中間球海膽CS基因克隆及其響應(yīng)急性高溫脅迫的表達(dá)模式

孫繼紅 任麗媛 崔東遙 趙譚軍 常亞青 湛垚垚

摘要：【目的】明確中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）檸檬酸合酶（CS）基因（SiCS）的序列特征、組織表達(dá)情況及其應(yīng)對(duì)急性高溫脅迫的響應(yīng)規(guī)律，為研究SiCS基因功能及揭示其參與中間球海膽高溫應(yīng)答的分子機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷肦ACE克隆SiCS基因cDNA序列，通過BLASTx、EXPASY Proteomics Server、HMMER、PSIRED v3.3及SWISS-MODEL等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析；然后采用分光光度法檢測(cè)中間球海膽管足和性腺線粒體腫脹度，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SiCS基因的組織表達(dá)規(guī)律，并以Epoch酶標(biāo)儀測(cè)定中間球海膽管足和性腺總SiCS活性變化情況。【結(jié)果】SiCS基因cDNA序列全長2971 bp，5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）和3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）分別為96和1480 bp，開放閱讀框（ORF）為1395 bp，共編碼464個(gè)氨基酸殘基。SiCS蛋白分子量約51.48 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.09，總平均親水性（GRAVY）為-0.178，為穩(wěn)定的溫和疏水性蛋白；SiCS蛋白不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占43.86%、β-折疊占7.02%、無規(guī)則卷曲占49.12%，三維結(jié)構(gòu)模型與野豬CS蛋白晶體結(jié)構(gòu)的一致性為73.97%。SiCS氨基酸序列與紫球海膽（S. purpuratus）的CS氨基酸序列相似性最高，為92.90%。SiCS基因在中間球海膽的5種組織中均有表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)轶w腔細(xì)胞>圍口膜>性腺>管足>腸道；總SiCS活性排序則為管足>腸道>圍口膜>性腺>體腔細(xì)胞；與對(duì)照組（20 ℃）相比，經(jīng)23和26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽管足和性腺的SiCS基因相對(duì)表達(dá)量及總SiCS活性均呈波動(dòng)變化規(guī)律，但在不同高濕脅迫下和不同組織中有所差異?！窘Y(jié)論】中間球海膽可能通過調(diào)整組織中的SiCS基因相對(duì)表達(dá)及SiCS活性來響應(yīng)急性高溫脅迫，且這種響應(yīng)策略存在一定的組織和溫度特異性，具體表現(xiàn)為性腺對(duì)急性高溫脅迫較管足更敏感。

關(guān)鍵詞：中間球海膽；檸檬酸合酶（CS）；急性高溫脅迫；表達(dá)模式；酶活性

中圖分類號(hào)：S968.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0586-12

Abstract：【Objective】To clarify the sequence characteristics，tissue expression rules and its expression patterns in response to acute heat stress of citrate synthase （CS） gene （SiCS） in Strongylocentrotus intermedius. The results of this study would provide a theoretical basis for further study of the biological function of SiCS gene and reveal the molecular mechanism of its involvement in the high temperature response of S. intermedius. 【Method】The cDNA sequence was cloned by using the rapid amplification of cDNA ends （RACE） technology. Bioinformatics analysis was carried out by online softwares such as BLASTx， EXPASY Proteomics Server， HMMER， PSIRED v3.3 and SWISS-MODEL. Mitochondria swelling degree of the tube foot and gonad were measured by spectrophotometry. Tissue relative expression of SiCS was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）； the changes of total SiCS activity in the tube foot and gonad of S. intermedius were measured by Epoch assay. 【Result】The results showed that the full length of SiCSc DNA was 2971 bp， containing a 5' end non-coding region （5'-UTR） of 96 bp， a 3' end non-coding region （3'-UTR）of 1480 bp， and an open reading frame（ORF） of 1395 bp which encoded 464 amino acids residues. The predicted molecular weight and the theoretical isoelectric point （pI） of SiCS protein were 51.48 kD and 6.09 respectively. SiCS was a stable mild hydrophobic protein with an average hydrophilicity （GRAVY） of -0.178. SiCS had no signal peptideand transmembrane. In the secondary structure， α-helix accounted for 43.86%， β-fold accounted for 7.02%， and random coil accounted for 49.12%.The consistency between the three dimensional structure of SiCS and the crystal structure of CS protein from Sus scrofa was 73.97%. Phylogenetic analysis indicated that the SiCS protein had the most similarity with CS protein from Strongylocentrotus purpuratus （similarity：92.90%）. Relative gene expression data showed that SiCS was expressed in all examined tissues and the expression level from high to low was as coelomcytes>interdental muscle>gonad>tube foot>intestine. Total enzyme activity assay revealed that the level of total SiCS enzyme activity in different tissues from high to low was as tube foot>intestine>interdental muscle>gonad>coelomcytes. Compared with the control group （20 ℃）， the relative expression level of the SiCS gene and the total SiCS activity in the tube foot and gonad of S. intermediuss howed fluctuations after acute heat stress at 23 and 26 ℃， and there were some differences under different heat stresses and in different tissues. 【Conclusion】S. intermedius mightrespond to acute heat stress by adjusting the relative expression of SiCS gene and SiCS enzyme activity in different tissues，and this response strategy hascertain tissue and temperature specificity， which specifically shows that the gonad is more sensitive to acute heat stress than the tube foot.

