真核生物“基因剪刀”首現(xiàn)

牛荷

6月28日，基因編輯領(lǐng)域備受矚目的張鋒團(tuán)隊(duì)在《自然》雜志發(fā)文稱，在真核生物中首次發(fā)現(xiàn)了“基因剪刀”。張鋒是美國(guó)麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)博德研究所的核心成員之一，也是麻省理工學(xué)院麥戈文腦研究所的研究員?；蚓庉嬁赏ㄟ^(guò)對(duì)基因組序列的精確修飾，為疾病治療提供新的精準(zhǔn)療法。

張鋒團(tuán)隊(duì)稱，研究人員在真核生物中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)RNA引導(dǎo)的DNA切割酶——Fanzor蛋白，該蛋白質(zhì)在真核生物中普遍存在。真核生物包括真菌、植物和動(dòng)物。這也意味著，RNA引導(dǎo)的DNA切割機(jī)制存在于所有生命體中。更重要的是，這一新“剪刀”可以被優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)人類基因組的編輯。

7月1日，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院和工程院院士、哈佛醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系教授喬治·丘奇接受《中國(guó)新聞周刊》采訪時(shí)表示，F(xiàn)anzor很難擊敗處于最好情況下的CRISPR/Cas9，后者基因編輯效率已經(jīng)接近100％。不過(guò)，當(dāng)處于最糟糕細(xì)胞類型和基因組位點(diǎn)組合的情況下，F(xiàn)anzor存在擊敗CRISPR/Cas9的可能性。喬治·丘奇被譽(yù)為基因組學(xué)之父，獲2016年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)提名，曾是張鋒的博士后導(dǎo)師。

更多真核生物“基因剪刀”或被發(fā)現(xiàn)

如今最廣泛使用的“基因剪刀”CRISPR/Cas存在于原核生物中，原核生物主要指細(xì)菌。2012年，法國(guó)科學(xué)家埃馬紐爾·夏彭蒂耶和美國(guó)科學(xué)家詹妮弗·杜德納在《科學(xué)》雜志發(fā)文并首次指出，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外能“定點(diǎn)”對(duì)DNA切割，CRISPR在活細(xì)胞中有修改基因的能力。此后，科學(xué)家們一直想知道真核生物中是否存在類似系統(tǒng)，這也推動(dòng)了Fanzor系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng)。某些細(xì)菌遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲(chǔ)到自身DNA里，這一存儲(chǔ)空間被稱為CRISPR。病毒再次入侵時(shí)，細(xì)菌能根據(jù)存寫的片段識(shí)別病毒，用“基因魔剪”將病毒的DNA切斷。CRISPR，即成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列。Cas蛋白是一種核酸內(nèi)切酶，對(duì)目的基因進(jìn)行剪切，如Cas9和Cas12。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入、技術(shù)最成熟、應(yīng)用最廣泛的類別。

2021年9月，張鋒團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》雜志發(fā)表一項(xiàng)研究，重建了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的進(jìn)化起源。該研究在細(xì)菌中鑒定出一類新的核酸酶，屬于RNA引導(dǎo)核酸酶，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)，可用于在人類細(xì)胞中編輯基因。這類新的核酸酶被命名為“OMEGA”，這其中包括一種名為TnpB的核酸酶。該研究推測(cè)TnpB或是Cas12的祖先。

張鋒團(tuán)隊(duì)6月28日最新的研究表明，TnpB也可能是真核蛋白Fanzor的祖先，推測(cè)Fanzor酶也可能具有基因編輯能力。早在2013年，發(fā)表在《移動(dòng)DNA》上的一篇研究指出，這兩種蛋白有著某些共同點(diǎn)，并推測(cè)這些共同點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控和天然化合物的合成，起至關(guān)重要的作用。

張鋒團(tuán)隊(duì)的最新研究中，研究人員通過(guò)從真菌、藻類、變形蟲等不同物種中分離出Fanzor蛋白，觀察發(fā)現(xiàn)其與TnpB蛋白、Cas12有相似結(jié)構(gòu)。研究人員認(rèn)為，“緊湊的Fanzor系統(tǒng)”比CRISPR/Cas系統(tǒng)更容易用于特定細(xì)胞和組織。通過(guò)提高靶向效率，這些Fanzor系統(tǒng)可成為編輯人類基因組的工具。

