髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料、VEGF 對(duì)股骨頭壞死家兔骨密度及生物力學(xué)的影響

呂亞軍,李宜炯,趙振拴,張宇宸,王 偉（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨二科，河北 石家莊 050031）

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是一種發(fā)病率和致殘率較高的常見(jiàn)骨科疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚缺乏可靠的治療方法[2-3]。髓芯減壓治療ONFH 療效較為確切，可有效降低骨內(nèi)壓力并延緩疾病進(jìn)展[4]，但易受到骨壞死位置和范圍限制[4]。植骨是髓芯減壓治療后的重要步驟，主要用于填充髓芯減壓治療后形成的空腔。膠原基骨修復(fù)材料是植骨的理想材料，其成分類(lèi)似于天然骨，具有誘導(dǎo)成骨、可降解、易塑形、無(wú)免疫原性等特性，比天然骨更利于骨修復(fù)[5-6]。血管再生是骨修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）可吸引內(nèi)皮細(xì)胞和破骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，在骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8-10]。骨密度及生物力學(xué)是評(píng)價(jià)骨形成和修復(fù)的主要指標(biāo)。本研究首次開(kāi)發(fā)了髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料、VEGF治療ONFH的新型復(fù)合療法，并建立家兔ONFH模型，觀察該復(fù)合療法對(duì)家兔ONFH 模型骨密度及生物力學(xué)的影響，以期為ONFH的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

30 只SPF 級(jí)家兔購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXN（冀）2013-1-003]，6月齡，體質(zhì)量（2.21±0.29）kg。飼養(yǎng)條件：25 ℃、60%相對(duì)濕度、12 h 晝夜交替。飼養(yǎng)期間不限制進(jìn)食及飲水。本研究已獲得河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(ZD20140210)。

1.2 動(dòng)物模型的建立

參考文獻(xiàn)[11]構(gòu)建家兔ONFH 模型。麻醉家兔并俯臥位固定，剪開(kāi)大轉(zhuǎn)子外側(cè)筋膜和皮膚，鈍性分離轉(zhuǎn)子間的肌肉，X 射線(xiàn)引導(dǎo)下于大轉(zhuǎn)子外側(cè)穿刺至股骨頭中心，克氏針擴(kuò)髓，將1 mL 的無(wú)水乙醇注射至左側(cè)股骨頭中心，速度為0.1 mL/min（圖1a）。造模6 周后CT 掃描觀察到股骨頭壞死、骨密度增高、股骨頭外形改變等特征為建模成功（圖1b）。

圖1 動(dòng)物模型的建立

1.3 動(dòng)物分組和治療

將30 只家兔隨機(jī)分為健康對(duì)照組（A 組）、模型組（B 組）、髓芯減壓聯(lián)合自體松質(zhì)骨組（C 組）、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料組（D組）及髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料和VEGF 組（E 組），每組6 只。A 組為未建模的家兔，B 組家兔建模后正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行治療；C 組在髓芯減壓基礎(chǔ)上植入自體松質(zhì)骨；D 組在髓芯減壓基礎(chǔ)上植入膠原基骨修復(fù)材料（天津市賽寧生物工程技術(shù)有限公司）；E 組在髓芯減壓基礎(chǔ)上植入吸附有VEGF（約500 ng）的膠原基骨修復(fù)材料。各組在干預(yù)8周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 骨密度的測(cè)量

40 mg/kg 的硫噴妥鈉腹腔注射麻醉家兔后固定，應(yīng)用骨密度分析系統(tǒng)（QCT PRO V6.1）測(cè)定并分析骨密度。

1.5 組織病理學(xué)染色

C 組、D 組和E 組ONFH 模型家兔干預(yù)8 周后，用40 mg/kg 的硫噴妥鈉腹腔注射麻醉家兔，用空氣栓塞法處死，取出股骨頭，EDTA 脫鈣后制作5 mm 厚石蠟切片，進(jìn)行HE染色。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)50 個(gè)骨陷窩。空骨陷窩比率=空骨陷窩數(shù)/總骨陷窩數(shù)×100%。

1.6 生物力學(xué)測(cè)量

分離股骨頭，用ETM103A微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)測(cè)量最大應(yīng)力（N/mm2）、彈性模量（kPa）、剛度（N/mm）、最大載荷（N）和能量吸收（N.mm）。

1.7 qRT-PCR

將股骨頭標(biāo)本放入液氮中，取出后移至液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末，然后用TRIzol 試劑（美國(guó)Thermo Fisher）提取總RNA。使用SuperScrip IV 逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Thermo Fisher）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用PowerUp SYBR Green Master Mix（美國(guó)Thermo Fisher）在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行PCR。骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子164（vascular endothelial growth factor 164，VEGF164）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和GAPDH 引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1，用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組家兔的一般情況觀察

本研究過(guò)程中無(wú)家兔死亡。A 組家兔精神狀態(tài)正常，皮毛光澤，正常運(yùn)動(dòng)。B 組家兔精神萎靡，皮毛無(wú)光澤，行動(dòng)遲緩，彈跳能力降低。C組、D組和E組家兔精神狀態(tài)較B 組改善，皮毛恢復(fù)光澤，運(yùn)動(dòng)能力增加，其中E組家兔的一般情況優(yōu)于其他組。

2.2 各組家兔的股骨頭骨密度

各組家兔的股骨頭骨密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與A 組相比，B 組的骨密度顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，C組、D組和E組的骨密度均顯著升高（P＜0.05）；E 組的骨密度顯著高于C 組和D 組（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組家兔的骨密度