Key words： Strongylocentrotus intermedius； citrate synthase（CS）； acute heat stress； gene expression； enzyme activity

Foundation items： “Xingliao Talents Plan” Project of Liaoning（XLYC2002107）； Liaoning Innovative Talent Support Program of Colleges and Universities （LR2020065）；

0 引言

【研究意義】海水溫度作為最重要的環(huán)境因子之一，其變化會(huì)對(duì)海洋生物帶來廣泛且深遠(yuǎn)的負(fù)面影響。海水暖化通過影響三羧酸循環(huán)代謝進(jìn)程而影響貝類（Cherkasov et al.，2007；Tomanek，2012；Gorenkova et al.，2013）、魚類（Martinez et al.，2016）及刺胞生物（Hawkins and Wamer，2017）體內(nèi)的生理和生化活動(dòng)，如30 ℃高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致美洲牡蠣（Crassostrea virginica）腮組織細(xì)胞線粒體中的烏頭酸酶活性降低34%（Sanni et al.，2008）。趙志剛等（2016）研究表明，隨著馴化溫度的升高，施氏鱘（Acipenser schrencki）幼魚肝臟線粒體細(xì)胞色素Ｃ氧化酶（Cytochrome oxidase，CCO）活性逐漸增加。檸檬酸合酶（Citrate synthase，CS）是三羧酸循環(huán)的第一個(gè)限速酶，對(duì)維持不同類型細(xì)胞能量的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用（Schlichtholz et al.，2005；Chen et al.，2014；MacPherson et al.，2017）。CS對(duì)高溫較敏感，38 ℃可嚴(yán)重造成豬心臟線粒體中的CS失活（劉箭和莊野真理子，2001），32 ℃可導(dǎo)致大鼠（Rattus norvegicus）肝臟組織中的CS含量顯著降低（姚鳳云等，2018），但目前關(guān)于海水升溫對(duì)中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）CS的影響尚無研究報(bào)道。因此，克隆中間球海膽CS基因（SiCS）并明確其響應(yīng)海水高溫脅迫的表達(dá)規(guī)律，可進(jìn)一步豐富海洋棘皮類動(dòng)物CS基因的序列信息和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為從能量代謝調(diào)節(jié)層面解析海洋生物應(yīng)對(duì)海水暖化的分子響應(yīng)規(guī)律提供參考資料，同時(shí)可為制定海水暖化背景下重要海洋經(jīng)濟(jì)棘皮類動(dòng)物的養(yǎng)殖及管理策略提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CS定位于真核細(xì)胞線粒體基質(zhì)中，具有專一的底物特異性，僅催化乙酰輔酶Ａ（Acetyl-CoA）與草酰乙酸（Oxaloacetic acid）縮合生成檸檬酸（Citric acid）和輔酶Ａ（CoA）（葛亞東等，2010）。CS廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，根據(jù)其細(xì)胞定位情況，可分為線粒體CS（mCS）、乙醛酸循環(huán)體CS（gCS）和過氧化物酶體CS（pCS） （Schnarrenberger and Martin，2002）。CS除了參與能量調(diào)節(jié)外，還與動(dòng)植物的抗逆性狀存在一定關(guān)聯(lián)（Pracharoenwattana et al.，2005）。在水稻（Oryza sativa）內(nèi)過表達(dá)CS可加速根系大量合成及分泌檸檬酸，培育出耐低磷脅迫的轉(zhuǎn)基因水稻植株（胡利華等，2006）；在菠蘿（Ananas comosus）果實(shí)的成熟過程中有機(jī)酸（主要是檸檬酸）含量與CS活性呈極顯著正相關(guān)（張秀梅等，2007）；在紫花苜蓿（Medicago sativa）中過表達(dá)CS可增強(qiáng)其對(duì)鋁毒的耐受力（Barone et al.