豇豆枯萎病生防細(xì)菌的篩選鑒定及抗病機(jī)理初探

謝海鵬　林櫻桃　吳小燕　林俊旭　林明智　麥賢俊　陳子躍　謝文　孔祥義

關(guān)鍵詞：尖孢鐮刀菌嗜導(dǎo)管?；?；貝萊斯芽孢桿菌；拮抗機(jī)制；促生能力

中圖分類號：S436.43 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

豇豆[Vigna unguiculata （L.） Walp.]是一年生豆科作物，主要分布在世界干旱、半干旱的熱帶地區(qū)。豇豆起源和馴化于非洲，現(xiàn)已在全世界100多個(gè)國家種植[1]。世界上主要的豇豆生產(chǎn)區(qū)是撒哈拉以南的非洲，其中，非洲的尼日利亞、尼日爾和布基納法索的豇豆產(chǎn)量排名世界前三，中國豇豆產(chǎn)量位列世界第16 位[2]。在我國，除高寒地區(qū)外各地均有栽培[3]。尤其在海南三亞地區(qū)，豇豆種植面積已達(dá)5340 hm²，出島產(chǎn)量達(dá)15 萬t，已經(jīng)成為海南冬季瓜菜南種北運(yùn)的主要蔬菜之一[4]。

豇豆枯萎病是由尖孢鐮刀菌嗜導(dǎo)管?；停‵usarium oxysporum f.sp. tracheiphilum）引起的維管束病害，它通過傷口或直接穿透根部，然后在木質(zhì)部定植。被侵染的豇豆植株表現(xiàn)為基部莖腫脹、葉片褪綠、變黃、落葉、枯萎、維管變色和死亡。幾乎在所有豇豆種植區(qū)均有豇豆枯萎病的發(fā)生。在澳大利亞西北部、巴西東北部、非洲的尼日利亞、美國東南部和加利福尼亞州的中央谷地均報(bào)道過豇豆枯萎病的發(fā)生[5]。我國主要在廣東、福建、廣西、海南、江西等地為害較多，目前已遍布所有豇豆產(chǎn)區(qū)， 產(chǎn)量損失可高達(dá)70%[6]。近年來，由于海南三亞市豇豆多年連作，土壤條件惡化，三亞市豇豆枯萎病大面積流行，發(fā)生嚴(yán)重地塊可減產(chǎn)70%～80%，嚴(yán)重影響豇豆生產(chǎn)[7]。

目前豇豆枯萎病的防治手段有選育抗病品種、輪作、土壤消毒、控制線蟲、化學(xué)防治和生物防治等[8]。國內(nèi)使用最多的防治手段是化學(xué)防治，但是由于豇豆長期使用化學(xué)農(nóng)藥，近年來國內(nèi)豇豆農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題頻繁發(fā)生[9-10]。利用微生物防治土傳病害是近年來的熱點(diǎn)。微生物不僅可以生活在土壤中與病原菌形成長期對抗，降低病害發(fā)生，而且能減少農(nóng)藥的使用量，預(yù)防農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生[11]。目前，用于防治植物病害的微生物主要有真菌、細(xì)菌和病毒等，而細(xì)菌因其數(shù)量和種類眾多，廣泛分布于植物根際和地面上部，具有對植物生長環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖速度快和易培養(yǎng)等特點(diǎn)成為最主要的生防資源之一[12]?，F(xiàn)已成功應(yīng)用于植物病害防治的生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬（ Baccillus ）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、沙雷氏菌屬（Serratia）、巴氏桿菌屬（Pasteuria）以及腸桿菌屬（Enterobacteri）等[13]。

