大米中內(nèi)源性香蘭素的研究

陳仁熙，孫瑩瑩，王玉晶，張秀芹

（華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司，廣東深圳 518101）

香蘭素（Vanillin），又名香草醛、3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，是一種應(yīng)用廣泛的食品添加劑和飼料添加劑，在醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)也有廣泛應(yīng)用[1-3]。天然香蘭素是從香莢蘭豆中提取，其安全性得到原國家食品藥品監(jiān)督管理總局、美國食品藥品監(jiān)督管理局、歐洲食品安全局和聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)等多個(gè)國內(nèi)外機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，但由于天然產(chǎn)品價(jià)格昂貴，目前使用的多為合成產(chǎn)品。目前全球?qū)ο闾m素的年需求量約為20 000 t，我國2010 年消耗2 000 多噸，約80%用于食品，10%左右用于飼料[4-5]。過多攝入香蘭素會(huì)導(dǎo)致頭暈、惡心、呼吸困難甚至肝腎損傷，對人體存在一定的危害[6]。糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)限制香蘭素的每日攝入量應(yīng)低于10 mg·kg-1。在食品工業(yè)領(lǐng)域，我國規(guī)定香蘭素、香莢蘭豆浸膏（提取物）等作為食品用香料使用，但對于某些特殊食品，如大米、巴氏殺菌乳、奶油、新鮮水果、鮮肉、鮮蛋、蜂蜜和飲用純凈水等，不得使用食品類香料、香精。近年來，我國食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測管理中，一旦發(fā)現(xiàn)上述食品檢出香蘭素，即判為高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品。

但隨著國內(nèi)外研究的深入，多項(xiàng)研究表明除了香莢蘭豆中含有天然香蘭素，其他如水稻秸稈、米糠及一些果殼中也存在香蘭素，可見，大米中可能存在內(nèi)源性香蘭素。因此，明確大米中是否含有內(nèi)源性香蘭素，對于監(jiān)管部門和大米的生產(chǎn)經(jīng)營者十分必要。

本研究利用國家現(xiàn)有的檢測方法，《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定》（BJS 201705）中的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對從市場隨機(jī)購買的來自不同產(chǎn)區(qū)的203 份大米進(jìn)行摸底檢測，并對產(chǎn)自國內(nèi)的10 份水稻樣品進(jìn)行了檢測，對香蘭素的含量及來源進(jìn)行了簡要分析，以期為政府監(jiān)管政策的調(diào)整提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)檢測的大米樣品均為隨機(jī)購買市售產(chǎn)品，合計(jì)203 批大米試樣（市售，預(yù)包裝食品）；10 份稻谷來源于東北產(chǎn)區(qū)的種植戶。

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（Lot：ALT077120；Purity：99.0%；first standard；CAS：121-33-5）； 乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（Lot：FS1611737；Purity：99.2%；first standard；CAS：120-14-9）；甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，MERCK）；甲酸（色譜純，THERMO FISHER）；氯化鈉（在550 ℃灼燒4 h 后備用）；水為超純水（電阻率=18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（ESI 源，TSQ Endura，Thermo）；渦旋混合器（VORTEX 3，德國艾卡）；超聲波清洗儀（KMH1-240W，GT SONIC）；離心機(jī)（H1850R，湘儀）；分析天平（感量0.1 mg 和0.01 g，ME204E，METILER TOLEDO）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取香蘭素、乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，精密稱定，加甲醇適量使其溶解并定容至10 mL 容量瓶，配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別精密量取香蘭素、乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL 于100 mL容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，配制成10 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；分別精密量取10 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL 和100 μL 于10 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，配制成1 000 μg·L-1和100 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；準(zhǔn)確移取100 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL、100 μL，以及1 000 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL、40 μL、80 μL、100 μL，加入適量甲醇將其稀釋為5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1和100 μg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 前處理方法

稱取（1±0.01）g 樣品（大米和米糠），置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入3 mL 水，渦旋振蕩30 s，加入7 mL 乙腈，渦旋振蕩30 s，超聲處理25 min，10 000 r·min-1離心5 min 后，取上層清液過0.22 μm濾膜，待分析。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters Xbridge C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相：A 相為0.1%甲酸水溶液，B 相為甲醇，梯度洗脫條件見表1；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

