CDCA3 在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義

李 苗,金海紅,付靜靜,韓 坤,龔 姍（秦皇島市第一醫(yī)院婦科，河北 秦皇島 066000）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，致死率高。臨床上約有70%的卵巢癌患者就診時(shí)已處晚期，5 年生存率僅為30%[1-2]。目前卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，增殖、侵襲和遷移是影響病情進(jìn)展的重要因素[3]。細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白3（cell division cycle associated protein 3，CDCA3）與細(xì)胞分裂密切相關(guān)，會(huì)影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及免疫浸潤(rùn)和腫瘤微環(huán)境[4]。CDCA3 與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系日益受到重視，研究發(fā)現(xiàn)，CDCA3 可能參與肝細(xì)胞癌[4]、膀胱癌[5]、胃癌[6]和腎癌[7]等腫瘤的發(fā)生。本研究通過檢測(cè)上皮性卵巢癌組織中CDCA3 的表達(dá)，在細(xì)胞水平上探討CDCA3 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，以期尋找新的上皮性卵巢癌診治靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選取2019 年6 月至2021 年12 月于本院進(jìn)行手術(shù)切除的50 例患者的卵巢癌組織，患者年齡42～62 歲，平均（48.09±9.23）歲；漿液性癌31 例，透明細(xì)胞癌10 例，黏液性癌7 例，其他2 例；FIGO 分期為Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期28例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織病理學(xué)檢查證實(shí)為上皮性卵巢癌；②術(shù)前未接受過放化療；③未合并其他類型腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并感染性疾?。虎诖x性疾??；③自身免疫性疾??；④嚴(yán)重的心、肝、腎功能障礙。另選取同期因子宮肌瘤或子宮腺肌病進(jìn)行手術(shù)切除的30例患者的正常卵巢組織作為對(duì)照，患者年齡38～52 歲，平均（47.03±8.45）歲。本研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（S2019-02-11）。

1.2 細(xì)胞及試劑

上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、Hey、CAOV3、SKOV3 購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于北京伊諾凱科技有限公司；總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒、BCA 試劑盒、凝膠快速制備試劑盒購(gòu)于上海尚寶生物科技有限公司；CDCA3、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、GAPDH 抗體均購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；CDCA3 siRNA和pLenti6/V5-CDCA3質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并提供；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于北京伊諾凱科技有限公司；CCK-8 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒及Transwell 小室購(gòu)于上海語(yǔ)純生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將A2780、Hey、CAOV3、SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.4 RT-PCR檢測(cè)組織和細(xì)胞中CDCA3 mRNA表達(dá)

采用RT-PCR檢測(cè)組織和細(xì)胞中CDCA3 mRNA表達(dá)水平[8]。首先用總RNA 提取試劑盒提取組織和細(xì)胞中總RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用PCR試劑盒擴(kuò)增引物，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性15 s，95 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法計(jì)算CDCA3相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 Western blot 檢測(cè)組織和細(xì)胞中CDCA3 蛋白表達(dá)水平

采用Western blot 檢測(cè)組織中CDCA3 蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞中CDCA3、Cyclin D1、MMP-9、E-cadherin 表達(dá)水平[9]。用RAPI 裂解液提取組織和細(xì)胞中的總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。隨后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入CDCA3 抗體（稀釋500 倍）、Cyclin D1 抗體（稀釋500 倍）、MMP-9 抗體（稀釋1 000 倍）、E-cadherin 抗體（稀釋1 000 倍）、GAPDH抗體（稀釋1 000 倍），4 ℃孵育過夜，次日除去一抗，用TBST 緩沖液洗滌3 次后加入二抗。用ECL 發(fā)光儀成像，Image J軟件分析灰度值。

1.6 siRNA轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAOV3 細(xì)胞接種于24 孔板，分為沉默組和Control組。沉默組加入50 nmol/L的CDCA3 siRNA，Control 組加入50 nmol/L 的陰性對(duì)照序列。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 慢病毒轉(zhuǎn)染Hey細(xì)胞

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hey 細(xì)胞接種于24 孔板，分為過表達(dá)組和對(duì)照組。過表達(dá)組用CAOV3 慢病毒（1 mL 含CDCA3 基因的pLenti6/V5-CDCA3 質(zhì)粒）感染Hey 細(xì)胞，對(duì)照組用空載體慢病毒感染。感染48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力檢測(cè)

用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后向每個(gè)培養(yǎng)孔中添加10 μL CCK-8 試劑，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值[10]。用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移[11]。遷移實(shí)驗(yàn)：在Transwell 遷移板上室加入5×104個(gè)細(xì)胞，下室中加入600 μL 完全培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h。固定膜底細(xì)胞并進(jìn)行0.1%結(jié)晶紫染色20 min，光學(xué)顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量。侵襲實(shí)驗(yàn)：使用預(yù)先加入Matrigel 膠的小室，上室中加入5×104個(gè)細(xì)胞，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDCA3在上皮性卵巢癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