上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授、基因編輯中心主任陳佳告訴《中國(guó)新聞周刊》，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了目前廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas系統(tǒng)之外的一種新基因編輯系統(tǒng)。研究主要亮點(diǎn)在于，首次在真核生物中發(fā)現(xiàn)RNA介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，而真核細(xì)胞和人體細(xì)胞結(jié)構(gòu)更接近。在陳佳看來(lái)，后續(xù)基因編輯的研究可能也會(huì)朝著這一方向開展。Fanzor屬于真核生物中第一代“剪刀”，后續(xù)二代、三代應(yīng)該也會(huì)很快被開發(fā)出來(lái)。

“這項(xiàng)研究為基因編輯提供一種新的備選方案，是該領(lǐng)域一項(xiàng)重要進(jìn)步?！比A中農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)學(xué)院教授張安定告訴《中國(guó)新聞周刊》，2012年在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)具有里程碑意義，相當(dāng)于找到了細(xì)菌防御系統(tǒng)和新型基因編輯工具，張鋒團(tuán)隊(duì)在其中也作出重要貢獻(xiàn)。隨后他們開始尋找防御系統(tǒng)的源頭，現(xiàn)這一防御系統(tǒng)擴(kuò)大到了真核生物，這是比較大的突破。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)起作用的部分包括Cas9和負(fù)責(zé)在基因組上精確定位的向?qū)NA。通俗講，Cas9和向?qū)NA就像一把“剪刀”和一把“尺子”，“尺子”負(fù)責(zé)在基因組上精準(zhǔn)找到需要編輯的位置，“剪刀”對(duì)基因組剪切。完成目標(biāo)基因的剪切編輯之后，“剪刀”和“尺子”都會(huì)被細(xì)胞完全清除掉。

任何一種基因編輯技術(shù)，靶位點(diǎn)的選擇都是首要問(wèn)題。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，剪切點(diǎn)只有位于處于特定位置的PAM序列的上游，才能夠被準(zhǔn)確識(shí)別和切割?！癈as酶切割DNA需要找到PAM序列，F(xiàn)anzor蛋白實(shí)現(xiàn)DNA切割，也需要找到一段特定的TAM序列。從這點(diǎn)來(lái)看，兩者比較相似，因?yàn)榍懈钇玫男蛄胁煌?，也存在序列互補(bǔ)性。”陳佳說(shuō)。

能替代CRISPR/Cas“魔剪”嗎？

前述最新研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，在所檢測(cè)的4種Fanzor蛋白中，有3種蛋白對(duì)特定DNA序列編輯的效率達(dá)到11.8％。這一水平與早期版本CRISPR系統(tǒng)相當(dāng)，但低于優(yōu)化過(guò)后的CRISPR系統(tǒng)。之后，通過(guò)工程化技術(shù)，研究人員在Fanzor蛋白中引入了特定突變，使其活性增加約10倍。

陳佳告訴《中國(guó)新聞周刊》，從2012年CRISPR系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)至今，全球很多實(shí)驗(yàn)室在CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)化和改造方面投入巨大。即便在這項(xiàng)工作中Fanzor的編輯效率較其初始狀態(tài)提高了10倍，但還是達(dá)不到CRISPR/Cas9目前的編輯效率。不過(guò)，F(xiàn)anzor有其自身優(yōu)勢(shì)，與CRISPR蛋白不同，F(xiàn)anzor本身源自真核系統(tǒng)，有可能在臨床治療中能避免非必要的免疫反應(yīng)。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)較成熟，F(xiàn)anzor未來(lái)通過(guò)優(yōu)化，也可能實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)高效的切割。

與某些CRISPR系統(tǒng)和TnpB蛋白不同，研究人員觀察到，真菌衍生的Fanzor蛋白不表現(xiàn)出“附帶活性”。附帶活性是指當(dāng)RNA引導(dǎo)的“剪刀”靶向切割DNA時(shí)，會(huì)同時(shí)降解鄰近的DNA或RNA。因此，F(xiàn)anzor蛋白被視為更具專一性。

近日，張鋒接受外媒采訪時(shí)表示，F(xiàn)anzor蛋白的尺寸較小，含有400～700個(gè)氨基酸不等。CRISPR中最常用的Cas9蛋白約含1000～1600個(gè)氨基酸?！熬庉嬈髟酱?，遞送到體內(nèi)就越困難?！彼f(shuō)。據(jù)2021年9月張鋒團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》雜志的研究，被稱為“OMEGA”的一類核酸酶很小，約為Cas9的30％，它們可能更容易被遞送到細(xì)胞中。

