蠲毒消瘤飲抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)理

伊凡,林依娜,楊俊玲,汪慧,鄧皖利,周銘心

(1.烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科,上海 201203;3.新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊 830000)

結(jié)腸癌(colorectal cancer,CRC)是現(xiàn)今全球最常見的惡性腫瘤之一,高居腫瘤相關(guān)死亡率排名前三。近些年來人們?cè)絹碓街匾曄瘍?nèi)鏡的檢查,運(yùn)用科技手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CRC發(fā)病率呈階梯式上升,且逐漸有年輕化發(fā)展的趨勢(shì)。隨著臨床中對(duì)早期CRC的診斷和治療手段的改進(jìn),在臨床中起到了至關(guān)重要的作用使得結(jié)腸癌患者的生存率有著明顯提高[1-3]。目前針對(duì)中晚期結(jié)腸癌患者行化療方案,對(duì)于術(shù)前甚至術(shù)后患者均未達(dá)到預(yù)期滿意療效,故積極尋求探索新型化療靶向藥物對(duì)于改善結(jié)腸癌中晚期預(yù)后具有重大臨床意義[4-9]。近年來,發(fā)現(xiàn)部分臨床治療趨向中西醫(yī)結(jié)合,中醫(yī)藥的介入使得CRC的治療途徑得到了國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注,中藥具有療效顯著、毒副作用小等特點(diǎn),在臨床治療中起到重要作用。中醫(yī)認(rèn)為結(jié)腸癌屬于“癥瘕”“腸覃”“臟毒”“下痢”等范疇,其病機(jī)早期多以實(shí)證為主,多見于氣滯、血瘀等實(shí)邪為主,久病則虛致使元?dú)馓澨摻K為病之根本,二者互為影響,搏結(jié)凝而為“巖”,發(fā)為腫瘤。常常由實(shí)而致積,因積而益虛,虛實(shí)夾雜形成惡性循環(huán)。通過查閱大量古籍文獻(xiàn)和臨床醫(yī)學(xué)記錄發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥對(duì)于改善CRC具有一定的療效,特別近些年的臨床觀察和探索,證實(shí)了中醫(yī)藥治療CRC在緩解癥狀,提高生活質(zhì)量,預(yù)防轉(zhuǎn)移均具有一定療效[10-13]。

本研究中藥方劑蠲毒消瘤飲是由國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)劉繼祖教授創(chuàng)制,劉教授從醫(yī)六十余年,挖掘中醫(yī)古籍并結(jié)合地方特色和癌病臨床特點(diǎn),總結(jié)出獨(dú)具特色的倡癌毒學(xué)說,并綜合歷代醫(yī)家治癌學(xué)說和理念,在此基礎(chǔ)上提出其治療大法以“健脾和胃”“益氣培元”為輔來固護(hù)正氣,其本質(zhì)是使體內(nèi)生理功能盡量恢復(fù)平衡穩(wěn)定,消除或減輕有害物質(zhì)的侵襲。查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,中藥聯(lián)合化療可以通過改善機(jī)體的免疫功能,增加機(jī)體造血功效,從而有效逆轉(zhuǎn)腫瘤多重耐藥,還可以更好地減輕或降低化療藥物所產(chǎn)生的不良反應(yīng),有效延長(zhǎng)患者的存活期限。本課題以結(jié)腸癌 HCT116細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,檢測(cè)蠲毒消瘤飲對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,并初步探討其作用機(jī)制,為臨床治療CRC提供可靠的理論依據(jù)與治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 蠲毒消瘤飲(白花蛇舌草 30 g、半枝蓮6 g、半邊蓮 6 g、夏枯草 10 g、浙貝母 10 g、 山慈菇 6 g、八月札 6 g、苦豆子 3 g、槐花 6 g、地榆 10 g、黃芪 30 g、太子參 10 g、白術(shù) 15 g、炙甘草 6 g等中藥)由烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。

1.1.2 試劑 人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng)基(批號(hào):L2240)、VEGF-CST蛋白(批號(hào):66431-1-lg)、基底膠(批號(hào):S350JV)、Ras抗體(批號(hào):60236-1-lg)、發(fā)光液(批號(hào):abs911)、甲醛(批號(hào):30525-00-4)、結(jié)晶紫(批號(hào):548-11-9),以上試劑均購自上海微界貿(mào)易發(fā)展有限公司;小牛血清(Thermo Fisher,批號(hào):10100188);青鏈霉素混合液(Thermo Fisher,批號(hào):15070123);MTT(生工生物,批號(hào):310-90-1);DMSO(Sigma,批號(hào):D1179);ERK 抗體(CST,批號(hào):4600);Raf、Raf-1 抗體(Santa Cruz,批號(hào):sc-7463);p-MEK1/2(CST,批號(hào):146F8);MEK1/2(CST,批號(hào):9142);Transwell 小室(BD,批號(hào):345297);Annexin V/PI 檢測(cè)試劑盒(BBI LifeScience,批號(hào):E606336-0167)。

