比，隨著鉻濃度的增大，C50、C100、C200 和C500 處理組的Fm的值升高，但差異不顯著（P＞0.05）；在60 d 時(shí)，C500 處理組的Fm比對(duì)照降低了16.40%，差異顯著（P＜0.05），其他處理與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05）。Fv/Fm隨著鉻濃度的增加整體呈降低趨勢(shì)，在30 d 時(shí)C50 和C100處理組與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05），C200和C500 處理組與對(duì)照相比分別降低了1.37%和1.34%，差異顯著（P＜0.05）；在60 d 時(shí)C200和C500 處理組與對(duì)照相比分別降低了2.69%和1.10%，差異顯著（P＜0.05）。

2.1.3 不同濃度的鉻含量對(duì)油桐幼苗葉綠素含量的影響

由表1 可以看出，隨著鉻濃度增加，油桐幼苗葉片的Chl a、Chl b、Chl (a+b)含量總體呈下降趨勢(shì)。在30 d 時(shí)，C50 的Chl (a+b)含量略低于對(duì)照，差異不明顯（P＞0.05），C100、C200 和C500處理組相比于對(duì)照分別降低了23.03%、36.15%和22.16%，差異顯著（P＜0.05）。C500 組的葉綠素含量始終最低，在60 d 時(shí) Chl a、Chl b、Chl (a+b)相比于對(duì)照分別低了23.19%、27.06%和24.35%，差異顯著（P＜0.05）。

表1 不同濃度的鉻處理對(duì)油桐幼苗葉片葉綠色含量的影響?Table 1 Effects of different Cr3+ concentrations on the chlorophyll content of tung tree leaves

2.2 不同濃度的鉻含量對(duì)油桐幼苗生理生化指標(biāo)的影響

由圖3 可以看出，在油桐幼苗葉片中，C50、C100、C200 和C500 處理組的MDA 含量在30 d時(shí)與對(duì)照相比差異并不顯著（P＞0.05）；在60 d時(shí)，MDA 含量隨著土壤鉻濃度增加及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，C50、C100、C200 和C500 處理組油桐幼苗葉片中MDA 含量分別比對(duì)照上升了14.14%、18.09%、10.67% 和47.18%，差異顯著（P＜0.05）。在30 d 時(shí)，C50、C100、C200 和C500 處理組相對(duì)電導(dǎo)率比對(duì)照分別降低了29.36%、45.34%、32.89% 和41.91%，差異顯著（P＜0.05）；在60 d 時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率隨著土壤鉻濃度升高呈先降低后升高的趨勢(shì)，C50 組達(dá)到最低值，比對(duì)照降低了17.44%，C500組達(dá)到最高值，比對(duì)照升高了5.90%，差異顯著（P＜0.05）。

圖3 不同濃度的鉻處理對(duì)油桐幼苗葉片生理生化指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of different Cr3+ concentrations on the physiological and biochemical indexes of tung tree leaves

隨著鉻濃度的增加，鉻脅迫對(duì)油桐幼苗葉片POD 含量的影響并不顯著（P＞0.05）（圖3C）。SOD 含量隨著土壤鉻濃度增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，但C50、C100、C200 和C500 處理組均高于對(duì)照。在30 d 時(shí)，C200 組達(dá)到最大值，與對(duì)照相比升高了26.72%，差異顯著（P＜0.05）；在60 d 時(shí)，C100 組達(dá)到最大值，比對(duì)照升高了48.17%，差異顯著（P＜0.05）（圖3D）。

在30 d 時(shí)，隨著鉻濃度增大，C50、C100、C200 和C500 處理組的可溶性糖含量較對(duì)照均升高但差異不明顯（P＞0.05）。在60 d 時(shí)，C100、C500 處理組的油桐幼苗葉片中可溶性糖含量顯著高于對(duì)照，分別為增加了15.81%和5.03%（P＜0.05）；C200 與對(duì)照相比降低了21.75%，差異顯著（P＜0.05）（圖3E）。在30 d 時(shí)，隨著土壤鉻濃度增加，C50、C100、C200 和C500處理組的可溶性蛋白含量與對(duì)照相比分別下降了8.83%、4.28%、5.48% 和5.18%，差異顯著（P＜0.05）。在60 d 時(shí)，C100、C500 處理組與對(duì)照相比分別降低了5.84%和3.13%，差異顯著（P＜0.05），C50 和C200 與對(duì)照相比無顯著差異（P＞0.05，圖3F）。