，2008）。在水產(chǎn)動(dòng)物中，閆玉蓮和謝小軍（2011）研究證實(shí)CS活性可作為間接評(píng)價(jià)南方鲇（Silurus meridio-nalis）幼魚線粒體功能的重要指標(biāo)；Davis等（2016）研究表明南極洲翡翠巖鱈魚（Trematomus bernacchii）可通過增強(qiáng)體內(nèi)的CS活性來抵消海水酸化對(duì)有氧呼吸的影響；Jesus等（2018）研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)海水酸化條件為ΔpH=-0.4時(shí)卡氏雅羅魚（Squalius carolitertii）肌肉組織中的CS活性顯著降低；Li等（2019）研究表明，高鹽（25‰）脅迫可增強(qiáng)中華絨螯蟹（Fenneropenaeus chinensis）后鰓組織中的CS活性，低鹽（15‰和10‰）脅迫則導(dǎo)致中華絨螯蟹肌肉組織中的CS活性下降16.60%～59.11%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】中間球海膽又稱蝦夷馬糞海膽，具有棘刺短、性腺品質(zhì)佳及生長快速等特點(diǎn)（常亞青等，2004；尹文露等，2020）。中間球海膽原產(chǎn)于日本北海道及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，1989年由大連海洋大學(xué)從日本引進(jìn)，現(xiàn)已發(fā)展成為我國最重要的海膽?zhàn)B殖品種（常亞青等，1999）。中間球海膽的最適生長水溫在20 ℃左右，當(dāng)水溫超過23 ℃會(huì)嚴(yán)重影響其存活、攝食及生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致大規(guī)模死亡（鄭定發(fā)等，2019）。近年來受全球海水暖化的影響，我國北黃海中間球海膽?zhàn)B殖區(qū)夏季水溫經(jīng)常處于25～28 ℃（曾廣恩等，2006），導(dǎo)致養(yǎng)殖中間球海膽大規(guī)模死亡事件頻繁發(fā)生，而帶來重大經(jīng)濟(jì)損失，因此亟待系統(tǒng)解析中間球海膽應(yīng)對(duì)海水暖化的分子響應(yīng)規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確SiCS基因序列特征、組織表達(dá)情況及其對(duì)急性高溫脅迫的響應(yīng)規(guī)律，為后續(xù)研究SiCS基因功能及揭示其參與中間球海膽高溫應(yīng)答的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試中間球海膽購自大連市旅順龍王塘養(yǎng)殖場(chǎng)，平均殼徑40.00±5.01 mm，平均殼高26.00±2.03 mm，平均體質(zhì)量38.20±5.04 g。試驗(yàn)前置于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周。RNA提取試劑盒、PrimeScriptTM RT reagent Kit、SMARTer? RACE 5'/3' Kit及ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；GENMED純化線粒體腫脹光度法檢測(cè)試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；組織線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CS測(cè)定試劑盒（A108-1）購自南京建成生物工程研究所有限公司；Epoch酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 2. 1 急性高溫脅迫 隨機(jī)選取75只健康且活力好的中間球海膽，平均分成3組（每組25只），設(shè)1個(gè)對(duì)照組（20 ℃）和2個(gè)急性高溫脅迫組（23和26 ℃）。對(duì)照組海膽?zhàn)B殖在20 ℃恒溫循環(huán)水槽中，試驗(yàn)組海膽從暫養(yǎng)區(qū)直接轉(zhuǎn)移至23和26 ℃的恒溫循環(huán)水槽中進(jìn)行急性高溫脅迫，在整個(gè)急性高溫脅迫過程中海膽活力減弱，但未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

