老年結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移病人IL-18、PRL-3表達(dá)與PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)系探究

王雪 邱婷 呂頤菲 高淑娟 郭雪艷

結(jié)直腸癌(CRC)是多發(fā)于老年人群的惡性腫瘤,具有病情進(jìn)展快、侵襲轉(zhuǎn)移迅速等特點(diǎn),發(fā)病率及死亡率居于惡性腫瘤第5位[1]。肝臟作為CRC血行轉(zhuǎn)移的主要靶器官,部分CRC病人會(huì)出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移,增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此,早期診斷及治療CRC肝轉(zhuǎn)移對(duì)改善病人預(yù)后、延長(zhǎng)生存期尤為重要。IL-18作為多功能細(xì)胞因子,能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),在食管癌、胃癌等多種惡性腫瘤中過表達(dá)[3]。促肝再生磷酸酶-3(PRL-3)能促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖及遷移,與惡性腫瘤侵襲有關(guān)[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)是經(jīng)典的促存活及抗凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路中上游信號(hào)分子PI3K在多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子刺激作用下會(huì)被異常活化,從而對(duì)下游底物AKT進(jìn)行激活,導(dǎo)致AKT磷酸化[5-6]。近年來(lái)的研究顯示,PI3K/AKT信號(hào)通路不僅能調(diào)控細(xì)胞周期,參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié),還與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。目前臨床關(guān)于老年CRC肝轉(zhuǎn)移病人IL-18、PRL-3與PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)系的研究較少。本研究通過免疫組化法檢測(cè)IL-18、PRL-3、PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白在老年CRC肝轉(zhuǎn)移病人癌組織中的表達(dá)情況,分析其相關(guān)性,為CRC診療提供參考,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2019年6月至2021年6月收治的100例老年CRC病人,年齡60～79歲,平均(69.23±4.98)歲;男58例(58.00%),女42例(42.00%)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)滿足《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范》[8]中CRC診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)組織病理學(xué)確診;(2)年齡≥60歲;(3)病人簽署知情同意書;(4)首次確診,3個(gè)月內(nèi)未接受免疫治療、放化療;(5)臨床及病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并除肝臟外的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶;(2)既往腹部手術(shù)史者;(3)合并胰腺炎、感染性疾病、炎癥性腸炎、自身免疫性疾病者;(4)其他惡性腫瘤者;(5)預(yù)計(jì)生存時(shí)間<6個(gè)月;(6)腎、腦、心等重要臟器嚴(yán)重?fù)p傷者。根據(jù)是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移分為肝轉(zhuǎn)移組(n=34)及非肝轉(zhuǎn)移組(n=66),肝轉(zhuǎn)移診斷以《中國(guó)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷和綜合治療指南》為標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集:查詢電子病歷系統(tǒng)收集所有病人臨床資料,包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度、癌灶浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。

1.2.2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)IL-18、PRL-3、PI3K、AKT蛋白表達(dá):收集CRC病人癌組織和癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)標(biāo)本,分別取癌組織及癌旁正常組織各200 mg置于1.5 mL的離心管內(nèi),并加入裂解液1000μL對(duì)組織進(jìn)行裂解,低溫離心機(jī)離心(溫度4℃,離心力12 000 r/min)20 min后收集蛋白上清液,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度,于-80℃環(huán)境保存。每個(gè)樣品取總蛋白50μg,加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜,加入5%脫脂牛奶于37 ℃封閉2 h,再分別加入兔抗人IL-18單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗PRL-3單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人PI3K單克隆抗體(1∶500稀釋)及兔抗人AKT單克隆抗體(1∶500稀釋),于4 ℃環(huán)境過夜。電化學(xué)發(fā)光法顯色,內(nèi)參照選擇3-磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)(1∶5000稀釋)。采用Quantity One軟件計(jì)算灰度值,用每一個(gè)樣本的條帶灰度值與相應(yīng)樣本G3PDH的條帶灰度值相比,求出其相對(duì)值。

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁組織中IL-18、PRL-3、PI3K及AKT蛋白表達(dá)比較 癌組織中IL-18、PRL-3、PI3K及AKT蛋白表達(dá)水平均高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織中IL-18、PRL-3、PI3K及AKT蛋白表達(dá)比較

2.2 影響老年CRC肝轉(zhuǎn)移的單因素分析 肝轉(zhuǎn)移組癌組織中IL-18、PRL-3、PI3K及AKT蛋白表達(dá)水平均高于非肝轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。肝轉(zhuǎn)移組癌灶浸潤(rùn)深度T3～T4、低中分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例均高于非肝轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。見表2。

表2 影響老年CRC肝轉(zhuǎn)移的單因素分析(n,%)

2.3 影響老年CRC肝轉(zhuǎn)移的多因素分析 以老年CRC病人是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移為因變量,將IL-18、PRL-3、PI3K、AKT、癌灶浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等單因素分析中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量,進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,IL-18、PRL-3、PI3K、AKT、癌灶浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為老年CRC肝轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 影響老年CRC肝轉(zhuǎn)移的多因素Logistic回歸分析

