尖孢鐮刀菌Six1d啟動子的克隆及其在真菌分泌表達載體構(gòu)建中的應(yīng)用

彭存智　常麗麗　王丹　黃超　徐兵強　仝征

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病；內(nèi)源啟動子；分泌表達載體；Six1d 蛋白

中圖分類號：S436.68 文獻標識碼：A

香蕉枯萎病是危害香蕉產(chǎn)業(yè)的重要病害，而尖孢鐮刀菌古巴營養(yǎng)?；停‵usarium oxysporumf.sp. cubense， Foc）是引起這種病害的病原真菌，可導(dǎo)致香蕉嚴重減產(chǎn)，甚至絕收。根據(jù)對不同香蕉品系的致病性Foc 可細分為4 個生理小種，包括1 號小種（race 1，F(xiàn)oc1）、2 號小種（race 2，F(xiàn)oc2）、3 號小種（race 3，F(xiàn)oc3）和4 號小種（race4，F(xiàn)oc4），其中Foc4 具有廣泛的寄主范圍，根據(jù)病害發(fā)生是否受冷害脅迫以及發(fā)生的地理區(qū)域可進一步區(qū)分為熱帶4 號小種（tropical race 4，F(xiàn)oc TR4）和亞熱帶4 號小種（subtropical race 4，F(xiàn)oc STR4）[1-3]。Foc TR4 在所有生理小種中致病性最強對我國南方香蕉主產(chǎn)區(qū)危害最大，尤其對Cavendish 系列香蕉有致命的侵害作用[3] 。Cavendish 香蕉是國內(nèi)目前栽培面積最大、產(chǎn)量最多的品種群，但市場歡迎度較高的一些品種（如巴西蕉等），對Foc TR4 極度易感[4]。通過引進和自選獲得的一些抗枯萎病栽培品種（如南天黃等）雖然對Foc TR4 具有一定的抗性，但這類抗病性易受環(huán)境影響，且植株的發(fā)病率會隨著土壤中Foc TR4 孢子含量的增加而顯著上升[5]。因此，加強對香蕉枯萎病抗感病機制研究將有助于培育香蕉枯萎病抗性新品種。病原菌在侵染寄主植物致病的過程中，會分泌一系列蛋白質(zhì)、酶和毒素阻止植物的防御反應(yīng)，從而有利于自身的生存和繁殖[6-7]，而植物免疫系統(tǒng)可通過識別某些分泌蛋白來產(chǎn)生抗病性[8]。在Foc 的研究中，人們通過觀察攜帶真菌表達載體pCT74 的Foc1 和Foc TR4侵染香蕉根部的過程，已經(jīng)闡釋了一些Foc 的致病機制[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌在表達某些內(nèi)源基因時的產(chǎn)量特別高，表明絲狀真菌基因組中存在強啟動子，能夠驅(qū)動內(nèi)源基因的高效表達[10-11]。使用內(nèi)源強啟動子有利于在體內(nèi)高效、穩(wěn)定、特異地表達外源目標基因[12]。已報道的絲狀真菌啟動子有瑞氏木霉纖維二糖水解酶基因（cellobiohydrolase，cbh1）啟動子，構(gòu)巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpdA）啟動子，曲霉葡糖淀粉酶基因（glucoamylase，glaA）啟動子[13]，橡膠樹白粉菌（HO-73）啟動子[14]等。本研究團隊前期已將Foc1 高豐度分泌表達蛋白secreted in xylem 1d（Six1d）[15]的N 端分泌信號肽連接至常用真菌表達載體pCT74 中，構(gòu)建了新型真菌分泌載體p74HSP- EGFP，該載體可將綠色熒光蛋白EGFP 分泌至Foc TR4 菌體外，并在Foc TR4 菌株侵染香蕉過程中將EGFP 蛋白分泌到香蕉根部[16]。為了能在Foc 菌株中更高效表達內(nèi)源基因，本研究在已有的p74HSP- EGFP載體基礎(chǔ)上，克隆到Foc1 Six1d 基因的啟動子，并替換p74HSP-EGFP 載體中的ToxA 啟動子，將p74HSP-EGFP 進一步改造為由Foc 內(nèi)源啟動子驅(qū)動的分泌表達載體。