1. 2. 2 樣品收集 選取健康、活力較好的中間球海膽，于冰上分別剖解收集管足、腸道、圍口膜、體腔液和性腺等5個(gè)組織，參照武博瓊等（2022）的方法進(jìn)行保存，用于cDNA克隆、組織表達(dá)分析及總SiCS活性測(cè)定。同時(shí)，分別在23和26 ℃急性高溫處理后第1.5、3.0﹑6.0﹑12.0﹑24.0﹑48.0﹑72.0及96.0 h時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從各處理組中隨機(jī)選取3只海膽，于冰上剖解收集管足和性腺組織，部分樣品先進(jìn)行液氮速凍，再置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于組織表達(dá)分析；另一部分樣品直接-80 ℃凍存，用于線粒體腫脹度及總酶活性測(cè)定。

1. 3 SiCS基因克隆

按總RNA提取試劑盒說明提取中間球海膽各組織總RNA，參照PrimeScriptTM RT reagent Kit說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，并參照SMARTer? RACE 5'/3' Kit說明合成5'/3'末端模板。從已構(gòu)建的中間球海膽轉(zhuǎn)錄組文庫中搜索CS基因Unigene序列，經(jīng)BLASTx比對(duì)分析后使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)SiCS基因特異性擴(kuò)增引物（表1）。以cDNA為模板進(jìn)行核心片段克隆，以5'/3'末端cDNA為模板進(jìn)行5'/3'-RACE擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照李瑩瑩等（2020）的方法，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳、切膠回收、連接轉(zhuǎn)化及菌液PCR鑒定參照李蒙等（2019）的方法。

1. 4 SiCS基因生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN 6.0完成SiCS基因cDNA序列拼接和組裝，然后分別采用BLASTx（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、ORF Finder（htttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、EXPASY Proteomics Server（http：//www.expasy.org）、HMMER（http：//hmmer.org/download.html）、PSIRED v3.3（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/）、SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy. org/）及MEGA等在線軟件完成序列比對(duì)分析、開放閱讀框（ORF）確定、蛋白理化性質(zhì)分析、蛋白結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白三維空間結(jié)構(gòu)建模及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1. 5 中間球海膽組織線粒體腫脹度測(cè)定

采用GENMED純化線粒體腫脹光度法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)中間球海膽管足和性腺的線粒體腫脹度，具體操作：采用組織線粒體分離試劑盒分離待測(cè)的線粒體樣品；移取20.0 μL線粒體樣品至96孔細(xì)胞板中，加入170.0 μL GENMED緩沖液（Reagent A），混勻后立即放入酶標(biāo)儀（波長520 nm）中讀取0 min初始吸光值（OD520-0）；室溫靜置1 min后加入10.0 μL GENMED膨脹液（Reagent B），混勻后即刻放入酶標(biāo)儀（波長520 nm）中動(dòng)態(tài)記錄10 min吸光值（OD520-10）。

線粒體腫脹度= OD520-0-OD520-10

1. 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SiCS基因組織表達(dá)規(guī)律

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit說明合成cDNA模板，以β-actin為內(nèi)參基因，對(duì)擴(kuò)增引物的特異性和擴(kuò)增效率進(jìn)行檢測(cè)。利用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系參照柳林等（2019）的方法，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行熔解曲線分析，排除非特異性擴(kuò)增污染。采用2-ΔΔCt法換算SiCS基因相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 7 中間球海膽組織總SiCS活性測(cè)定

取0.5～1.0 g組織樣品置于液氮中研磨，按1∶9（g∶mL）的比例加入提取液，冰浴勻漿，制成10%待測(cè)懸液。10000 r/min離心10 min，取上清液，參照CS測(cè)定試劑盒（A108-1）說明，利用Epoch酶標(biāo)儀測(cè)定中間球海膽組織總SiCS活性。反應(yīng)底物在412 nm波長下，測(cè)定初始吸光值（A0），轉(zhuǎn)入37 ℃孵育箱溫浴15 min后再放入酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值（A15），并計(jì)算各孔ΔA= A15-A0。