張鋒。圖/博德研究所

在陳佳看來(lái)，很多基因編輯系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室水平效果不錯(cuò)，但進(jìn)展到人體臨床試驗(yàn)水平，編輯效率不一定高，出現(xiàn)這種問(wèn)題的主要原因在于遞送過(guò)程。在CRISPR系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行編輯時(shí)，需要通過(guò)載體將這些大蛋白遞送到體內(nèi)準(zhǔn)確位置才能發(fā)揮作用。相較Cas9，F(xiàn)anzor蛋白體積小，在遞送過(guò)程中更靈活、便利。

在張安定看來(lái)，選擇怎樣的基因編輯工具，取決于實(shí)際應(yīng)用的目的，基因編輯效率和脫靶是重要的考慮因素。雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)已被廣泛使用，但它并非“包打天下”，其在有些細(xì)胞中的效率并不高，且存在脫靶等安全隱患。Fanzor蛋白更小，可能在一定場(chǎng)景下使用時(shí)更有優(yōu)勢(shì)?！把芯恐袥](méi)有提到Fanzor蛋白是否能避免潛在的脫靶等問(wèn)題，但也可能和Cas一樣，需要通過(guò)后續(xù)研究進(jìn)一步提高基因編輯活性和減少潛在脫靶等問(wèn)題?！彼f(shuō)。

“到目前為止，還沒(méi)有出現(xiàn)超越CRISPR的技術(shù)。Fanzor想在應(yīng)用上取代CRISPR/Cas系統(tǒng)，還有很長(zhǎng)的路要走?！敝袊?guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院教授陳其軍告訴《中國(guó)新聞周刊》，盡管Fanzor系統(tǒng)在基因治療上存在遞送藥物優(yōu)勢(shì)，但如果編輯效率不高，靶點(diǎn)受太多限制，在醫(yī)療上的應(yīng)用也很難超越CRISPR/Cas。

Fanzor蛋白冷凍電鏡結(jié)構(gòu)示意圖。圖/張鋒實(shí)驗(yàn)室

目前尚無(wú)CRISPR基因療法獲批

CRISPR基因編輯技術(shù)，無(wú)疑是目前生物技術(shù)領(lǐng)域最具革命性的突破之一。2020年，夏彭蒂耶和杜德納因發(fā)現(xiàn)“基因剪刀”CRISPR/Cas9，共同獲得當(dāng)年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，獲獎(jiǎng)時(shí)距離這項(xiàng)技術(shù)被發(fā)明還不到10年。

張鋒無(wú)緣諾獎(jiǎng)，卻贏了專利之爭(zhēng)。2013年年初，張鋒等人首次將CRISPR/Cas9技術(shù)成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞的基因編輯。同年，丘奇在《科學(xué)》雜志上發(fā)表的研究也顯示，CRISPR系統(tǒng)可用于人類細(xì)胞基因組編輯。

這些進(jìn)展極大推動(dòng)了CRISPR/Cas9技術(shù)的推廣和應(yīng)用。自2013年起，張鋒和前述兩名諾獎(jiǎng)獲得者均基于該技術(shù)創(chuàng)立了多家公司。此后，張鋒與杜德納和夏彭蒂耶等人著名的專利權(quán)之爭(zhēng)拉開序幕。

2022年2月，美國(guó)專利和商標(biāo)局裁定，張鋒團(tuán)隊(duì)擁有在真核細(xì)胞中使用CRISPR基因編輯技術(shù)的專利。這意味著，張鋒和他所在的博德研究所在美國(guó)擁有CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于所有真核生物的專利，包括植物、動(dòng)物和人類。這是CRISPR技術(shù)商業(yè)化最為核心的專利之一。

近年來(lái)，科學(xué)家們?cè)贑RISPR/Cas9治療疾病領(lǐng)域持續(xù)探索。2020年，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤科盧鈾團(tuán)隊(duì)在《自然-醫(yī)學(xué)》發(fā)布Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果，表明用使用CRISPR/Cas9技術(shù)治療難治性非小細(xì)胞肺癌患者安全可行。