通過比較ToxA 啟動子和Six1d啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白的熒光強度以及表達豐度，證明Six1d 啟動子在Foc 中的表達活性比ToxA啟動子高，為后續(xù)研究Foc 致病相關(guān)蛋白或抗病相關(guān)外源蛋白在香蕉枯萎病中的作用機理提供重要的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Foc1 由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所曾會才博士提供，F(xiàn)oc TR4 由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所周登博博士提供， 非分泌型真菌表達轉(zhuǎn)化菌株FocTR4-HPG 由本實驗室保存。用于載體構(gòu)建的大腸桿菌菌株DH5α 購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.2 質(zhì)粒 真菌表達載體p74HSP-EGFP 由本實驗室構(gòu)建和保存[9]，該載體含有潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（ hygR ） ， 增強型綠色熒光基因（EGFP），來源于小麥黃斑病菌（Pyrenophoratritici-repentis）的ToxA 啟動子[17]，以及來源于Foc1 的Six1d 蛋白分泌信號肽。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 LB 培養(yǎng)基：10 g/L NaCl，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物；土豆液體培養(yǎng)基（PDB）：200 g 土豆切絲，加水煮沸15～20 min，紗布過濾，加入20 g 蔗糖，定容到1 L，高溫滅菌；土豆瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：PDB 中添加9 g/L 瓊脂粉；液體再生培養(yǎng)基：PDB 中添加274 g/L 蔗糖；固體再生培養(yǎng)基：液體再生培養(yǎng)基中添加9 g/L 瓊脂粉；鉀鹽液體培養(yǎng)基（KK）：1.0 g/L K₂HPO₄， 0.5 g/L KCl， 0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01 g/L Fe-Na EDTA， 2.0 g/L 天門冬酰胺和10.0 g/L D-半乳糖，pH 5.0；溶酶液：0.1 mol/LNaH₂PO₄， 0.8 mol/L NaCl，pH 5.8；酶解液：10 mg/mL 崩潰酶（Drislase， Sigma），10 mg/mL溶壁酶（Lysing Enzyme， Sigma），加入溶酶液，80 r/min 搖床振蕩溶解30 min，過濾除菌。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑：0.8 mol/L NaC1 溶液；STC 溶液：1.2 mol/L Sorbitol，10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），50 mmol/L CaCl₂，過濾除菌；60% PTC 溶液：STC溶解PEG4000 配制成60%溶液，過濾除菌。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA 的提取 取直徑約5 mm的真菌菌盤接種到20 mL 的PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)3 d，過濾收集菌絲。分別稱取100 mg 菌絲到2 mL 離心管中，置于液氮中冷凍2 min，用高速組織研磨儀破碎菌絲（Servicebio， China），最后用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen， China）進行真菌基因組DNA 的提取。