總SiCS活性（U/mg）=[△AU-△AO13.6×10-3×d×T]×N1÷C×N

式中，ΔAU代表測(cè)定孔吸光值變化量；ΔAO代表空白孔吸光值變化量；13.6×10-3為摩爾消光系數(shù)；T代表反應(yīng)時(shí)間（15 min）；d代表比色光徑（cm）；N1代表體系稀釋倍數(shù)；C代表樣本蛋白濃度（mg/mL）；N代表樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANVOA），并以O(shè)rigin 8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SiCS基因克隆及序列分析結(jié)果

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接比對(duì)分析，得到SiCS基因cDNA序列全長2971 bp，其中，ORF為1395 bp（編碼464個(gè)氨基酸殘基），5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）為96 bp，3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）為1480 bp，起始密碼子（ATG）位于序列的第97 bp處，終止密碼子（TAA）位于序列的第1489 bp，且包含30 bp的poly（A）尾巴（圖1）。

2. 2 SiCS蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

采用ProtParam分析SiCS蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，SiCS蛋白分子量為51.48 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.09；帶負(fù)電氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）52個(gè)，帶正電氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）46個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)為30.84，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪族氨基酸系數(shù)為89.55，說明SiCS蛋白脂肪族氨基酸含量較高；總平均親水性（GRAVY）為-0.178，即為溫和疏水性蛋白（圖2）。SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在SiCS蛋白氨基酸序列中未檢測(cè)到信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白（圖3）；TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SiCS蛋白為非跨膜蛋白（圖4）。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SiCS蛋白中α-螺旋占43.86%、β-折疊占7.02%、無規(guī)則卷曲占49.12%（圖5-A）；SiCS蛋白C-端結(jié)構(gòu)域位于第73～451氨基酸處，且在302H、348H和403D位檢測(cè)到活性中心（圖5-B）。以已知的野豬CS蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號(hào)5uqs.1A）為模板進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模，結(jié)果（圖6）顯示預(yù)測(cè)得到的SiCS蛋白三維結(jié)構(gòu)模型與模板間的一致性為73.97%。

2. 3 CS氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

CS氨基酸多序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，14種生物（表2）的CS氨基酸序列相似性為82.91%（圖7）；除刺參外，SiCS氨基酸序列與其他12種生物的CS氨基酸序列相似性均大于70.00%，其中，與紫球海膽（S. purpuratus）的CS氨基酸序列相似性最高，為92.90%，與長棘海星的CS氨基酸序列相似性為79.18%。由基于CS氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖8）可知，中間球海膽與紫球海膽、刺參和長棘海星聚為一支，其中與紫球海膽的親緣關(guān)系最近。

2. 4 急性高溫脅迫對(duì)中間球海膽管足和性腺線粒體腫脹度的影響

如圖9-A所示，與對(duì)照組（20 ℃）相比，23 ℃急性高溫脅迫后第1.5和3.0 h中間球海膽管足線粒體腫脹度呈極顯著上升趨勢(shì)（P<0.01，下同），然后緩慢恢復(fù)至正常水平；經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽管足線粒體腫脹度呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，至脅迫后第6.0 h達(dá)最高值，而后開始降低；與23 ℃急性高溫脅迫相比，26 ℃急性高溫脅迫整體上呈下降趨勢(shì)。由圖9-B可知，與對(duì)照組（20 ℃）相比，23 ℃急性高溫脅迫后第1.5和3.0 h中間球海膽性腺線粒體腫脹度極顯著上升，從脅迫后第6.0 h開始呈下降趨勢(shì)；經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽性腺線粒體腫脹度呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，脅迫后第48.0 h降至最低值；與23 ℃急性高溫脅迫相比，26 ℃急性高溫脅迫后整體上呈下降趨勢(shì)。

2. 5 SiCS基因和總SiCS活性的組織表達(dá)規(guī)律及其對(duì)急性高溫脅迫的響應(yīng)