近年來，越來越多的學(xué)者開展了篩選拮抗細(xì)菌防治植物枯萎病的研究并取得成果。李娜等[14]從黃瓜枯萎病根際土篩選生防細(xì)菌，獲得1 株對黃瓜枯萎病菌有較強(qiáng)抑制作用的假單胞屬菌株33-1。周東興等[15]利用梯度稀釋涂板法和平板對峙生長法從蚯蚓糞中篩選到1 株對番茄枯萎病有良好生防作用的細(xì)菌，并通過盆栽試驗(yàn)測定該菌株對番茄枯萎病的防治效果達(dá)59.25%。此外，鄭麗等[16]從8 個(gè)不同生境木薯中分離到298 株細(xì)菌，通過測定其產(chǎn)酶、次生代謝物和拮抗活性優(yōu)選11 個(gè)菌株進(jìn)行日光溫室大棚盆栽防效測定，其中，HWY-3-1 對木薯枯萎病防效為100%，其余10 株防效均在60%以上。而國內(nèi)外有關(guān)豇豆枯萎病生防資源的報(bào)道較少，從豇豆-水稻輪作土壤中篩選生防細(xì)菌是挖掘豇豆枯萎病生防資源的主要途徑之一。

本研究通過分離純化豇豆-水稻輪作土壤細(xì)菌，采用對峙法評價(jià)其生防潛力，對其中拮抗效果最好的菌株SD13 通過形態(tài)學(xué)及分子手段進(jìn)行鑒定，初步探究該生防菌的抑菌以及促生機(jī)制，最后通過盆栽實(shí)驗(yàn)評估不同濃度的生防菌SD13對豇豆枯萎病的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試豇豆枯萎病病原菌由海南省三亞市熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。供試豇豆種子南豇1 號。土壤樣品采自海南省三亞市崖州區(qū)的熱水宮路常年發(fā)病地塊，采集豇豆-水稻輪作土壤15 份。盆栽自然土采自海南省三亞市熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院崖州基地種子資源圃。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 蛋白質(zhì)檢測培養(yǎng)基[17]：脫脂奶粉3.0 g、瓊脂4 g、去離子水200 mL、pH 為7.0～7.2，108 ℃高壓蒸氣滅菌15 min。

幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基[18]：膠體狀幾丁質(zhì)1%（w/V）、磷酸二氫銨1 g、氯化鉀0.2 g、硫酸鎂0.2 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7。制備膠狀幾丁質(zhì)：20 g 甲殼素溶于350 mL 濃鹽酸，4 ℃放置24 h，玻璃棉過濾，濾液加入2 L冰無水乙醇–20 ℃ 過夜后， 10 000 r/min 離心20 min，沉淀用流動自來水不斷沖洗，直至pH 呈中性，–20 ℃密封保存。

β-1，3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基[19]：β-1，3-葡聚糖2 g、硝酸鈉2 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、剛果紅0.05 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

纖維素酶檢測培養(yǎng)基[18]：羧甲基纖維素鈉10 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.0。

無氮培養(yǎng)基[20]：蔗糖10 g、氯化鈉0.12 g、硫酸氫二鉀0.5 g、碳酸鈣1 g、硫酸鎂0.2 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

鉀長石培養(yǎng)基[21]：硫酸銨1.0 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鈉0.1 g，硫酸氫二鈉2.0 g，蔗糖10 g，酵母粉0.5 g，鉀長石粉10.0 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

無機(jī)磷培養(yǎng)基[21]：硫酸銨0.5 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鈉0.2 g、磷酸鈣10.0 g、碳酸鈣0.5 g、葡萄糖2.0 g、硫酸錳0.02 g、硫酸亞鐵0.02 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

有機(jī)磷培養(yǎng)基[21]：硫酸銨0.5 g、碳酸鈣0. 5g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鈉0.2 g、卵磷脂0.2 g、葡萄糖2.0 g、硫酸錳0.02 g、硫酸亞鐵0.02 g、瓊脂20 g，無菌水定容至1000 mL，pH 為7.2。

嗜鐵素檢測培養(yǎng)基：北京酷來博科技有限公司改良的CAS 瓊脂檢測培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 土壤細(xì)菌分離 采集未患枯萎病的豇豆-水稻輪作土壤，采用稀釋涂板法[22]分離土壤細(xì)菌。從15 份土壤中各稱取10 g 土壤樣品，10 g土壤樣品與90 mL 無菌水混合，振蕩30 min，靜止15 min，將上清液依次稀釋為10^–3、10^–4、10^–5和10^–6，然后各取100 μL 上清液涂布于LB 培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，挑取不同形態(tài)的細(xì)菌菌落劃線純化，于–20 ℃冰箱保存。