與正常卵巢組織比較，上皮性卵巢癌組織中CDCA3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均較高（P＜0.05）。在A2780、Hey、CAOV3、SKOV3 上皮性卵巢癌細(xì)胞系中，CAOV3 細(xì)胞中CDCA3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平最高，而Hey 細(xì)胞最低，見圖1。因此，我們選擇CAOV3和Hey細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)機(jī)制驗(yàn)證。

圖1 CDCA3在上皮性卵巢癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 沉默或過表達(dá)CDCA3對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖活力的影響

沉默CDCA3 后CAOV3 細(xì)胞CDCA3 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活力降低（P＜0.05)，過表達(dá)CDCA3 后Hey 細(xì)胞CDCA3 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活力升高(P＜0.05），見圖2。

圖2 沉默或過表達(dá)CDCA3對(duì)卵巢癌細(xì)胞CDCA3蛋白表達(dá)及增殖活力的影響

2.3 沉默或過表達(dá)CDCA3對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

沉默CDCA3 后CAOV3 細(xì)胞侵襲和遷移能力降低（P＜0.05），過表達(dá)CDCA3后Hey細(xì)胞侵襲和遷移能力升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 沉默或過表達(dá)CDCA3對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

2.4 沉默或過表達(dá)CDCA3 對(duì)卵巢癌細(xì)胞Cyclin D1、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)水平的影響

沉默CDCA3 后，CAOV3 細(xì)胞Cyclin D1、MMP-9 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。過表達(dá)CDCA3后，Hey細(xì)胞Cyclin D1、MMP-9 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 沉默或過表達(dá)CDCA3對(duì)卵巢癌細(xì)胞Cyclin D1、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)水平影響

3 討論

CDCA 基因家族由8 個(gè)成員（CDCA1～CDCA8）組成，是細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[12]。CDCA3 是CDCA 家族的重要成員，是S期激酶相關(guān)蛋白1/淘汰素/F-boxE3 泛素連接酶復(fù)合物的一部分，可以介導(dǎo)有絲分裂抑制激酶weel 的降解，影響細(xì)胞周期[13]。另CDCA3 可以和Skp1、cullin 結(jié)合，通過多種信號(hào)通路參與病理生理過程[14]。CDCA3 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到重視，其可通過調(diào)控E2F 轉(zhuǎn)錄因子1（E2F1）、NF-κB/Cyclin D1 信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[14-15]。此外，CDCA3 還參與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、口腔癌等的增殖，其高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)[16]。

CDCA3 與上皮性卵巢癌的關(guān)系目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中CDCA3 表達(dá)水平高于正常卵巢組織，提示CDCA3可能參與上皮性卵巢癌的發(fā)生。為進(jìn)一步探討CDCA3 在上皮性卵巢癌中的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了上皮性卵巢癌細(xì)胞系中CDCA3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，沉默CDCA3 后CAOV3 細(xì)胞中CDCA3 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活力、侵襲能力、遷移能力降低，過表達(dá)CDCA3 后Hey 細(xì)胞CDCA3 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活力、侵襲和遷移能力升高。說明CDCA3 可能作為促癌基因在上皮性卵巢癌中發(fā)揮作用。Cyclin D1 主要在腫瘤中促進(jìn)細(xì)胞增殖，其還與腫瘤黏附和侵襲有關(guān)[17]。腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移與細(xì)胞外基質(zhì)的降解有關(guān)，腫瘤細(xì)胞分泌MMP可以破壞腫瘤周圍組織的細(xì)胞外基質(zhì)[18]。MMP-9在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)，并且能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移[19]。E-cadherin 表達(dá)水平下降可影響細(xì)胞基質(zhì)黏附受體的表達(dá)，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞間黏附性下降，最終引起腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。本研究沉默CDCA3后，CAOV3細(xì)胞中Cyclin D1、MMP-9 蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高；過表達(dá)CDCA3 后，Hey 細(xì)胞中Cyclin D1、MMP-9 蛋白表達(dá)水平升高，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低。以上結(jié)果提示，CDCA3 可能參與上皮性卵巢癌的進(jìn)展。

綜上，CDCA3 在上皮性卵巢癌中高表達(dá)，能夠促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。CDCA3 可能成為上皮性卵巢癌的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)臨床診治有潛在價(jià)值。未來需要進(jìn)一步開展臨床和基礎(chǔ)研究，探討CDCA3在上皮性卵巢癌中的作用及機(jī)制。