2.3 不同濃度的鉻含量對(duì)油桐幼苗葉氣孔開度的影響

由表2 和圖4 可以看出，在30 d 時(shí)，隨著土壤鉻濃度增大，氣孔打開數(shù)、打開數(shù)/總數(shù)呈下降趨勢(shì)，C50、C00、C200 和C500 處理組的氣孔打開數(shù)與對(duì)照相比分別下降34.74%、41.85%、48.23%和49.64%，有顯著差異（P＜0.05）。在60 d 時(shí)，氣孔打開數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在C100 組達(dá)到最大，比對(duì)照高28.05%；C500 氣孔打開數(shù)/總數(shù)最小，比對(duì)照降低了35.78%，差異顯著（P＜0.05）。

表2 不同濃度的鉻處理下油桐幼苗葉表面氣孔的統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of stomata on the leaf surface of tung tree seedlings under different Cr3+ concentrations

圖4 鉻脅迫對(duì)油桐幼苗葉表面氣孔的影響Fig.4 Stomata on the leaf surface of tung tree seedlings under chromium stress

2.4 不同濃度的鉻含量對(duì)油桐幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

由表3 和圖5 可以看出，隨著鉻脅迫的加重，油桐幼苗葉片的葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、海綿組織厚度和葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（SR）在30 d 時(shí)呈下降趨勢(shì)，C50、C00、C200和C500 處理組的葉片厚度與對(duì)照相比分別下降了15.00%、15.85%、11.56% 和14.15%，差異顯著（P＜0.05）；4 個(gè)組的SR 與對(duì)照相比分別下降了2.72%、3.70%、9.41%和3.87%，差異顯著（P＜0.05）。葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）呈先上升后下降的趨勢(shì)，在C100 組達(dá)到最大值，相比對(duì)照增加了14.32%，差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同濃度的鉻處理對(duì)油桐葉片葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響Table 3 Effects of different Cr3+ concentrations on the leaf anatomical structure parameters of tung tree seedlings

圖5 不同濃度的鉻處理下油桐幼苗的葉片解剖結(jié)構(gòu)Fig.5 Leaf anatomical structure of tung tree seedlings under chromium stress

在60 d 時(shí)，隨著土壤鉻含量的升高與脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，油桐幼苗葉片的葉片厚度的降幅更明顯，C50、C00、C200 和C500 組相比對(duì)照依次降低了7.68%、13.74%、23.08%和26.71%，差異顯著（P＜0.05）；但與對(duì)照相比，4 個(gè)組的SR 沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 不同濃度的鉻脅迫下油桐幼苗不同器官和土壤中鉻的含量

由圖6 可以看出，隨著鉻濃度的增加，油桐幼苗各部位及土壤金屬鉻的積累量在各處理組中均呈上升趨勢(shì)。隨著鉻處理濃度的增加，在葉片中的鉻含量在C50、C100、C200 和C500 處理下分別比對(duì)照增加了104.81%、170.29%、296.06%和1 260.72%，差異顯著（P＜0.05）；在莖中的鉻含量在C50、C100、C200 和C500 處理下分別比對(duì)照增加了260.19%、314.78%、410.28%和2 979.90%，差異顯著（P＜0.05）。在油桐幼苗根部，C500 處理下鉻含量最高，比對(duì)照增加了1 942.99%。油桐幼苗不同部位中，各處理組均是在根部的鉻含量最高，分別是葉中的61.51、22.30、61.77、64.18 和38.25 倍。

圖6 油桐幼苗不同器官和土壤中鉻的含量Fig.6 Chromium contents in different organs of tung tree seedlings and soil

3 討 論

3.1 鉻脅迫對(duì)油桐幼苗生理生化特性的影響

Wakeel 等[21]的研究表明鉻脅迫對(duì)植物細(xì)胞有毒害作用，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和膜通透性水平改變。MDA 是膜脂過氧化的產(chǎn)物，當(dāng)植物細(xì)胞處于逆境時(shí)機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生MDA。在30 d 時(shí)，C50、C100、C200 和C500 處理組與對(duì)照的MDA含量差異均不明顯。隨著脅迫時(shí)間增加，在60 d時(shí)，MDA 含量顯著上升，造成油桐幼苗膜脂損傷，并且隨著土壤鉻濃度升高而加劇。這可能是因?yàn)槎唐趦?nèi)重金屬鉻的影響較小，未能明顯地體現(xiàn)出來，而在長(zhǎng)期脅迫下，油桐幼苗受到的影響越來越大，進(jìn)而有所表現(xiàn)。相對(duì)電導(dǎo)率也是表示植物抗性的指標(biāo)之一，可以代表細(xì)胞膜的調(diào)控作用。30 d 時(shí)，C50、C100、C200 和C500 處理組的相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于對(duì)照組，在60 d 時(shí)呈先降低后升高的趨勢(shì)，C500 相對(duì)電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照。這可能是因?yàn)樵诙唐趦?nèi)植物對(duì)外界脅迫有一定的抵抗能力，而長(zhǎng)期高濃度鉻脅迫下，植物的結(jié)構(gòu)和功能受到影響，抗性降低。ROS 即活性氧，是衍生自分子氧的化學(xué)活性物質(zhì)，可能會(huì)對(duì)需氧生物造成損害[22]。由于重金屬與葉綠體和線粒體膜電子傳遞活性的相互作用，植物處于有毒的重金屬環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致ROS 含量增加。ROS 可以破壞細(xì)胞膜的氧化還原狀態(tài)，從而破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致離子泄漏[23-24]，從而導(dǎo)致電導(dǎo)率增大?？扇苄蕴恰⒖扇苄缘鞍鬃鳛榧?xì)胞滲透性的保護(hù)物質(zhì)，其含量可表示植物細(xì)胞在逆境中的適應(yīng)能力。在30 d 時(shí)，外施鉻的處理組可溶性蛋白含量比對(duì)照低且存在顯著性，在60 d 時(shí)略低于對(duì)照?？赡苁且?yàn)殂t脅迫對(duì)于油桐幼苗可溶性糖、可溶性蛋白的積累略有影響，但影響不大。