2.4 老年CRC肝轉(zhuǎn)移病人IL-18、PRL-3與PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示,老年CRC肝轉(zhuǎn)移病人癌組織中IL-18、PRL-3蛋白表達(dá)與PI3K(r=0.653、0.670,均P<0.001)、AKT(r=0.521、0.546,均P<0.001)蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

CRC細(xì)胞可由門靜脈系統(tǒng)回流至肝臟后經(jīng)全身擴(kuò)散,肝轉(zhuǎn)移是引起CRC病人死亡的重要因素[10]。由于早期無(wú)典型癥狀,CRC肝轉(zhuǎn)移診斷相對(duì)困難,易錯(cuò)失最佳救治時(shí)機(jī)[11]。因此,探尋腫瘤標(biāo)志物診斷CRC肝轉(zhuǎn)移已成為臨床研究的熱點(diǎn)。

IL-18主要由巨噬細(xì)胞、免疫細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等產(chǎn)生,屬于免疫調(diào)控細(xì)胞因子,其結(jié)構(gòu)類似于IL-1β。臨床研究發(fā)現(xiàn),IL-18對(duì)惡性腫瘤免疫具有兩面性,一方面能通過提高免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用;另一方面能促進(jìn)腫瘤免疫逃逸及轉(zhuǎn)移,加快惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[12]。IL-18不僅能與IL-15通過協(xié)同作用影響機(jī)體免疫細(xì)胞活性,還能協(xié)同IL-12以活化自然殺傷細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞,從而促進(jìn)INF-γ等殺傷性細(xì)胞因子的釋放[13]。有報(bào)道顯示,胃癌病人IL-18過度表達(dá),IL-18通過上調(diào)CD44、促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子釋放等途徑增加惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及轉(zhuǎn)移能力[14]。PRL-3與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系,在不同腫瘤組織中過表達(dá)。臨床研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中PRL-3陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于正常胃黏膜組織[15]。國(guó)外報(bào)道發(fā)現(xiàn),PRL-3可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,增加不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)[16]。本研究結(jié)果顯示,癌組織中IL-18、PRL-3蛋白表達(dá)均高于癌旁組織,提示IL-18、PRL-3可能參與了CRC的發(fā)生發(fā)展。分析原因?yàn)?IL-18能促進(jìn)NK細(xì)胞膜上PD-1表達(dá)上調(diào),引起T細(xì)胞程序性死亡,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸,從而出現(xiàn)擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移;PRL-3對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及受體產(chǎn)生刺激作用,導(dǎo)致其異常表達(dá),從而刺激腫瘤血管形成,促進(jìn)惡性腫瘤生長(zhǎng)及侵襲。

既往研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲密切相關(guān),在乳腺癌、胃癌及CRC等惡性腫瘤中異常激活[17-18]。PI3K作為胞內(nèi)關(guān)鍵的磷脂激酶,能影響多種生長(zhǎng)因子的活化過程;AKT具有絲蘇氨酸激酶活性,主要通過轉(zhuǎn)錄因子磷酸化調(diào)節(jié)生命活動(dòng)進(jìn)程[18]。本研究發(fā)現(xiàn),癌組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平均高于癌旁組織,表明PI3K、AKT在CRC病人癌組織中呈高表達(dá),PI3K/AKT信號(hào)通路與CRC發(fā)生有關(guān)。究其原因:二磷酸磷脂酰肌醇在PI3K作用下轉(zhuǎn)化為三磷酸磷脂酰肌醇,與AKT氨基末端的PH結(jié)構(gòu)域相互作用,導(dǎo)致底物蛋白磷酸化,縮短G1周期,加速腫瘤細(xì)胞周期,引起腫瘤細(xì)胞大量繁殖,促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn),肝轉(zhuǎn)移組癌組織中IL-18、PRL-3、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平均高于非肝轉(zhuǎn)移組,說(shuō)明IL-18、PRL-3、PI3K、AKT與老年CRC肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)。對(duì)影響老年CRC肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析發(fā)見,IL-18、PRL-3、PI3K及AKT是老年CRC肝轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,進(jìn)一步提示IL-18、PRL-3、PI3K及AKT表達(dá)與老年CRC肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切。臨床可以通過檢測(cè)IL-18、PRL-3、PI3K及AKT表達(dá)情況,評(píng)估老年CRC肝轉(zhuǎn)移情況。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示,老年CRC肝轉(zhuǎn)移病人癌組織中IL-18、PRL-3蛋白表達(dá)與PI3K、AKT蛋白表達(dá)呈正相關(guān),提示IL-18、PRL-3可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移。臨床研究發(fā)現(xiàn),IL-18可能通過調(diào)控PI3K/AKT與NF-κB信號(hào)通路激活腫瘤免疫,從而發(fā)揮抑制結(jié)腸癌的作用[19]。另有研究顯示,PRL-3通過其磷酸酶活性下調(diào)第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN),激活PI3K/Akt信號(hào)通路,上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9,促進(jìn)腹膜轉(zhuǎn)移[20]。

綜上所述,老年CRC肝轉(zhuǎn)移病人IL-18、PRL-3呈高表達(dá)狀態(tài),兩者與PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白存在聯(lián)系,共同作用導(dǎo)致CRC發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。