1.1.3 儀器 FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD Bioscience);DYCZ-25E電泳儀(北京六一生物科技有限公司);DYCZ-40G轉(zhuǎn)膜儀(北京六一生物科技有限公司);XDS-1倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠);RT-6100酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞為貼壁細(xì)胞,采用含10%新生牛血清、1%青鏈霉素混合液培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)傳代,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用來試驗(yàn)。

1.2.2 MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 培養(yǎng)后的細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,以5 000 cells/well的密接種于96孔板培養(yǎng)板中,用培養(yǎng)基稀釋中藥蠲毒消瘤飲原液后處理細(xì)胞(2、5、10、20、40、和80 μg·mL-1)加入對(duì)應(yīng)的孔中。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后,每孔分別緩慢滴加MTT溶液,再緩慢滴加100 μL DMSO溶解MTT的還原產(chǎn)物,震動(dòng)混勻數(shù)秒,用酶標(biāo)儀檢測(cè),計(jì)算腫瘤細(xì)胞的存活率,利用軟件計(jì)算細(xì)胞的IC50。

1.2.3 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況 將不同濃度的HCT116細(xì)胞培養(yǎng)48 h后接種于6孔板。鏡下觀察細(xì)胞劃痕,并用Leica QwinV3軟件測(cè)量劃痕距離,根據(jù)劃痕距離計(jì)算細(xì)胞的遷移率。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況 用無血清培養(yǎng)基將Matrigel以1∶3比例進(jìn)行稀釋,混勻后鋪于Transwell小室上層。分別加入0、2、5 μg·mL-1蠲毒消瘤飲其基底已鋪膠的 Transwell 小室內(nèi),培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。接下來用4%甲醛固定細(xì)胞,進(jìn)行結(jié)晶紫染色,室溫放置15 min后用蒸餾水脫色,鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將HCT116細(xì)胞計(jì)數(shù),以每孔2×105cell/well的密度接種于6孔板,設(shè)定蠲毒消瘤飲濃度(0、2、5 μg·mL-1),分別加入對(duì)應(yīng)的孔板中,藥物處理48 h,收集細(xì)胞,PBS重懸清洗細(xì)胞并進(jìn)行PI染色,充分混勻后,上機(jī)檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞凋亡的改變。按照流式細(xì)胞儀檢測(cè)4個(gè)象限代表的意義分別為左下象限:正?；罴?xì)胞群;右下象限:處于早期凋亡的細(xì)胞群;右上象限:處于晚期凋亡的細(xì)胞群;左上象限:壞死的細(xì)胞群。

1.2.6 Western blot試驗(yàn) 采用Western blot 試驗(yàn)檢測(cè)VEGF、MEK1/2、ERK1、Ras/Raf以及Raf-1表達(dá)水平變化。在 0、2、5 μg·mL-1蠲毒消瘤飲作用48 h后,采用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白,采用Bradford法檢測(cè)蛋白含量。隨后陸續(xù)進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜等試驗(yàn)方法進(jìn)行顯影和定影。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蠲毒消瘤飲在體外抑制HCT116細(xì)胞增殖 MTT結(jié)果顯示蠲毒消瘤飲作用HCT116細(xì)胞48 h后,各濃度組對(duì)細(xì)胞增殖均有抑制作用,與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.05),并且蠲毒消瘤飲對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈顯著的劑量依賴性,根據(jù)抑制率計(jì)算藥物作用后的IC50值為23.18(見圖1A)。體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蠲毒消瘤飲對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬水平的影響,按照試驗(yàn)要求對(duì)HCT116蛋白進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示表達(dá)量隨著蠲毒消瘤飲藥物劑量的增加而降低(見圖1B)。說明蠲毒消瘤飲能夠有效抑制HCT116細(xì)胞的增殖,并且存在藥物劑量的影響,藥物濃度越大抑制效果越明顯。