POD 與SOD 是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶。POD 是過氧化物酶，可以將細(xì)胞氧化還原作用時(shí)產(chǎn)生的毒性物質(zhì)分解。超氧化物歧化酶SOD 是對(duì)抗ROS 的主要手段之一[25]，可以清除自由基，對(duì)抗氧化作用并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞。研究表明，鉻脅迫對(duì)油桐葉片的POD 含量無明顯影響，但對(duì)SOD 含量產(chǎn)生影響，這可能是因?yàn)榻饘巽t沒有造成油桐機(jī)體內(nèi)過氧化物的形成，但產(chǎn)生了超氧自由基。相比對(duì)照，C50 和C100 處理組內(nèi)SOD 含量呈上升趨勢(shì)，說明隨著土壤鉻含量的增加，油桐幼苗受到氧化脅迫影響，產(chǎn)生一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，有助于清除由脅迫產(chǎn)生的過多自由基[26]。植物內(nèi)產(chǎn)生更多的SOD 能夠增強(qiáng)抗氧化的能力，但在高濃度C500 處理組中，植物受到的脅迫影響較大，植物受害更為嚴(yán)重，加劇了膜脂過氧化作用引起膜及酶系統(tǒng)的破壞使其代謝紊亂，合成SOD 的能力有所下降，這與張鳳琴等[26]關(guān)于木欖幼苗的研究和萬永吉等[27]關(guān)于秋茄種苗的研究結(jié)果相似。

3.2 鉻脅迫對(duì)油桐幼苗光合生理特性的影響

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供物質(zhì)與能量。葉綠素是植物光合作用的基礎(chǔ)，葉綠素含量越高，植物光合作用越強(qiáng)。本試驗(yàn)外施鉻的處理組中，油桐幼苗葉片葉綠素含量及光合速率明顯降低。Assche 等[28]的研究表明葉綠素合成系統(tǒng)和葉綠素酶活性受到高濃度鉻的影響；Vajpayee 等[29]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cr 能夠降解參與葉綠素生物合成的重要酶（δ-氨基乙酰丙酸脫水酶），從而降低葉綠素的含量。柵欄組織的厚度也與油桐幼苗光合作用相關(guān)。油桐幼苗葉片柵欄組織厚度有明顯的下降，并且在光合作用中表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。油桐幼苗的凈光合速率隨土壤鉻濃度的增加而降低，由于鉻脅迫產(chǎn)生過量ROS，破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)，使光合色素減少，從而抑制了光合作用，阻礙了植物的生長(zhǎng)發(fā)育。Nascimento 等[10]的研究表明在鉻脅迫下植物類囊體薄膜被分解，葉綠體遭到破壞，導(dǎo)致植物光合作用減弱。在外界環(huán)境脅迫下，光合作用的限制因子可分為氣孔限制和非氣孔限制，當(dāng)Ci與Gs同時(shí)下降時(shí)，Pn下降主要是由氣孔限制引起的，如果光合速率的降低伴隨著Ci升高，光合作用的主要限制因素就是非氣孔因素[18]。30 d 時(shí)，Ci與氣孔導(dǎo)度同時(shí)下降，表明為氣孔因素；第60 天時(shí)，C50 的Pn低于對(duì)照組而Ci高于對(duì)照組，并且C50的氣孔開度小于對(duì)照組，因此推斷可能是非氣孔限制，這與葉肉細(xì)胞的光合活性有關(guān)，過量的ROS 導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)遭到了破壞。

