右美托咪定預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究

周巖巖

武陟濟(jì)民醫(yī)院麻醉科，河南 焦作 454950

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷為臨床常見眼科疾病，眼外傷、高眼壓及視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞等因素為其發(fā)病原因。該病易造成視神經(jīng)出現(xiàn)不同程度損傷，對(duì)視功能有所危害，故保護(hù)視神經(jīng)為眼科研究重點(diǎn)［1］。右美托咪定為美托咪定右旋異構(gòu)體的咪唑類衍生物，是一種選擇性高的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑。研究顯示［2］，右美托咪定心肌缺血再灌注損傷中具有抗氧化應(yīng)激、抗炎及抗細(xì)胞凋亡等作用，且圍術(shù)期使用右美托咪定能降低患者心血管不良事件發(fā)生與死亡率［3］。為此，本研究探討了右美托咪定預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)與機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取30只雄性大鼠，來源于上海凱學(xué)生物科技有限公司，8周齡，體重為50～250 g。

1.2 方法

將30只雄性大鼠分為健康組、缺血組和預(yù)處理組，每組10只。健康組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均正常，缺血組采用高眼壓法制造的大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注模型，預(yù)處理組對(duì)缺血組小鼠進(jìn)行了右美托咪定預(yù)處理。分別于缺血前15 min作用及再灌注前5 min左右，健康組及缺血組按照5 mL/kg大鼠體重進(jìn)行生理鹽水灌注，預(yù)處理組對(duì)缺血組小鼠按照25 μg/kg大鼠體重進(jìn)行了鹽酸右美托咪定（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20183219）預(yù)處理灌注。

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型建立方法：先對(duì)本實(shí)驗(yàn)30只大鼠進(jìn)行11%水合氯醛全身麻醉，再局部滴用0.4%倍諾喜言表進(jìn)行眼部麻醉3次。麻醉后，采用固定器將大鼠按照仰臥位放置，采用0.5%作用的氯霉素眼藥水對(duì)大鼠眼部結(jié)膜囊進(jìn)行嚴(yán)格清洗，最后用安爾碘對(duì)大鼠眼眶及其周圍視野進(jìn)行嚴(yán)格消毒，防止其余物質(zhì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。將輸液器開始一端和血壓計(jì)相連的水銀柱輸氣管用三通管連接。通過進(jìn)行不同程度的手部按壓將水銀柱升高至14 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。采用穿刺針頭插入大鼠右眼結(jié)膜，直至找到前房位置，通過觀察水銀柱記錄大鼠的眼內(nèi)壓。視網(wǎng)膜缺血再灌注時(shí)，為防止角膜因長時(shí)間暴露過于干燥，需要進(jìn)行間斷性的在角膜間滴加生理鹽水，通過人為按壓，將眼內(nèi)壓升高至110 mmHg，為造成視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷需要一直維持約1 h。隨后即可慢慢的關(guān)掉充氣柄開關(guān)，當(dāng)眼內(nèi)壓降低到14 mmHg后，為防止損傷眼膜及其周圍晶狀體組織，需要慢慢的拔除針頭，并于大鼠眼結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏預(yù)防感染。

1.3 觀察指標(biāo)

比較三組大鼠于再灌注24 h時(shí)的視網(wǎng)膜電圖（ERG）、細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）、促凋亡因子（Bax）、抑凋亡因子（Bcl-2）表達(dá)水平、腫瘤壞死因子（TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)水平。