1.2.2 Six1d 啟動子的擴增 根據(jù)Foc1 基因組測序序列（GenBank No. KB730415.1）中Six1d 基因上游序列設(shè)計特異引物對（表1），以Foc1 基因組DNA 為模版，通過PrimeSTAR Max DNA Polymerase（Takara， Japan）擴增Six1d 啟動子，反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共32 個循環(huán)。擴增產(chǎn)物純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 pSix1d74HSPG 載體的構(gòu)建，測序和啟動子元件分析 p74HSP-EGFP 載體的ToxA 啟動子區(qū)域通過Hind Ⅲ酶切后補平，再用Cla I 酶切，切除ToxA 啟動子。將擴增獲得的Six1d 啟動子序列片段同樣用ClaⅠ酶切，連接進p74HSP-EGFP載體片段中，構(gòu)建得到完整的載體pSix1d74-HSPG。載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，寄送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果提交到http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/，進行啟動子元件在線分析。

1.2.4 原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化 主要參考黃東杰等[18]的方法，并進行適當(dāng)?shù)母牧?。接種Foc TR4 菌株到20 mL PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)3～4 d。3 層無菌擦鏡紙過濾菌液，濾液轉(zhuǎn)移到100 mL PDB 中擴大培養(yǎng)10～12 h。3 層無菌擦鏡紙過濾菌液收集菌絲，無菌水沖洗2 遍，0.8 mol NaCl 溶液沖洗2 遍。菌絲轉(zhuǎn)移到250 mL無菌三角瓶中，稱重，按照每0.2 g 菌絲加入10 mL酶解液的比例進行酶解，28 ℃，80 r/min 搖床避光酶解3.5 h。酶解的菌液用5 層無菌擦鏡紙過濾，預(yù)冷0.8 mol NaCl 溶液沖洗并收集到50 mL 離心管中，4 ℃，5000 r/min 離心15 min。棄上清，加入5 mL 預(yù)冷的STC 溶液重懸，4 ℃，5000 r/min離心15 min。棄上清，加入適量的STC 溶液重懸，使原生質(zhì)體濃度至約1×10⁸CFU/mL。按照200 μL原生質(zhì)體、50 μL 質(zhì)?；駾NA （5～10 μg）、50 μLPTC 的順序加入15 mL 離心管中，混勻后冰浴30 min。加入2 mL PTC，混勻后室溫放置20 min。加入3 mL 液體再生培養(yǎng)基，混勻后28 ℃，光照靜置培養(yǎng)12～14 h。5000 r/min 離心15 min，棄上清4 mL，剩余菌液重懸后轉(zhuǎn)入40 mL 融化的固體再生培養(yǎng)基（45～55 ℃）中，混勻后倒入9 mm 培養(yǎng)皿，凝固后再倒入含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基。3～5 d 后長出轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)至新的含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上進行再次篩選。重復(fù)轉(zhuǎn)接3～4 次，以獲得性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化菌株。

1.2.5 真菌表達載體轉(zhuǎn)化菌株的鑒定 轉(zhuǎn)化菌株接種到20 mL 含100 μg/mL 潮霉素B 的PDB 中，28 ℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)3 d，按照前面所述方法收集菌絲并提取真菌基因組DNA。根據(jù)EGFP 基因序列設(shè)計特異引物對（表1），通過PCR 反應(yīng)檢測攜帶EGFP 基因的真菌表達載體是否成功導(dǎo)入Foc TR4。反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃60 s，共32 個循環(huán)，擴增產(chǎn)物為646 bp DNA 片段。

1.2.6 菌液的顯微鏡熒光觀察以及熒光強度和EGFP 蛋白含量變化的檢測 將轉(zhuǎn)化菌株分別接種到200 mL 含100 μg/mL 潮霉素B 的KK 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃，200 r/min 條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，每24 h 分別吸取20 μL 菌液進行熒光顯微鏡（Olympus， USA）觀察。培養(yǎng)到第5 天，通過紫外可見分光光度計（Techcomp， China）測定菌液濃度，用KK 液體培養(yǎng)基統(tǒng)一稀釋到OD600=1.5的濃度，各取50 mL 菌液用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。分別吸取200 μL 過濾后的溶液，通過全波長多功能酶標儀（Bio-Tek， USA）檢測溶液的熒光強度值（激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為528 nm）。以上數(shù)據(jù)檢測重復(fù)3 次。同時采用本實驗室改進的蛋白提取方法[19]提取上述過濾后液體培養(yǎng)基中的總蛋白，用BRADFORD[20]的方法測定蛋白濃度。分別取20 μg 總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，Image scanner Ⅲ圖像掃描系統(tǒng)（GE， USA）掃描凝膠獲取圖片，并利用ImageJ軟件計算蛋白質(zhì)條帶的灰度值[21]，獲得EGFP 蛋白表達量的相對變化。Western blot 檢測采用TONG 等[22]描述的方法進行，利用GFP 兔單克隆抗體（Beyotime， China）檢測EGFP 蛋白的表達量。以上熒光強度和EGFP 蛋白含量變化的檢測實驗均重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Excel 2010 軟件的統(tǒng)計工具對數(shù)據(jù)進行均值和標準偏差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Six1d 啟動子的克隆，pSix1d74HSPG 載體的構(gòu)建及順式作用元件分析

以Foc1 的基因組DNA 為模版，通過特異引物SixPro-F 和SixPro-R 進行PCR 擴增，獲得Six1d啟動子目的條帶，純化回收備用。同時利用HindIII 限制性內(nèi)切酶對分泌表達載體p74HSP-EGFP的ToxA 啟動子下游末端進行酶切，補平粘性末端。再用Cla I 限制性內(nèi)切酶酶切，切除ToxA 啟動子，獲得載體片段。隨后將克隆的Six1d 啟動子片段通過Cla I 酶切后，連接進p74HSP-EGFP 載體片段中，構(gòu)建的新載體命名為pSix1d74HSPG（圖1）。