表1 梯度洗脫條件

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式； 干燥氣為氮?dú)?，溫度?50 ℃；霧化氣為氮?dú)猓F化器壓力為10 psi；毛細(xì)管電壓：5 500 V；待測化合物定性、定量離子對及碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)見表2。

表2 香蘭素的定性、定量離子對及碰撞能量、去簇電壓參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、檢出限及回收率

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求，線性相關(guān)系數(shù)r應(yīng)＞0.99、回收率應(yīng)在60%～120%、精密度方面相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 應(yīng)＜21%。由表3 可知，香蘭素和乙基香蘭素均在5 ～100 μg·L-1呈良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)均＞0.99。對同一陰性大米樣品進(jìn)行檢出限水平重復(fù)加標(biāo)測定以驗(yàn)證方法回收率和精密度（n=6）。香蘭素回收率為95.15%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%；乙基香蘭素回收率為82.98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%?；厥章屎途芏染鶟M足GB/T 27404—2008 的要求。

表3 大米中香蘭素檢測方法的回收率、曲線及檢出限

2.2 大米及稻谷樣品測定結(jié)果

隨機(jī)購買的203 份大米中198 份檢出香蘭素，含量多在100 ～250 μg·kg-1，詳見表4。10 批稻谷脫殼后，分別對米糠及米進(jìn)行檢測，結(jié)果全部檢出香蘭素，米中香蘭素含量在217.04 ～456.23 μg·kg-1，米糠中香蘭素含量在5 710.91 ～18 470.62 μg·kg-1，詳見表5。

表4 203 批大米樣品的香蘭素檢出量

表5 稻谷樣品不同部位的香蘭素檢出量對比

2.3 內(nèi)源性分析

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定大米中不得添加香蘭素，即檢出值達(dá)到方法定量意味著該產(chǎn)品不符合要求。本研究中檢測的203 批大米中有158 批檢測值超100 μg·kg-1，不符合率為76.9%。由于樣品是隨機(jī)購入并分別來源于廣東、安徽、江蘇、廣西、越南、巴基斯坦及柬埔寨等多個(gè)產(chǎn)地，同時(shí)非法添加的可能性不大，內(nèi)源性可能性更大。

從表4、表5 可以看出，市場隨機(jī)購入的預(yù)包裝大米香蘭素含量差異較大；米糠中香蘭素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于米內(nèi)含量；新脫殼的米中香蘭素含量均高于200 μg·kg-1?？赡茉?yàn)橄闾m素具有揮發(fā)性，其揮發(fā)量受保存時(shí)間和保存環(huán)境的影響，導(dǎo)致其香蘭素檢出量存在差異；香蘭素含量和大米品種密切相關(guān)，有研究表明，不同品種的大米香蘭素含量存在差異。

有研究表明，米糠中含有大量的香蘭素前體物質(zhì)阿魏酸，阿魏酸的C-C 雙鍵結(jié)構(gòu)在氧化后即可成為香蘭素或通過生物轉(zhuǎn)化形成香蘭素。香蘭素的醛基氧化后即可成為香草酸，阿魏酸、香蘭素和香草酸之間具有依次轉(zhuǎn)化關(guān)系。嚴(yán)娜等[7]研究表明有色米中含有香草酸（香蘭素氧化產(chǎn)物）、阿魏酸及沒食子酸等，香草酸含量在9.5 ～110.3 mg·kg-1，阿魏酸含量在27.3 ～84.6 mg·kg-1。

3 結(jié)論

根據(jù)研究結(jié)果，初步判斷大米含內(nèi)源性香蘭素的可能性較大。但目前我國規(guī)定的檢測方法BJS 201705為高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，無法分辯內(nèi)源和外源。建議相關(guān)人員加大研究力度，充分論證大米中是否含內(nèi)源性香蘭素，如果存在內(nèi)源性問題，應(yīng)及早調(diào)整相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)及監(jiān)管措施。