1.2.2 拮抗菌的初篩與復(fù)篩 以豇豆枯萎病病原菌作為對照菌株，采用平板對峙法[23]對

1.2.1 中保存的菌株進(jìn)行初篩，在PDA 固體培養(yǎng)基平板中央接種0.5 cm 豇豆枯萎病菌菌餅，每個(gè)培養(yǎng)基平板用十字對稱選取4 個(gè)距離中央2.5 cm 的點(diǎn)，在4 個(gè)點(diǎn)用牙簽點(diǎn)接分離純化保存的同一菌株，對具有拮抗效果的菌株用同樣的方法進(jìn)行復(fù)篩并保存。采用十字交叉法測量菌落直徑。抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。

1.2.3 生防菌SD13 的鑒定 （1）菌體形態(tài)觀察。將拮抗菌株SD13 在LB 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察菌落形態(tài)，革蘭染色后顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

（2）分子鑒定。通過北京諾博萊德科技有限公司細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取拮抗菌株SD13 的DNA， 采用16S rDNA 細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對拮抗菌株SD13 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。50 μL 反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL、引物1492R 和27F 各1 μL、Taq 酶25 μL、ddH₂O 22 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 min，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃總延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果通過Ezbicloud 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列比對分析，選取同源性較高的菌株通過MEGA 6.06 軟件使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 制備10⁹CFU/mL SD13 菌懸液 將LB 平板中的SD13 單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基中，29 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 得到菌懸液，以1%接種量接種至LB 培養(yǎng)基中，于29 ℃、180 r/min 條件下發(fā)酵24 h 后，將菌懸液稀釋成OD600=2.3，得到10⁹CFU/mL SD13 菌懸液（菌懸液的OD600 為2.3 稀釋涂板法后，計(jì)算其菌落個(gè)數(shù)為1×10⁹～2.5×10⁹CFU/mL，3 次重復(fù)）。本研究中制備10⁹CFU/mL SD13 菌懸液均用此方法。

1.2.5 拮抗菌株SD13 對豇豆枯萎病病原菌菌絲與孢子的抑制效果 參考林福呈等[24]的液體共培養(yǎng)測定方法，稍加改進(jìn)，將病原菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)7 d，再用無菌水稀釋培養(yǎng)物，使培養(yǎng)物的孢子數(shù)量為108 CFU/mL，培養(yǎng)物中的菌絲無需過濾。然后取10 mL 培養(yǎng)物接種到100 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，使孢子總數(shù)為10⁹CFU/mL，再接1 mL 10⁹CFU/mL SD13 菌懸液，使SD13 菌量與病原菌孢子數(shù)量一致，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，3 次重復(fù)。以10 mL 病原菌培養(yǎng)物+1 mL LB 作為對照。間隔12 h 觀察一次拮抗菌對孢子和菌絲抑制作用，并拍照記錄。

1.2.6 生防菌SD13 菌體和發(fā)酵濾液對豇豆枯萎病病原菌孢子的抑制能力 制備病原菌孢子懸浮液：將病原菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)7 d，并用8 層無菌紗布過濾菌絲。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)量，并將孢子數(shù)量用無菌水稀釋至5×10⁷CFU/mL。

制備SD13 菌體懸浮液：將制備的10⁹CFU/mLSD13 菌懸液（含發(fā)酵液）以10 000 r/min 離心15 min，將菌體與發(fā)酵液分開，再用等體積的無菌水重懸浮菌體，獲得濃度為10⁹CFU/mL 的菌體懸浮液，備用。

制備發(fā)酵濾液：將離心得到的發(fā)酵液通過0.22 μm 無菌微孔濾膜過濾2 次，備用。

搖勻菌體懸浮液與病原菌孢子懸浮液，使菌體與孢子在液體中分布均勻，取1 mL 10⁹CFU/mL菌體懸浮液和1 mL 5×10⁷CFU/mL 病原菌孢子懸浮液于5 mL 無菌試管中，以1 mL 無菌水加等量的病原菌孢子懸浮液作為對照。再取1 mL 無菌發(fā)酵液和1 mL 5×10⁷CFU/mL 病原菌孢子懸浮液于另一個(gè)5 mL 無菌離心管中，以1 mL LB 液體培養(yǎng)基加等量病原菌孢子懸浮液作為對照。重復(fù)3 次，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)。分別于0、12、24、48 h用血球計(jì)數(shù)板觀察處理組與對照組的完整孢子數(shù)量。