2.3 各組家兔的股骨頭組織病理學(xué)變化

治療8周后，A 組家兔股骨頭組織形態(tài)正常。B組股骨頭組織骨小梁錯(cuò)亂且數(shù)量較少，血管數(shù)量也較少。與B 組相比，C 組、D 組和E 組骨小梁錯(cuò)亂明顯改善，骨小梁增多，骨髓中血管形成明顯增多。E 組股骨頭組織修復(fù)情況明顯優(yōu)于其他組。各組空骨陷窩比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.340，P＜0.001）。與A 組相比，B 組的空骨陷窩比率顯著增多（P＜0.05）；與B 組相比，C 組、D 組和E 組的空骨陷窩比率均降低（P＜0.05）；E 組的空骨陷窩比率低于C 組和D 組（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組家兔股骨頭組織的HE染色

2.4 各組家兔的股骨頭生物力學(xué)參數(shù)變化

各組家兔的股骨頭生物力學(xué)參數(shù)（最大應(yīng)力、彈性模量、剛度、最大載荷和能量吸收）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與A組相比，B組的股骨頭生物力學(xué)參數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，C組、D組和E組的股骨頭生物力學(xué)參數(shù)均升高（P＜0.05）；E組的股骨頭生物力學(xué)參數(shù)均高于C組和D組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組家兔的股骨頭生物力學(xué)參數(shù)

2.5 各組家兔的股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL和RANK的表達(dá)

各組家兔股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL 和RANK 的mRNA 水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與A相比，B組股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL 和RANK 的mRNA表達(dá)均增加（P＜0.05）；與B組相比，C組、D組和E組股骨頭組織中OPG、VEGF164 和VEGFR2 的mRNA 表達(dá)均升高，RANKL和RANK的mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05）。與C 組和D 組相比，E 組股骨頭組織中OPG、VEGF164和VEGFR2 的mRNA 表達(dá)均升高，RANKL 和RANK 的mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組家兔股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL和RANK mRNA表達(dá)

3 討論

本研究首次將髓芯減壓、膠原基骨修復(fù)材料和VEGF 這三種材料結(jié)合起來(lái)治療ONFH，結(jié)果顯示，髓芯減壓聯(lián)合自體松質(zhì)骨、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料和VEGF 這三種治療方法均有效提高了股骨頭骨密度，HE 染色結(jié)果表明上述治療方法均可促進(jìn)骨小梁形成、血管生成和ONFH 區(qū)域的修復(fù)，并使空骨陷窩比率降低。通過(guò)檢測(cè)股骨頭生物力學(xué)參數(shù)變化可知，這三種治療方法均提高了股骨頭的力學(xué)強(qiáng)度，從而避免了股骨頭塌陷骨折的發(fā)生。分析其原因，髓芯減壓可降低骨內(nèi)壓、改善血供；膠原基骨修復(fù)材料孔隙率較高，孔徑尺度多樣，為血液流動(dòng)提供了良好的基礎(chǔ)；VEGF 能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，促進(jìn)形成新骨，這三種材料均可促進(jìn)ONFH區(qū)域的修復(fù)。

本研究還檢測(cè)了各組家兔的股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL 和RANK mRNA 的表達(dá)。OPG、RANKL 和RANK 是重要的骨形成調(diào)控因子。OPG作為RANKL的誘騙受體，與RANK結(jié)合并抑制破骨細(xì)胞生成[12-13]。RANKL 與OPG 有拮抗作用，其通過(guò)與RANK 結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成和分化，RANKL/OPG比率決定了骨生成或骨吸收[14]。血管生成障礙可抑制骨形成，引起骨骼壞死[15]。VEGF/VEGFR 信號(hào)通路是最重要的血管生成調(diào)節(jié)通路，在調(diào)節(jié)骨形成和骨修復(fù)中發(fā)揮重要作用，并刺激骨損傷部位血管再生[16-17]。脊椎動(dòng)物VEGF 家族中主要以VEGFA 為主，VEGFR2 是VEGFR 家族中的最主要受體[18-19]。本研究表明，髓芯減壓聯(lián)合自體松質(zhì)骨、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料和VEGF 這三種治療方法均升高了股骨頭組織中OPG、VEGF164 和VEGFR2 的轉(zhuǎn)錄水平，降低了RANKL 和RANK 的轉(zhuǎn)錄水平，并且三種材料復(fù)合的效果最佳。說(shuō)明三種材料復(fù)合療法可有效調(diào)控骨形成基因和血管生成基因的表達(dá)。

本研究結(jié)果證實(shí)髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨材料和VEGF 的治療效果優(yōu)于髓芯減壓聯(lián)合自體松質(zhì)骨和髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料。分析其原因可能包括以下方面：①髓芯減壓可降低骨內(nèi)壓，改善血供，促進(jìn)壞死股骨頭的修復(fù)[4]。②膠原基骨修復(fù)材料中的膠原為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了適宜的環(huán)境，并且該材料的孔隙率較高，孔徑尺度豐富，有效保證了血液流動(dòng)。③VEGF 能特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，促進(jìn)新骨形成[20-22]。該復(fù)合療法充分發(fā)揮了各材料的優(yōu)勢(shì)，從而最大限度地促進(jìn)了ONFH區(qū)域的修復(fù)。

綜上所述，髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復(fù)材料和VEGF 復(fù)合療法可有效提高ONFH 家兔股骨頭的骨密度和強(qiáng)度，促進(jìn)損傷區(qū)域的骨形成和血管生成，從而促進(jìn)股骨頭的修復(fù)，該療法可能是治療ONFH 的新型高效療法，具有較高的研究?jī)r(jià)值。