將攜帶pSix1d74HSPG 載體的DH5α 菌株寄送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果表明，克隆的Six1d 啟動子片段序列長度為1999 bp，與公布的Foc1 基因組（Accession No.KB730415）中的序列一致。將序列提交到啟動子元件預(yù)測分析網(wǎng)站Plant CARE[23]進行分析。結(jié)果表明，啟動子中除了CAAT-box、TATA-box 等核心元件以外， 同時還含有ABRE 、AuxRR-core 、CGTCA-motif/TGACG-motif 激素類響應(yīng)元件，ARE、LTR、MBS 環(huán)境脅迫類響應(yīng)元件以及G-box、Sp1 等光響應(yīng)元件（圖2）。

2.2 p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 載體對Foc TR4 菌株的轉(zhuǎn)化及PCR 鑒定

真菌分泌表達載體p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 轉(zhuǎn)化Foc TR4 的原生質(zhì)體后，將長出的轉(zhuǎn)化菌株轉(zhuǎn)至新的含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上進行再次篩選。培養(yǎng)5 d 后，挑選并接種正常生長的轉(zhuǎn)化菌株到PDB 中繼續(xù)培養(yǎng)，然后收集菌絲提取基因組DNA，通過EGFP 基因特異引物對（表1）進行PCR 鑒定。對鑒定成功的陽性轉(zhuǎn)化菌株進行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，重復(fù)2～3 次，獲得性狀穩(wěn)定的陽性轉(zhuǎn)化菌株，分別命名為FocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG。PCR 鑒定結(jié)果顯示，從Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG菌株DNA 中均能擴增出646 bp 的EGFP 基因片段，表明真菌表達載體p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 已成功轉(zhuǎn)入Foc TR4 菌株中（圖3）。

2.3 轉(zhuǎn)化菌株的熒光顯微鏡觀察

分別將Foc TR4 野生型菌株，F(xiàn)oc TR4-HPG、Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 轉(zhuǎn)化菌株接種到KK 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每隔24 h 吸取菌液通過熒光顯微鏡進行觀察（圖4）。結(jié)果顯示，在明場的可見光下，不同時期菌絲生長形態(tài)均表現(xiàn)正常，沒有明顯區(qū)別（圖中僅顯示培養(yǎng)120 h 的明場圖片）。在488 nm 激發(fā)光下，F(xiàn)oc TR4 野生型菌落不發(fā)綠色熒光；Foc TR4-HPG攜帶的是非分泌型真菌表達載體，菌絲能發(fā)出明亮的綠色熒光，但沒有明顯的熒光背景，只是在培養(yǎng)后期可能由于EGFP 蛋白的逸出，才出現(xiàn)微弱的熒光背景； Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 攜帶的是分泌型真菌表達載體，在培養(yǎng)早期就由于表達并分泌EGFP 蛋白而出現(xiàn)綠色熒光背景，隨著培養(yǎng)時間的增加，熒光背景逐漸增強，其中Foc TR4-Six1dHSPG 的熒光背景更加明亮。結(jié)果表明Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 菌株在液體培養(yǎng)過程中表達的EGFP綠色熒光蛋白不斷分泌到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)明顯的綠色熒光背景。Foc TR4-Six1dHSPG 的綠色熒光背景比Foc TR4-HSPG 的更加明亮，表明Foc TR4-Six1dHSPG 中的EGFP表達量更高，分泌到液體培養(yǎng)基中的EGFP 蛋白相應(yīng)更多。

2.4 液體培養(yǎng)基熒光強度的測定和分析

轉(zhuǎn)化菌株在培養(yǎng)過程中不斷分泌EGFP 蛋白到液體培養(yǎng)基中，影響培養(yǎng)基的熒光強度。因此，測定液體培養(yǎng)基的熒光強度可間接反映EGFP 表達量的差異，從而比較Six1d 啟動子與ToxA 啟動子驅(qū)動EGFP 表達的的活性強度差異。為此，進一步檢測了培養(yǎng)120 h 的不同菌株液體培養(yǎng)基熒光強度。結(jié)果顯示，F(xiàn)oc TR4 的液體培養(yǎng)基濾液熒光強度值為3059.25±49.04；Foc TR4-HSPG 的熒光強度值為84 560.25±1161.16，是Foc TR4 野生型菌株的27.6 倍；Foc TR4-Six1dHSPG 的熒光強度值為138 572.5±1987.32，是Foc TR4-HSPG菌株的1.6 倍（ 圖5） 。以上研究結(jié)果說明pSix1d74HSPG 載體中的Six1d 啟動子活性高于p74HSP-EGFP 載體中的ToxA 啟動子活性。