1.2.7 生防菌SD13 抑菌胞外酶活性測定 蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶活性測定[17-19]：菌株在LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，再用滅菌接種針挑取單菌落分別點(diǎn)接于蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，觀察周圍有無透明圈產(chǎn)生并測量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D）。根據(jù)培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生透明圈判斷有無酶活性，酶活性大小與HC值（D/d）呈正相關(guān)。

纖維素酶活性測定[18]：菌株在LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，再用滅菌接種針挑取菌落點(diǎn)接于纖維素酶活性檢測培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用1 mg/mL 剛果紅溶液將整個(gè)培養(yǎng)皿完全浸沒染色，染液停留30 min，倒掉染液，用1 mol/L NaCl 溶液洗滌。觀察測量方法同上。

1.2.8 生防菌SD13的促生能力相關(guān)功能檢測固氮能力測定：參考王明歡等[20]的方法，根據(jù)菌株是否能在無氮培養(yǎng)基上生長判斷有無固氮能力。

溶磷、解鉀能力的測定[21]：菌株在LB 平板培養(yǎng)基上活化24 h，再用滅菌接種針挑取菌落分別點(diǎn)接于有機(jī)磷培養(yǎng)基、無機(jī)磷培養(yǎng)基和鉀長石培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，觀察測量方法同1.2.7。

產(chǎn)嗜鐵體能力測定：菌株在LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，再用滅菌接種針將單菌落點(diǎn)接于嗜鐵素檢測培養(yǎng)基平板上，觀察7～14 d。鉻天青（CAS）和溴化十六烷基三甲銨（HDTMA）與鐵離子混合后可以形成一種復(fù)合物，呈亮藍(lán)色。當(dāng)鐵離子被試驗(yàn)菌株分泌嗜鐵素奪走時(shí)，菌株周圍形成橘黃色的透明圈。因此，可根據(jù)平板上菌落周圍是否形成橘黃色的透明圈和根據(jù)透明圈大小判斷產(chǎn)嗜鐵素的強(qiáng)弱。

IAA 定性測定：參考萬兵兵等[25]的方法，產(chǎn)IAA 能力可根據(jù)白瓷板上溶液顏色是否變紅，如果顏色變色就表示菌株能夠產(chǎn)生IAA。

1.2.9 生防菌SD13 廣譜抑菌能力測定 測定拮抗菌株SD13 對6 種生產(chǎn)上重要病害病原菌[青瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、辣椒枯萎病菌（F. oxysporum）、甜瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、苦瓜枯萎病菌（ F. solani ）、豇豆葉斑病菌（ Alternaria alternata ）、煙草疫霉病菌（Phytophthora nicotianae）]的抑制率。

拮抗菌株SD13 的菌餅制備：在LB 固體培養(yǎng)基平板中加入200 μL 109 CFU/mL SD13 菌懸液，均勻涂布，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，制成菌株平板，用打孔器取0.5 cm 的拮抗菌株菌餅，備用。

采用平板對峙法在PDA 固體培養(yǎng)基平板中央接種0.5 cm 病原菌菌餅，用十字對稱選取4 個(gè)距離中央2.5 cm 的點(diǎn)，放置0.5 cm 的SD13 菌餅，以只接病原菌菌餅作為對照，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑制率，公式同1.2.2。

1.2.10 SD13 盆栽防效及促生實(shí)驗(yàn) 豇豆種子處理：將豇豆種子用3%次氯酸鈉消毒10 min，然后用蒸餾水反復(fù)清洗3～5 遍，晾干后置于含有椰糠育苗盤中，在溫室大棚培育2 周后，原葉完全展開，取長勢優(yōu)良且一致的幼苗用于實(shí)驗(yàn)。土壤處理：自然土經(jīng)曬干，過篩與營養(yǎng)土2∶1 質(zhì)量比混合，備用。