2. 5. 1 SiCS基因和總SiCS活性的組織表達(dá)規(guī)律 如圖10-A所示，SiCS基因在中間球海膽的管足、性腺、腸道、體腔細(xì)胞及圍口膜等組織中均有表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)轶w腔細(xì)胞>圍口膜>性腺>管足>腸道，具有一定的組織特異性。SiCS基因相對(duì)表達(dá)量以中間球海膽體腔細(xì)胞的最高，顯著高于其他4種組織（P<0.05，下同），管足和腸道中的相對(duì)表達(dá)量較低，顯著低于其他3種組織。如圖10-B所示，中間球海膽各組織的總SiCS活性排序?yàn)楣茏?腸道>圍口膜>性腺>體腔細(xì)胞，其中，管足和腸道的總SiCS活性顯著高于其他3種組織，圍口膜和性腺的總SiCS活性又顯著高于體腔細(xì)胞，而體腔細(xì)胞的總SiCS活性最低。

2. 5. 2 急性高溫脅迫對(duì)SiCS基因表達(dá)及總SiCS活性的影響 如圖11-A所示，與對(duì)照組（20 ℃）相比，經(jīng)23和26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽管足的SiCS基因相對(duì)表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)呈先上升后下降的波動(dòng)變化規(guī)律。其中，在23 ℃急性高溫脅迫中，中間球海膽管足SiCS基因相對(duì)表達(dá)量在脅迫后第6.0 h達(dá)第1次峰值，第96.0 h達(dá)第2次峰值，而在脅迫后第1.5和48.0 h分別出現(xiàn)2次谷值；在26 ℃急性高溫脅迫中，中間球海膽管足SiCS基因相對(duì)表達(dá)量在脅迫后第3.0 h達(dá)第1次峰值，第72.0 h達(dá)第2次峰值，在脅迫后第24.0 h達(dá)最低值。與23 ℃急性高溫脅迫相比，經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽管足SiCS基因相對(duì)表達(dá)量也呈先上升后下降的波動(dòng)變化規(guī)律。在中間球海膽性腺SiCS基因相對(duì)表達(dá)量方面，與對(duì)照組（20 ℃）相比，經(jīng)23和26 ℃急性高溫脅迫后SiCS基因相對(duì)表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)，且在脅迫后第3.0 h達(dá)第1次峰值，第72.0 h達(dá)第2次峰值；與23 ℃急性高溫脅迫相比，經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽性腺SiCS基因相對(duì)表達(dá)量呈先下降后上升的波動(dòng)變化規(guī)律（圖11-B）。

如圖11-C所示，與對(duì)照組（20 ℃）相比，經(jīng)23 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽管足總SiCS活性呈先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)，在脅迫后第6.0 h達(dá)峰值；經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽管足總SiCS活性極顯著下降；與23 ℃急性高溫脅迫相比，26 ℃急性高溫脅迫后總SiCS活性整體上呈下降趨勢(shì)。在中間球海膽性腺總SiCS活性方面，與對(duì)照組（20 ℃）相比，經(jīng)23 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽性腺總SiCS活性在各時(shí)間點(diǎn)均呈極顯著下降趨勢(shì)，且在脅迫后第3.0和72.0 h出現(xiàn)2次谷值；經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽性腺總SiCS活性在脅迫后第3.0 h達(dá)第1次峰值，第48.0 h達(dá)第2次峰值，而在脅迫后第6.0和72.0 h分別出現(xiàn)2次谷值；與23 ℃急性高溫脅迫相比，經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽性腺總SiCS活性整體上呈先上升后下降的變化趨勢(shì)（圖11-D）。