2.5 EGFP蛋白表達檢測和分析

采用本實驗室改進的蛋白提取方法[19]，提取上述菌液過濾后液體培養(yǎng)基中的總蛋白。利用Bradford 方法測定蛋白濃度后，取15 μg 總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（ 圖6 ） 。在p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 載體中，EGFP的N 端均加入了分泌信號肽序列，全長271 個氨基酸，分子量約為30.3 kDa。電泳結(jié)果顯示，F(xiàn)ocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 均有EGFP 蛋白的表達，分子量大小和預(yù)估的30.3 kDa 基本一致，而作為對照的Foc TR4 野生型菌株中沒有EGFP 蛋白的表達條帶（圖6A）。通過ImageJ軟件計算EGFP 蛋白條帶的灰度值，結(jié)果顯示，F(xiàn)oc TR4-HSPG 的EGFP 蛋白條帶灰度值為12 508.33±1063.94，F(xiàn)oc TR4-Six1dHSPG 的EGFP蛋白條帶灰度值為21 281.42±1868.97，是FocTR4-HSPG 的1.7 倍，與之相對應(yīng)的Foc TR4-Six1dHSPG 的EGFP 蛋白表達量也是FocTR4-HSPG 的1.7 倍（圖6B），該結(jié)果和菌液中熒光強度值的倍數(shù)差異相似。

隨后，通過Western blot 來直接檢測轉(zhuǎn)化菌株分泌蛋白中EGFP 蛋白的表達量，結(jié)果顯示，F(xiàn)ocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 均檢測到EGFP 蛋白的表達，而作為對照的Foc TR4 野生型菌株中沒有EGFP 蛋白的表達條帶（圖6C），這一結(jié)果與聚丙烯酰胺凝膠電泳的實驗結(jié)果相同。進一步通過ImageJ 軟件計算Western blot 膜上EGFP 蛋白表達條帶的灰度值，數(shù)據(jù)顯示FocTR4-HSPG 的EGFP 蛋白條帶灰度值為29 164.39±429.73，F(xiàn)oc TR4-Six1dHSPG 的EGFP 蛋白條帶灰度值為46 915.92±559.16，是Foc TR4-HSPG 的1.61 倍（圖6D），這一數(shù)據(jù)結(jié)果和菌液中熒光強度值的倍數(shù)差異也比較一致。上述EGFP 蛋白表達檢測和分析結(jié)果表明，pSix1d74HSPG 載體中的Six1d 啟動子與p74HSP-EGFP 載體中的ToxA 啟動子相比有更高的表達活性。

3 討論

香蕉枯萎病是危害香蕉產(chǎn)業(yè)的重要病害，通過對尖孢鐮刀菌致病機理以及香蕉的抗病機制等方面的研究，已分離鑒定出一批相關(guān)基因。利用植物病毒表達載體[24]，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達載體[25]和酵母表達載體系統(tǒng)[26]等可以鑒定基因的功能，但存在許多局限性，同時這些鑒定方法操作程序復(fù)雜，鑒定途徑為非直接方式，鑒定結(jié)果容易出錯等問題。

pCT74 是一種常用的真菌表達載體，攜帶潮霉素Hyg 抗性篩選標記，利用ToxA 啟動子可在多種絲狀真菌中高效表達綠色熒光蛋白，達到蛋白定位的目的，但只能在胞內(nèi)表達，無法真實反映一些特異目標蛋白的功能[17， 27]。因此，本研究團隊已在pCT74 載體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了攜帶分泌信號肽的真菌分泌表達載體p74HSP-EGFP，該載體可在真菌病原菌中表達攜帶的目的基因，并在侵染植物的過程中將目的蛋白分泌到植物體內(nèi)，實現(xiàn)蛋白功能的驗證[16]。相對于利用香蕉遺傳轉(zhuǎn)化體系驗證目標蛋白功能的傳統(tǒng)方法，利用真菌分泌表達載體的驗證方法具有用時短、可操作性強、直觀高效等優(yōu)點。