在陳佳看來(lái)，目前基因編輯治療在地中海貧血癥、鐮刀貧血癥等血液類遺傳病治療領(lǐng)域走得靠前，國(guó)內(nèi)外已有幾項(xiàng)關(guān)鍵性治療管線進(jìn)入臨床階段。此外，通用型CAR-T聯(lián)合基因編輯療法，目前研究進(jìn)展也比較快。

2022年3月17日，國(guó)家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心官網(wǎng)顯示，南京北恒生物科技有限公司自主研發(fā)的細(xì)胞注射液產(chǎn)品獲得國(guó)家藥監(jiān)局的臨床試驗(yàn)?zāi)驹S可。該產(chǎn)品屬于通用型CAR-T，用于治療成人復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病，是國(guó)內(nèi)首個(gè)基于CRISPR基因編輯技術(shù)的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品。

丘奇告訴《中國(guó)新聞周刊》，F(xiàn)anzor的商業(yè)前景和其他數(shù)百種內(nèi)切酶相似。不過(guò)，F(xiàn)anzor距離真正商業(yè)化應(yīng)用，似乎還有很遠(yuǎn)。因?yàn)榧幢闶且延胁簧倥R床研究進(jìn)展的CRISPR/Cas技術(shù)，目前獲批的相關(guān)基因療法數(shù)目仍為0。

“迄今為止，已獲美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的基因療法共有12種，均不涉及CRISPR?！鼻鹌姹硎荆@種情況將在2023年12月8日改變，目前有一種CRISPR相關(guān)的基因療法處于生物制劑許可申請(qǐng)（BLA）階段。一般藥物的Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)束，被驗(yàn)證安全性、有效性之后，可以正式向FDA提交BLA申請(qǐng)。

6月8日，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）宣布，接受名為exa-cel療法的生物制品許可申請(qǐng)。該療法由美國(guó)福泰制藥與瑞士基因編輯公司CRISPR Therapeutics合作開發(fā)，用于治療嚴(yán)重鐮狀細(xì)胞病和輸血依賴性β地中海貧血，能夠幫助患者有效擺脫輸血和血管阻塞危機(jī)。美國(guó)福泰制藥當(dāng)日發(fā)表的新聞稿稱，“這種療法有望成為第一個(gè)獲得批準(zhǔn)的CRISPR基因編輯療法?！盋RISPR Therapeutics的創(chuàng)始人正是2020年憑借CRISPR基因編輯獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的夏彭蒂耶。

為何真正能走向獲批的CRISPR基因療法很少？丘奇解釋，CRISPR主要用于“減法”，即對(duì)目標(biāo)基因完成剪切、編輯。他表示，一般遺傳性血管性水腫等顯性疾病可以通過(guò)減少突變等位基因來(lái)治療，但這種情況非常罕見(jiàn)。疾病治療時(shí)通常需要“加法”，比如，所有的衰老基因療法都是添加基因，很多情況下，疫苗制備要添加一個(gè)或多個(gè)外源基因。

“基因編輯的工具箱越大，可選方式越多，對(duì)科學(xué)研究和臨床治療的幫助就越大?！标惣驯硎?。在他看來(lái)，如果后續(xù)僅把Fanzor用作內(nèi)切酶進(jìn)行基因編輯治療，也會(huì)面臨和CRISPR/Cas9一樣的風(fēng)險(xiǎn)；如果將Fanzor作為平臺(tái)開發(fā)新型的堿基編輯器等，可能實(shí)現(xiàn)更安全的基因編輯治療。

堿基編輯系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)單核苷酸精度的DNA或RNA編輯。6月27日，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞等發(fā)表在《細(xì)胞》雜志的一項(xiàng)研究，運(yùn)用AI輔助結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，開發(fā)了一系列新型堿基編輯工具，在小鼠細(xì)胞系中成功獲得高達(dá)43.1％的編輯效率，解決了常規(guī)堿基編輯器過(guò)大而無(wú)法被遞送的難題。

在丘奇看來(lái)，基于Fanzor系統(tǒng)的基因編輯療法未來(lái)也可能會(huì)獲FDA批準(zhǔn)上市?！暗S多天然存在或人工合成的新RNA可編程系統(tǒng)占比不大，相對(duì)應(yīng)地，簡(jiǎn)單的添加性基因治療方法正在迅速發(fā)展?！鼻鹌姹硎尽?/p>