3 討論

3. 1 SiCS基因序列特征

本研究利用RACE首次克隆獲得SiCS基因cDNA序列全長（NCBI登錄號(hào)ON496991），編碼一個(gè)具有464個(gè)氨基酸殘基的蛋白。CS氨基酸多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，SiCS氨基酸序列與紫球海膽的CS氨基酸序列相似性最高，達(dá)92.90%，僅存在1個(gè)氨基酸殘基差異，提示CS同源蛋白在進(jìn)化上具有一定的種屬特異性。在蛋白空間結(jié)構(gòu)方面，SiCS蛋白與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的野豬CS蛋白在三維結(jié)構(gòu)上差異較小，表明SiCS蛋白空間結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。由基于CS氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可知，中間球海膽與同屬于棘皮動(dòng)物的紫球海膽、刺參和長棘海星聚為一支，處于無脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物的過渡位置，與海膽類傳統(tǒng)的進(jìn)化和分類地位相符。此外，SiCS氨基酸序列與長棘海星CS氨基酸序列的相似性高于其與刺參CS氨基酸序列的相似性，故推測(cè)SiCS蛋白與長棘海星CS蛋白的親緣關(guān)系較近，而與刺參CS蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與崔東遙等（2019）研究報(bào)道的中間球海膽LDH基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相似。

3. 2 急性高溫脅迫對(duì)中間球海膽管足和性腺線粒體腫脹變化的影響

線粒體形態(tài)具有高度的可塑性，極易受生理和病理?xiàng)l件的影響（Vincent et al.，2016）。線粒體腫脹是指線粒體內(nèi)膜Na+、K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性過低（Venkatraman et al.，2008），而導(dǎo)致線粒體膜電位（MMP）缺失及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，引起線粒體蛋白滲透壓升高和基質(zhì)水腫的狀態(tài)（Rodriguez-Enriquezs et al.，2004）。線粒體腫脹后會(huì)導(dǎo)致外膜破裂，線粒體功能失調(diào)（曹穎等，2010），因此線粒體腫脹常用于評(píng)價(jià)線粒體對(duì)抗外界應(yīng)激的能力（徐莉等，2012）。本研究結(jié)果表明，在23和26 ℃急性高溫脅迫下，中間球海膽管足和性腺中的線粒體腫脹度與對(duì)照組（20 ℃）相比均呈先升高再下降的變化趨勢(shì)。經(jīng)23 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽管足和性腺線粒體腫脹度均在脅迫后第1.5和3.0 h極顯著高于對(duì)照組，隨后逐漸下降至與對(duì)照組無顯著差異，表明23 ℃急性高溫脅迫引起的線粒體腫脹現(xiàn)象經(jīng)3.0 h適應(yīng)后有所緩解，即23 ℃可能仍在中間球海膽的可適應(yīng)溫度范圍內(nèi)。經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后，在脅迫前6.0 h的管足和脅迫前3.0 h的性腺中，線粒體腫脹度均與對(duì)照組無顯著差異，但在之后的脅迫過程中線粒體腫脹度均極顯著低于對(duì)照組，故推測(cè)26 ℃已超過中間球海膽的自我調(diào)節(jié)范圍，導(dǎo)致線粒體膜發(fā)生破損，且持續(xù)高溫脅迫導(dǎo)致的損傷難以恢復(fù)，也是中間球海膽在高溫脅迫時(shí)運(yùn)動(dòng)能力降低，最后逐漸死亡的主要原因之一。因此，后續(xù)研究應(yīng)準(zhǔn)確掌握中間球海膽線粒體自我調(diào)節(jié)的極限溫度。

3. 3 SiCS基因及總SiCS活性的組織表達(dá)規(guī)律

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SiCS基因在中間球海膽管足、圍口膜、體腔細(xì)胞、腸道和性腺等組織中均有表達(dá)，且具有鮮明的組織特異性，與趙蘭英（2013）研究報(bào)道的黃河裸裂尻魚（Schizopygopsis pylzovi）CS基因組織分布規(guī)律相似。在同一組織中，SiCS基因相對(duì)表達(dá)量與總SiCS活性呈相反的變化趨勢(shì)。如SiCS基因在體腔細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量最高，但總SiCS活性最低，可能是體腔細(xì)胞中SiCS主要以尚未激活的酶原形式存在?？係iCS活性在中間球海膽的管足和腸道中較高，表明CS除了參與調(diào)控機(jī)體能量代謝外，還與動(dòng)植物的抗逆性狀存在一定關(guān)聯(lián)。中間球海膽的管足直接暴露于外部環(huán)境，腸道可通過口器直接與外部環(huán)境接觸，較低的SiCS基因表達(dá)水平有助于中間球海膽在環(huán)境因子快速變化時(shí)通過上調(diào)表達(dá)SiCS基因及時(shí)進(jìn)行響應(yīng)，維持代謝水平和能量供應(yīng)以抵抗不利影響，與焦仁和等（2022）、武博瓊等（2022）的研究結(jié)果相似。