近年來許多研究表明，利用內(nèi)源啟動子表達外源基因往往具有更強的目的性，更高的表達效率。盧姍等[28]通過用馬爾尼菲青霉菌微管蛋白β亞基基因啟動子替換粗脈孢菌苯菌靈抗性基因啟動子，構(gòu)建了苯菌靈抗性基因表達盒，成功地運用于馬爾尼菲青霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究中。聶燕華等[29]克隆了銀耳芽孢內(nèi)源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， gpd）啟動子，與多功能纖維素基因（multi-functionalcellulose， mfc）連接并構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化銀耳芽孢后，酶活發(fā)酵試驗表明多功能纖維素酶的表達量提高了34.3%。真菌分泌表達載體p74HSPEGFP中的ToxA 啟動子來源于小麥黃斑病真菌（Pyrenophora tritici-repentis）[17]，雖然在大部分真菌，包括Foc 中都可以啟動基因的表達，但為了在Foc 中更高效地表達外源基因，F(xiàn)oc 自身的啟動子可能會更加適合。本研究團隊在前期對Foc1 的分泌蛋白質(zhì)組研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oc1 在單獨培養(yǎng)或與香蕉根共培養(yǎng)的過程中，Six1d 蛋白都能高效分泌表達[15]，因此本研究先克隆到Six1d基因的啟動子，并替換p74HSP-EGFP 中的ToxA啟動子，構(gòu)建能夠在尖孢鐮刀菌中更好表達目的基因的真菌分泌表達載體pSix1d74HSPG。

在基因工程中，啟動子的強度是決定外源蛋白表達的關(guān)鍵因素。啟動子的強度可以通過研究轉(zhuǎn)錄因子對其序列的結(jié)合親和力或評估啟動子驅(qū)動的基因的表達水平來確定[12]。本課題組研究的2 種轉(zhuǎn)化菌株攜帶的是真菌分泌表達載體，轉(zhuǎn)化菌株在培養(yǎng)過程中會在不斷表達外源基因的同時，將已合成的目的蛋白同步向細胞外分泌，不會造成細胞內(nèi)目的蛋白的過量積累，只會增加培養(yǎng)基中目的蛋白的總量。因此在一定的培養(yǎng)時間范圍內(nèi)，培養(yǎng)基中目的蛋白的總量和啟動子的活性呈現(xiàn)一定的線性相關(guān)。在本研究中，真菌分泌表達載體表達的EGFP 綠色熒光蛋白在培養(yǎng)過程中不斷分泌到液體培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中EGFP熒光蛋白總量的提高，逐步提高培養(yǎng)基的熒光背景，從而可以通過檢測培養(yǎng)基中EGFP 熒光強度的變化來判斷啟動子表達強度的差異。研究發(fā)現(xiàn)，真菌分泌表達載體p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG的Foc TR4 轉(zhuǎn)化菌株Foc TR4-HSPG 和FocTR4-Six1dHSPG 分別在KK 液體培養(yǎng)基（含潮霉素B 100 μg/mL）中振蕩培養(yǎng)24 h 后，就能觀察到少量的熒光背景，表明均有EGFP 蛋白的表達并分泌到培養(yǎng)基中。隨著培養(yǎng)時間的增加，觀察到的熒光背景也在逐步增強，并且Foc TR4-Six-1dHSPG 產(chǎn)生的熒光背景高于Foc TR4-HSPG。結(jié)合菌液過濾后上清液中的熒光強度以及EGFP 蛋白表達量的檢測數(shù)據(jù)，進一步證實Foc TR4-Six-1dHSPG 菌液中的EGFP 蛋白表達量是Foc TR4-HSPG 的1.6～1.7 倍。

以上研究結(jié)果表明，新構(gòu)建的真菌分泌表達載體pSix1d74HSPG 中的Six1d 內(nèi)源啟動子擁有完整的啟動子功能，表達強度顯著高于p74HSPEGFP載體中的ToxA 啟動子，具有明顯的內(nèi)源表達優(yōu)勢，達到ToxA 啟動子的1.6～1.7 倍。pSix1d74-HSPG 載體完全能夠代替原來的p74HSP-EGFP 載體，可以在Foc 中更高效表達并分泌目的蛋白，從而為香蕉枯萎病抗感病分子機理研究提供重要的實驗工具。