生防菌SD13 無發(fā)酵液菌體懸浮液制備：將制備的10⁹CFU/mL SD13 菌懸液8000 r/min 離心，收集菌體，再用200 mL 無菌水重懸菌體，獲得濃度為10⁹CFU/mL 的無發(fā)酵液菌體懸浮液，用無菌水配置濃度為10⁸、10⁶、10⁴CFU/mL 無發(fā)酵液菌體懸浮液，備用。

豇豆枯萎病病原菌孢子懸浮液制備：將在PDA平板上生長3 d 的菌落接種至200 mL 的PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)5 d后用無菌8 層紗布過濾，獲得孢子懸浮液，再用無菌水稀釋至106 CFU/mL，備用。

盆栽防效實(shí)驗(yàn)中生防菌共設(shè)置4 個(gè)濃度：10⁹、10⁸、10⁶、10⁴CFU/mL。取1 kg 土裝至盆鉑中，10 個(gè)處理：（1）病原菌處理+生防菌10⁴CFU/mL（F+10⁴S）、（2）病原菌處理+生防菌10⁶CFU/mL（F+10⁶S）、（3）病原菌處理+生防菌10⁸CFU/mL（F+10⁸S）、（4）病原菌處理+生防菌109 CFU/mL（F+109S）、（5）病原菌對照（F）、（6）生防菌10⁴CFU/mL（10⁴S）、（7）生防菌10⁶CFU/mL（10⁶S）、（8）生防菌10⁸CFU/mL（10⁸S）、（9）生防菌10⁹CFU/mL（10⁹S）、（10）清水對照（CK）。

其中，病原菌處理：取100 mL 豇豆枯萎病病原菌孢子懸浮液與200 mL 無菌水混合后拌土，充分?jǐn)嚢杌靹?，土壤含菌量?05 CFU/g。其他處理則用等體積的清水混拌。將豇豆植株的根尖處切除0.3 cm 進(jìn)行傷根移植。移植后，每周對F 和CK 處理用55 mL 清水處理，其他處理取5 mL 生防菌與50 mL 清水混合灌根。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2 株苗，3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，觀察并記錄發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果。豇豆苗期的病情分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[1]，豇豆苗后期到抽蔓期的病情分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]。測量其株高、根長、地上鮮重、地下鮮重、地上干重、地下鮮重，評價(jià)其促生作用。發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%；病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×該病級值）/（總株數(shù)×最高級值）×100；防治效果=（CK 病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/CK 病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌的分離純化

從海南省三亞市崖州區(qū)常年發(fā)病嚴(yán)重的5 塊地塊采集土壤樣本15 份，從中分離到93 株菌，其中63 株細(xì)菌，30 株放線菌。

2.2 拮抗菌的初篩與復(fù)篩

用平板對峙法對分離純化的菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，篩選得到11 株對豇豆枯萎病有較好抑制作用的菌株（表1），其中菌株SD13 抑制率為82.0%，抑制效果最好（圖1A）。

2.3 生防菌SD13的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 拮抗菌SD13 在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，呈淺乳白色、近圓形、表面粗糙邊緣不規(guī)則（圖1A～圖1B）。經(jīng)革蘭氏染色，將SD13鑒定為革蘭氏陽性菌（圖1C）。

2.3.2 分子鑒定 測序結(jié)果顯示，拮抗菌株SD13的16S rDNA 序列長度為1452 bp，在Ezbicloud數(shù)據(jù)庫同源序列對比結(jié)果中，菌株SD13 的16SrDNA 序列與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CR-502（登錄號：AY603658）相似性為99.5%（圖2），從Ezbicloud 數(shù)據(jù)庫中挑選12 株具有代表性的序列相似菌株以及1 株外源菌株P(guān)aenibacillusselenitireducens ES3-24（登錄號：KC815539.1）與SD13 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株SD13 與B.velezensis CR-502 單獨(dú)聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)，將菌株SD13 鑒定B. velezensis。

2.4 生防菌SD13 對豇豆枯萎病病原菌菌絲和孢子的抑制效果

液體共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SD13 對尖孢鐮刀菌菌絲、孢子均有很強(qiáng)的溶菌作用。圖3為病原菌菌絲的溶解過程。圖3A 為只添加病原菌的對照處理，病原菌菌絲正常，24 h 后觀察到添加SD13 的處理部分病原菌菌絲發(fā)生膨大、畸形、基質(zhì)外泄（圖3B），120 h 菌絲全部被溶解，僅剩少量無內(nèi)容物菌絲（圖3C）。圖4 為孢子的溶解狀態(tài)。