3. 4 急性高溫對(duì)中間球海膽管足和性腺SiCS基因表達(dá)及總SiCS活性的影響

管足是海膽的運(yùn)動(dòng)和觸覺器官，對(duì)外界環(huán)境變化敏感，可率先發(fā)生響應(yīng)；性腺是海膽重要的繁殖及能量儲(chǔ)存器官，也是經(jīng)濟(jì)海膽的主要可食用部分。為揭示中間球海膽管足和性腺響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制，本研究對(duì)中間球海膽管足和性腺中的SiCS基因相對(duì)表達(dá)量及總SiCS活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，經(jīng)23和26 ℃急性高溫脅迫后，管足和性腺的SiCS基因相對(duì)表達(dá)量及總SiCS活性均呈波動(dòng)變化規(guī)律，但在不同高溫脅迫下和不同組織中有所差異。CS是三羧酸循環(huán)中的第一關(guān)鍵酶，而三羧酸循環(huán)是動(dòng)物體內(nèi)糖類、脂類和氨基酸三大營養(yǎng)素的最終代謝通路，也是糖類、脂類及氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐（樊佳佳等，2014）。此外，CS活性的降低可引起機(jī)體能量代謝紊亂（Balaban et al.，2005；Dirks et al.，2006）。本研究結(jié)果表明，面對(duì)高溫脅迫時(shí)中間球海膽可能通過增加三羧酸循環(huán)代謝酶活性及提高能量供應(yīng)，以抵抗高溫脅迫造成的負(fù)面影響；隨著CS的不斷積累，又負(fù)反饋調(diào)節(jié)SiCS基因表達(dá)，二者間波動(dòng)調(diào)節(jié)以響應(yīng)高溫脅迫。在酶活性方面，經(jīng)26 ℃急性高溫脅迫后管足和性腺的SiCS活性普遍高于23 ℃急性高溫脅迫，說明隨著脅迫溫度的升高，中間球海膽組織需要更多SiCS活性來調(diào)節(jié)其生理活動(dòng)，以緩減高溫脅迫造成的負(fù)面影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)23和26 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽性腺總SiCS活性普遍高于管足，說明性腺對(duì)高溫脅迫更加敏感。Delorme和Sewell（2016）研究發(fā)現(xiàn)，逐漸升高的海水溫度對(duì)海洋生物性腺生長發(fā)育可能會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，故推測(cè)在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)中間球海膽的性腺比管足需要更多能量以保證其正常的生理功能，即中間球海膽性腺對(duì)急性高溫脅迫可能較管足更敏感。

綜上所述，中間球海膽可能通過調(diào)整組織中的SiCS基因相對(duì)表達(dá)及SiCS活性來響應(yīng)急性高溫脅迫，且這種響應(yīng)策略存在一定的組織和溫度特異性。因此，在后續(xù)的研究中應(yīng)從蛋白水平進(jìn)一步探究中間球海膽不同組織中SiCS基因響應(yīng)高溫脅迫的表達(dá)規(guī)律，并在此基礎(chǔ)上分析SiCS基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及其酶活性水平與高溫脅迫或高溫耐受的相關(guān)性，系統(tǒng)解析SiCS基因在中間球海膽響應(yīng)高溫脅迫中的分子機(jī)制，為制定海水暖化背景下重要海洋經(jīng)濟(jì)棘皮類動(dòng)物的養(yǎng)殖及管理策略提供新思路。

4 結(jié)論

中間球海膽可能通過調(diào)整組織中的SiCS基因相對(duì)表達(dá)及SiCS活性來響應(yīng)急性高溫脅迫，且這種響應(yīng)策略存在一定的組織和溫度特異性，具體表現(xiàn)為性腺對(duì)急性高溫脅迫較管足更敏感。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）