（1）比較三組大鼠于再灌注24 h 時(shí)ERG：大鼠在經(jīng)過暗適應(yīng)半小時(shí)后對(duì)被檢眼給予1%地卡因表面麻醉，0.5 g/L托吡卡胺進(jìn)行充分散瞳。大鼠被檢眼用固定架固定后保持不動(dòng)，在角膜上置封閉式角膜接觸鏡電極，另一電極置于額部，眼附近的面部安放參考電極，接地電極置于耳前。先作暗適應(yīng)閃光視網(wǎng)膜電圖或圖像視網(wǎng)膜電圖，然后明適應(yīng)1 min，再作光適應(yīng)閃光視網(wǎng)膜電圖或圖像視網(wǎng)膜電圖。觀測(cè)a 與b 波的潛時(shí)和波幅，觀測(cè)震蕩波［4］。（2）比較三組大鼠于再灌注24 h時(shí)的AI：石蠟切片二甲苯和梯度乙醇脫蠟、水化后，使用PBS進(jìn)行沖洗，于37 ℃下用蛋白酶K工作液進(jìn)行處理；用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（德國Roche 公司，TUNEL）處理，于熒光顯微鏡（Olympus，ix53型）下觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。隨機(jī)選擇各切片5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞，凋亡細(xì)胞核棕褐色，AI=凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)/總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%［5］。（3）比較三組大鼠治療后Bax 及Bcl-2 表達(dá)水平：向視網(wǎng)膜組織加入蛋白裂解液以提取其蛋白，實(shí)用BCA試劑盒測(cè)定其濃度，蛋白樣品置于離心管內(nèi)，加上樣緩沖液煮沸使其變性，保存?zhèn)溆?；制?0%SDS-PAGE分離膠與5%濃縮膠，分別取蛋白樣品上樣，電泳后移入PVDF 膜中，封閉后加入Bax 一抗、Bcl-2 一抗孵育過夜。采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描測(cè)定灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平為目的蛋白條灰度值/內(nèi)參β-actin 條灰度值。（4）比較三組大鼠治療后TNF-α及IL-6 表達(dá)水平：取患者治療前治療后靜脈血各5 mL，以3 000 r/min離心處理10 min，取上層血清，使用采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清TNF-α、IL-6水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊使用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠左右眼ERG b波振幅情況

健康組ERG 顯著優(yōu)于缺血組，缺血組ERG 顯著優(yōu)于預(yù)處理組，三組大鼠組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠左右眼ERG b波振幅情況（±s）μV

表1 三組大鼠左右眼ERG b波振幅情況（±s）μV

組別健康組（n=10）缺血組（n=10）預(yù)處理組（n=10）F值P值左眼154.81±8.86 23.92±2.78 57.25±4.56 1 296.980＜0.001右眼160.62±7.24 32.14±7.29 73.78±9.35 667.990＜0.001

2.2 三組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)情況

健康組AI 顯著優(yōu)于缺血組，缺血組AI 顯著優(yōu)于預(yù)處理組，三組大鼠組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)情況（±s）%

表2 三組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)情況（±s）%

組別健康組（n=10）缺血組（n=10）預(yù)處理組（n=10）F值P值A(chǔ)I 1.55±0.16 14.36±4.58 7.52±2.73 43.320＜0.001

2.3 三組大鼠凋亡因子情況

健康組Bax 顯著高于缺血組，缺血組Bax 顯著高于預(yù)處理組；健康組Bcl-2顯著低于缺血組，缺血組Bcl-2顯著低于預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組大鼠凋亡因子情況（±s）

表3 三組大鼠凋亡因子情況（±s）

組別健康組（n=10）缺血組（n=10）預(yù)處理組（n=10）F值P值Bax 1.33±0.26 2.54±0.43 1.13±0.31 50.090＜0.001 Bcl-2 1.87±0.26 0.94±0.13 1.62±0.21 54.040＜0.001

2.4 三組大鼠炎癥因子水平情況

健康組TNF-α、IL-6 顯著高于缺血組，缺血組TNF-α、IL-6 顯著高于預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 三組大鼠炎癥因子水平（±s）ng/mL

表4 三組大鼠炎癥因子水平（±s）ng/mL

組別健康組（n=10）缺血組（n=10）預(yù)處理組（n=10）F值P值TNF-α 1.33±0.20 2.68±0.24 1.52±0.21 113.060＜0.001 IL-6 1.23±0.25 2.86±0.37 1.63±0.08 105.190＜0.001