A.MTT檢測(cè)蠲毒消瘤飲對(duì)HCT16細(xì)胞增殖的影響;B.體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蠲毒消瘤飲對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116自噬水平的影響圖1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蠲毒消瘤對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖的影響

2.2 蠲毒消瘤飲抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲 劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,蠲毒消瘤飲作用 HCT116細(xì)胞48 h后,能夠抑制細(xì)胞的遷移。隨著藥物濃度的增加,抑制細(xì)胞遷移作用增強(qiáng)(見圖2A)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蠲毒消瘤飲作用結(jié)腸癌細(xì)胞48 h后,能有效抑制細(xì)胞的侵襲。隨著藥物濃度的增加,穿過 Matrigel 凝膠到達(dá)小室下層的細(xì)胞數(shù)逐漸減少,對(duì)侵襲作用的抑制能力逐漸增強(qiáng)(見圖2B)。

A.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果定量(與0 μg·mL-1比較,△P<0.01,▲P<0.001);B.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果定量圖2 蠲毒消瘤飲對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

2.3 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)蠲毒消瘤飲誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡 Annexin V/PI 雙染法結(jié)果顯示,當(dāng)蠲毒消瘤飲作用HCT116細(xì)胞48 h后,活細(xì)胞數(shù)目百分比降低;凋亡細(xì)胞數(shù)目百分比升高,說明蠲毒消瘤對(duì) HCT116 細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用,并且該誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性(見圖3)。

A:流式檢測(cè)蠲毒消瘤飲對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞凋亡的影響;B:流式數(shù)據(jù)定量結(jié)果(與0 μg·mL-1比較,△P<0.01,▲P<0.001)圖3 蠲毒消瘤飲對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響

2.4 Western blot法檢測(cè)蠲毒消瘤飲調(diào)控VEGF信號(hào)通路表達(dá) 當(dāng)蠲毒消瘤飲作用 HCT116 細(xì)胞48 h后,經(jīng)Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中VEGF、MEK1/2、ERK1、Ras/Raf以及Raf-1 表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示,蠲毒消瘤飲能升高細(xì)胞中VEGF表達(dá)(見圖4B),能降低細(xì)胞中 p-MEK1/2、p-ERK1、Ras/Raf以及Raf-1表達(dá)(見圖4A)。

A.WB檢測(cè)蠲毒消瘤飲對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞VEGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響;B.WB檢測(cè)數(shù)VEGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白據(jù)定量結(jié)果(與空白對(duì)照組比較,△P<0.01,▲P<0.001)圖4 蠲毒消瘤飲對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療腫瘤疾病的過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用,其治療癌癥擁有豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),相關(guān)研究報(bào)道,中醫(yī)藥在抑制腫瘤增殖方面也占據(jù)關(guān)鍵地位。中醫(yī)治療尋求辨證論治的思維體系,將發(fā)病機(jī)體作為一個(gè)整體為出發(fā)點(diǎn),故而治療手段宜扶正與祛邪作為主線貫穿始終?？v觀現(xiàn)代醫(yī)學(xué)將放療與化療作為中晚期CRC的主要治療手段,其本質(zhì)是對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用,直擊病灶主要以祛邪為主。其與中醫(yī)的治療思路有著本質(zhì)區(qū)別,中醫(yī)治病與傳統(tǒng)講究中和、中庸,即不偏不倚,無太過與不及,治療宜正邪兼顧,攻補(bǔ)兼施,實(shí)乃顧全大局。根據(jù)機(jī)體情況進(jìn)行辯證治療其虛宜補(bǔ)之,實(shí)宜瀉之,其病機(jī)多以實(shí)證為主,治療宜攻宜瀉;久病則虛致使元?dú)馓澨?治療宜緩宜補(bǔ)。不僅兼顧了患者因病致虛予以補(bǔ)益,同時(shí)也對(duì)病所進(jìn)行攻伐,虛實(shí)相兼[14-16]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥抗腫瘤的研究報(bào)道越來越多,也側(cè)面反映出中醫(yī)藥在治療腫瘤中極具特色,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)制與中醫(yī)理論相結(jié)合,從現(xiàn)代研究中闡述中醫(yī)藥抗腫瘤的作用機(jī)理,對(duì)于腫瘤的防治思路拓展有著重大意義[17-18]。中醫(yī)認(rèn)為該病病因病機(jī)早期多以實(shí)證為主,多見于氣滯、血瘀、熱毒、痰濕等實(shí)邪為病機(jī);發(fā)病時(shí)間期限過長(zhǎng),因病致虛導(dǎo)致元?dú)馓澨撃瞬≈?二者互為影響,最終致使毒火內(nèi)蘊(yùn),經(jīng)絡(luò)瘀阻,津液失布致使血行停滯,聚而為瘀,積而成形最終附著于臟腑,導(dǎo)致氣血失行,漸使精微耗損,大肉漸脫,形容枯槁,終至氣損,久病極虛,機(jī)體日益虛衰,陰陽離決,故癌毒治療上,非重劑猛攻則毒不得散、其結(jié)不得解、非急去其邪則正不能復(fù)。常常由虛而致積,因積而益虛,形成惡性循環(huán)。據(jù)此研制了蠲毒消瘤飲,處方由白花蛇舌草、半枝蓮、半邊蓮、夏枯草、浙貝母、山慈菇、八月札、苦豆子、槐花、地榆、黃芪、太子參、白術(shù)、炙甘草等組成,配伍及治則治法符合中醫(yī)辨證規(guī)律,諸藥合用方可共奏健脾和胃、益氣培元之效。該方以太子參、黃芪聯(lián)用以健脾益氣、大補(bǔ)元陽二者共為君藥;白術(shù)、八月札合用可奏健脾燥濕、醒脾開胃之能,與補(bǔ)益藥合用以防滋膩礙胃,二者是為臣藥共奏健脾益氣,復(fù)生中氣之效;使用白花蛇舌草、半枝蓮、半邊蓮、夏枯草、山慈菇等聯(lián)用是以攻毒消瘤、消瘀散結(jié)之用,而苦豆子是新疆地區(qū)盛產(chǎn)的特色藥材,具有清熱利濕、解毒祛瘀之功效,浙貝母、槐花、地榆聯(lián)用可以清熱涼血、消瘀散結(jié)之功,以上諸藥共為佐藥;予以炙甘草,用以益氣健脾是為使藥;縱觀全方攻補(bǔ)兼?zhèn)?按照中醫(yī)君臣佐使的理念配伍而成,從中醫(yī)角度來說固護(hù)后天之本,方可更好地改善結(jié)腸癌患者基礎(chǔ)代謝,使患者可以帶瘤生存,提高結(jié)腸癌患者的生存質(zhì)量和遠(yuǎn)期療效[19]。