2.5 生防菌SD13 菌體與發(fā)酵濾液對豇豆枯萎病病原菌孢子的抑制能力

研究結(jié)果表明，在菌體處理0～12 h，豇豆枯萎病病原菌孢子數(shù)量下降64.5%，48 h 時(shí)比0 h下降86.6%。發(fā)酵濾液處理0～12 h，豇豆枯萎病病原菌孢子數(shù)量下降34.4%，48 h 相對0 h 下降27.2%（表2）。說明生防菌SD13 菌體與發(fā)酵濾液均能溶解豇豆枯萎病病原菌孢子，但SD13 菌體的溶解能力比SD13 發(fā)酵濾液更強(qiáng)。

2.6 生防菌SD13的抑菌胞外酶活性檢測

檢測結(jié)果表明（圖5），生防菌SD13 具有產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶的能力，β-1，3-葡聚糖酶的HC 值是蛋白酶、纖維素酶的4～6 倍（表3），說明SD13 分泌β-1，3-葡聚糖酶活性更高。

2.7 SD13促生因子檢測

檢測結(jié)果顯示（圖5，表3），SD13 在嗜鐵素與解無機(jī)磷檢測培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈，可以在無氮培養(yǎng)基上生長，說明SD13 具有產(chǎn)嗜鐵素、解無機(jī)磷、固氮能力。

2.8 生防菌SD13的廣譜抑菌活性測定

平板對峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SD13 對6 種病原菌的抑制率在66.7～82.3%之間（表4，圖6）。說明菌株SD13 具有廣譜抑菌活性，且抑菌能力較強(qiáng)。

2.9 不同濃度生防菌SD13的促生及防治效果

盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表5，圖7），SD13 的各濃度處理對豇豆植株均具有較強(qiáng)的促生能力，能加快植株生長，表現(xiàn)為植株增高，葉片增大（圖7A）。由表5 可知，108S 處理的促生能力最好，與其他處理具有較強(qiáng)顯著差異。109S 處理的促生效果較差，處理植株在幼苗期間生長緩慢，植株矮小，莖根細(xì)小，植株進(jìn)入抽蔓期后恢復(fù)促生生長，35 d 后植株各生長指標(biāo)相對CK 較高。

在實(shí)驗(yàn)觀察期間，F(xiàn) 處理的病情指數(shù)隨時(shí)間逐漸升高，施用生防菌4 個(gè)處理的病情指數(shù)增長緩慢，并且在28～35 d 停止增長（圖7B），說明多次施用生防菌SD13 可以持續(xù)有效控制豇豆枯萎病病情的發(fā)展。14 d 后，F(xiàn) 處理的豇豆植株開始發(fā)病，原生葉片開始變黃、掉落，基莖腫脹，植株發(fā)育不良，發(fā)病率為80%。F+10⁴S、F+10⁶S、F+10⁸S 與F+10⁹S 處理的豇豆植株發(fā)病率分別為40%、30%、80%、80%。35 d 后，F(xiàn) 處理的發(fā)病率達(dá)到100%，施用生防菌的4 個(gè)處理發(fā)病率均無增長。如圖7C 所示，F(xiàn)+10⁶S 防治效果為62.0%，具有顯著差異，是最佳防治濃度。

綜合防治效果與促生能力認(rèn)為，生防菌SD13的最佳施用濃度為106 CFU/mL，其防治效果最好，而促生效果僅次于108 CFU/mL。

3 討論

國內(nèi)豇豆枯萎病的防治主要依賴化學(xué)防治，微生物防治的相關(guān)報(bào)道較少，尤其是生防細(xì)菌，國內(nèi)外報(bào)道甚少。本研究通過從土壤中篩選11 株拮抗細(xì)菌，對抑制率最強(qiáng)的拮抗菌株SD13 進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定，該菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。貝萊斯芽孢桿菌SD13 對豇豆枯萎病菌尖孢鐮刀菌的菌絲、孢子具有很強(qiáng)的溶解作用，同時(shí)可以產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶3 種抑菌胞外酶，并具有產(chǎn)嗜鐵素、固氮、解無機(jī)磷3 種促生功能，抑菌廣譜。經(jīng)盆栽實(shí)驗(yàn)證明貝萊斯芽孢桿菌SD13 對豇豆枯萎病具有良好的防治效果，并對豇豆植株具有較強(qiáng)的促生能力。貝萊斯芽孢桿菌SD13 是一株有潛力的生防細(xì)菌，有望成為防治豇豆枯萎病的重要生防資源。

貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）的一個(gè)新種，因具有廣譜抑菌活性和促進(jìn)植物生長等特點(diǎn)而被廣泛研究[26-27]。已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌對小青菜、香蕉、番茄等有促生長作用，能抑制植物病原稻瘟病菌、黃瓜枯萎病菌、辣椒疫霉菌、橡膠炭疽菌、香蕉枯萎病菌等病菌的生長[28-31]。

糖蛋白和葡聚糖是尖孢鐮刀菌細(xì)胞壁的主要成分，也是大部分真菌細(xì)胞壁的主要成分[32]。據(jù)報(bào)道，貝萊斯芽孢桿菌可以通過分泌的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等胞外水解酶抑制病原菌[33]，貝萊斯芽孢桿菌HYEB5-6 通過分泌蛋白酶和葡聚糖酶破壞炭疽菌菌絲細(xì)胞壁，抑制分生孢子的萌發(fā)、胚芽管的生長和附著胞的形成[34]，尤其是β-1，3-葡聚糖酶，廣泛存在于高等植物中，可以降解真菌細(xì)胞壁，對植物防御致病真菌起到重要作用[35]。本研究中SD13 對尖孢鐮刀菌的菌絲、孢子溶解主要是由蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶破壞其細(xì)胞壁導(dǎo)致的。

氮、磷、鉀是植物生長的必需元素，能夠促進(jìn)植物健康發(fā)育，提高作物產(chǎn)量。作物缺氮、磷會導(dǎo)致作物生長緩慢。研究表明，接種固氮菌株巨芽孢桿菌（B. megaterium）N3 能夠促進(jìn)二月蘭生長，同時(shí)土壤的理化性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)均得到顯著改善[36]。解磷細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）CBMB205 的19 個(gè)磷酸酶基因均參與使土壤中難以利用的磷轉(zhuǎn)化為植物易吸收的磷[37]。在本研究中，SD13 能夠解無機(jī)磷、固氮，對豇豆具有較強(qiáng)的促生能力。此外，SD13 具有較強(qiáng)的產(chǎn)嗜鐵素能力，嗜鐵素（siderophore）也叫高鐵載體，能特異地螯合含鐵離子的化合物使SD13 在低鐵環(huán)境中與病原菌競爭鐵元素，抑制病原菌的發(fā)展，也能將難溶的鐵轉(zhuǎn)化為易溶的鐵供植物吸收，促進(jìn)植物生長[38-41]。

經(jīng)盆栽實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度SD13 均具有防治豇豆枯萎病和促進(jìn)豇豆植株生長的作用，并不是濃度越高效果越好，10⁶CFU/mL 為最佳防治濃度，而10⁸CFU/mL 是最佳促生濃度，濃度為10⁹ CFU/mL 時(shí)，豇豆幼苗生長受到抑制，但這種抑制是短暫的，豇豆植株會在抽蔓期恢復(fù)促生生長。研究顯示，多次施用生防菌SD13 可以持續(xù)有效控制豇豆枯萎病病情發(fā)展，因此，在施用SD13 防治枯萎病時(shí)建議少量多次。研究發(fā)現(xiàn)SD13 具有溶菌作用，在防治病害時(shí)，溶菌作用與促生共同起作用，在接種SD13 后，SD13 產(chǎn)生的蛋白酶、蛋白酶溶解致病菌細(xì)胞壁，減少病原菌數(shù)量。同時(shí)，SD13 具有促生作用，提高植株的品質(zhì)，加強(qiáng)抗病能力，在二者作用下，從而控制病害的發(fā)展，達(dá)到防治效果。