Fv/Fm的變化是判斷植物葉片是否受到光抑制的重要依據(jù)。一般地，植物在沒有光呼吸的條件下，F(xiàn)v/Fm為0.80～0.83。Fv/Fm呈下降趨勢(shì)，但差異并不大（圖2B），且始終處于0.80～0.83，說明金屬鉻對(duì)于油桐幼苗PS Ⅱ最大光能轉(zhuǎn)化效率略有影響但影響不大。

WUE 與光合速率和蒸騰速率有關(guān)。本試驗(yàn)中，30 d 時(shí)，隨著土壤鉻濃度升高，WUE 顯著上升。60 d 時(shí)，各處理組WUE 與對(duì)照相比無顯著差異，可能是長(zhǎng)時(shí)間的鉻脅迫降低了油桐幼苗葉片的蒸騰作用，具體原因有待進(jìn)一步研究。

氣孔的開閉情況直接影響到油桐幼苗的光合作用。30 d 時(shí)，從打開的氣孔數(shù)量來看，對(duì)照明顯高于其他4 個(gè)外施鉻的處理組。而且，隨土壤鉻濃度升高，打開的氣孔數(shù)呈下降趨勢(shì)，這與光合速率和氣孔導(dǎo)度的趨勢(shì)相同，說明鉻脅迫阻礙了葉片氣孔的開閉，油桐受脅迫越嚴(yán)重，氣孔關(guān)閉越多。

3.3 不同濃度的鉻脅迫下油桐幼苗不同器官和土壤中鉻的含量

油桐的根部吸收了大部分的鉻，并且鉻在油桐幼苗中的分配表現(xiàn)為根＞莖＞葉。Singh 等[30]的研究表明植物根部積累的鉻比其他組織多10～100 倍。Rascio 等[31]研究發(fā)現(xiàn)植物根細(xì)胞通過與氨基酸、有機(jī)酸或液泡形成復(fù)合物來解毒重金屬，以此保護(hù)葉片組織。Nascimento 等[10]對(duì)可可豆鉻脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，可可豆根的木質(zhì)部細(xì)胞靠近細(xì)胞壁的部位積聚了電極質(zhì)物質(zhì)，表明鉻被根部吸收之后通過木質(zhì)部被運(yùn)輸?shù)街参锏牡厣喜糠郑厣喜糠帚t含量遠(yuǎn)小于根部，這可能是可可豆對(duì)重金屬鉻的排斥作用所造成的。植物對(duì)重金屬的排斥作用是產(chǎn)生耐受性的一種方式，即植物讓金屬留在根部，減少其向上部運(yùn)輸，以免對(duì)上部營(yíng)養(yǎng)器官或生殖器官造成危害[32]。Gadd[33]對(duì)印度芥菜的鎘脅迫試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)芥菜根部鎘含量顯著高于地上部分，說明印度芥菜對(duì)重金屬Cd 具有排斥性。而本試驗(yàn)中，油桐幼苗中地下部分Cr濃度顯著高于地上部分，說明Cr 離子在油桐幼苗植物體內(nèi)難以遷移，表現(xiàn)出對(duì)Cr 的排斥性。在植物修復(fù)土壤重金屬技術(shù)中，利用植物根系分解、沉淀、螯合和氧化還原等多種理化過程將重金屬固定在根際中，使其在土壤中的遷移和擴(kuò)散能力減弱，以緩解重金屬對(duì)環(huán)境的污染程度的方法稱為植物穩(wěn)定修復(fù)[34]。油桐幼苗在低濃度（C100）鉻土壤中表現(xiàn)出較好的耐受性，在高濃度（C500）鉻土壤中表現(xiàn)出對(duì)Cr 較強(qiáng)的富集能力，油桐幼苗根部積累的鉻含量達(dá)1 966.10 mg·kg-1。但是，本研究并未對(duì)其富集系數(shù)及轉(zhuǎn)移系數(shù)做具體測(cè)定。后續(xù)研究中有必要進(jìn)一步開展油桐幼苗根系及地上部分對(duì)重金屬鉻的富集能力及根部固定鉻的方式及原理的研究，為降低土壤鉻濃度和修復(fù)鉻污染土壤提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

綜上所述，土壤鉻濃度小于或等于100 mg·kg-1的處理組中油桐幼苗耐受性較好，受到鉻的毒害現(xiàn)象不明顯；土壤鉻濃度大于等于200 mg·kg-1的處理組受到明顯的毒害，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞、光合作用明顯減弱、生長(zhǎng)量與物質(zhì)積累量減少，且毒害現(xiàn)象隨著鉻濃度的升高而加劇。油桐幼苗抵抗鉻脅迫的方式是在根部積累大部分的鉻，減少向上運(yùn)輸，降低對(duì)地上部分的傷害。油桐幼苗將金屬鉻富集在根部這一特性，對(duì)于油桐修復(fù)土壤鉻污染提供了可行方案和技術(shù)支撐。