3 討論

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷為常見眼科疾病，臨床表現(xiàn)為血液再通后視網(wǎng)膜嚴(yán)重?fù)p傷，視功能顯著下降。右美托咪定為高選擇性與特異性的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，廣泛應(yīng)用于圍術(shù)期及ICU中，具有抑制交感神經(jīng)活性、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗焦慮與催眠等功效。圍術(shù)期給予右美托咪定能維持機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，降低心臟以外風(fēng)險(xiǎn)。缺血再灌注損傷表現(xiàn)為電生理生化與形態(tài)等變化，最先發(fā)生的為電生理變化，ERG為視覺電生理中代表性部分，是客觀評(píng)價(jià)視功能成熟有效的無創(chuàng)方式。視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷預(yù)防目的是延緩或阻止視神經(jīng)細(xì)胞死亡，防止視功能繼續(xù)損失，故在神經(jīng)保護(hù)藥物中對(duì)視功能評(píng)估極為重要［6］。ERG的a波來自于感受器層，反映視網(wǎng)膜光感受器電位變化，b 波集中反映視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞與Muller細(xì)胞電活動(dòng)；且視網(wǎng)膜各層，尤其是顆粒細(xì)胞層細(xì)胞均參與b 波形成。研究顯示［7］，視網(wǎng)膜缺血先影響b波，b波組織對(duì)缺血影響比a波產(chǎn)生更明顯。缺血組ERG 的a、b 波振幅均降低，且隨著時(shí)間延長而持續(xù)性下降，提示缺血再灌注后對(duì)視網(wǎng)膜功能損傷在持續(xù)，該部分損傷是因恢復(fù)血供的再灌注損傷導(dǎo)致。預(yù)處理組ERG 的a、b 波有所上升，說明右美托咪定對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后有保護(hù)作用。視網(wǎng)膜為神經(jīng)組織，血供來源于視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈，該動(dòng)脈為終動(dòng)脈，視網(wǎng)膜極易在缺血情況下受損。視網(wǎng)膜缺血再灌損傷機(jī)制較為復(fù)雜，為多因素作用結(jié)果，包括細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基損傷、細(xì)胞凋亡壞死及炎癥反應(yīng)等病理生理過程［8］。細(xì)胞凋亡包括外源性或死亡受體途徑和內(nèi)源性或線粒體途徑導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，前一途徑是細(xì)胞通過激活死亡受體接受接頭蛋白Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，招募激活半胱氨酸蛋白酶以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶在凋亡信號(hào)下，開放線粒體膜上通道，釋放內(nèi)部細(xì)胞色素與半胱氨酸蛋白酶前提蛋白，激活其核酸酶或抑制胞內(nèi)抗凋亡蛋白，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［9］。細(xì)胞色素c為線粒體呼吸鏈重要組成，釋放于胞漿中能激活半胱氨酸蛋白酶9，使該酶3 激活以誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究顯示［10］，抑凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax 比值與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷能使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過Bcl-2家族調(diào)控實(shí)現(xiàn)，故可將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡認(rèn)為內(nèi)源性或線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。本研究中健康組Bcl-2顯著低于缺血組，缺血組Bcl-2顯著低于預(yù)處理組，提示右美托咪定能通過抑制細(xì)胞凋亡以減輕大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷。本研究顯示，相對(duì)于健康組，模型組TNF-α及IL-6等炎癥因子水平顯著上升，說明視網(wǎng)膜缺血再灌注時(shí)機(jī)體組織產(chǎn)生大量炎癥因子，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。相對(duì)于缺血組，預(yù)處理組視網(wǎng)膜組織中TNF-α及IL-6水平明顯降低，提示右美托咪定能抑制炎癥因子分泌，減弱大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型中炎癥反應(yīng)。

綜上所述，右美托咪定可能通過促進(jìn)Bcl-2 表達(dá)，抑制Bax 表達(dá)以改善細(xì)胞凋亡指數(shù)，同時(shí)能夠抑制TNF-α、IL-6表達(dá)，降低視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷炎癥效應(yīng)，進(jìn)而為改善視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。