本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),蠲毒消瘤飲抗腫瘤的作用機(jī)理十分突出,MTT結(jié)果顯示蠲毒消瘤飲作用HCT116細(xì)胞,各濃度組對(duì)細(xì)胞增殖均有抑制作用;并且蠲毒消瘤飲對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈顯著的劑量依賴性,對(duì)HCT116蛋白進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示表達(dá)量隨著蠲毒消瘤飲藥物劑量的增加而降低,說明蠲毒消瘤飲能夠有效抑制HCT116細(xì)胞的增殖,并且存在藥物劑量的影響,藥物濃度越大抑制效果越明顯,突顯出中醫(yī)藥在抗腫瘤治療過程中有著十分重要意義。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示,中醫(yī)藥作用下HCT116細(xì)胞遷移受到顯著抑制,隨著藥物濃度的增加,抑制細(xì)胞遷移作用增強(qiáng);Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示,蠲毒消瘤飲作用結(jié)腸癌細(xì)胞能有效抑制細(xì)胞的侵襲,隨著藥物濃度的增加,對(duì)侵襲作用的抑制能力逐漸增強(qiáng)。說明中醫(yī)藥在抑制腫瘤細(xì)胞侵襲有著明顯效果,這對(duì)于臨床中抑制腫瘤細(xì)胞的再分裂和遷移提供有效治療手段。Annexin V/PI雙染法結(jié)果顯示,當(dāng)蠲毒消瘤飲作用HCT116細(xì)胞后,活細(xì)胞數(shù)目百分比降低;凋亡細(xì)胞數(shù)目百分比升高,說明蠲毒消瘤對(duì)HCT116 細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用,并且該誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性。當(dāng)蠲毒消瘤飲作用HCT116細(xì)胞經(jīng)Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF/MEK/Ras/Raf蛋白表達(dá)水平顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)中藥蠲毒消瘤在體內(nèi)體外具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,并且初步說明中藥可能通過調(diào)控 Ras/Raf信號(hào)通路以及VEGF過程而發(fā)揮以上抗癌活性,其機(jī)理研究結(jié)果顯示可以有效改變癌細(xì)胞侵襲、遷移,為臨床用藥提供一定的依據(jù),也為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。