非侵入物理療法
——紅光照射改善脂多糖誘發(fā)小鼠抑郁樣行為*

趙丹睿 張鳳吉 劉懿瑩 吳一箐 趙夯 廖?？?潘文浩 程建華* 童志前*

（溫州醫(yī)科大學精神醫(yī)學學院，老年研究院，附屬第一醫(yī)院，浙江省阿爾茨海默病研究重點實驗室，甌江實驗室，溫州 325035）

抑郁癥是一種臨床癥狀表現(xiàn)為情緒低落［1］、快感缺失的常見情感障礙類疾?。?］。2020年全球重度抑郁癥患者約為1.93億人，受新冠疫情影響全球預計新增5 300萬重度抑郁癥患者［3］。中國重度抑郁癥的終身患病率達3.3%［4］。抑郁的發(fā)生有多種學說?；凇皢伟芳僬f”的5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取抑制劑是臨床使用最廣泛的抗抑郁藥物［5］，然而單胺假說無法解釋藥物作用潛伏期的出現(xiàn)［6］。臨床一線抗抑郁藥物的治療無效率也達33%~66%［7］；同時還出現(xiàn)藥物抵抗、性功能障礙、低鈉血癥等副作用［8］。近幾十年來，炎癥反應(yīng)被認為是重度抑郁發(fā)生的關(guān)鍵原因［9］。越來越多的證據(jù)表明，外周炎癥因子，如IL-1β與IL-6，可穿過血腦屏障［10］，從而誘發(fā)抑郁［11-12］。

低濃度氣態(tài)甲醛重復暴露誘發(fā)小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為［13］；液態(tài)甲醛注射的小鼠也出現(xiàn)抑郁及焦慮樣行為［13］。以上研究表明，甲醛可誘發(fā)小鼠抑郁樣行為。離體實驗顯示甲醛可直接刺激免疫細胞釋放大量的炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α［14］。以上研究說明，甲醛參與炎癥因子的生成。目前，注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）被廣泛用來構(gòu)建抑郁模型［15］，外周腹腔注射LPS具有操作便捷、安全性較高，且可產(chǎn)生中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的優(yōu)勢。但單次注射LPS誘發(fā)的抑郁樣行為僅持續(xù)24 h左右［16］，而重復多次注射LPS可制備出慢性抑郁小鼠模型，癥狀持續(xù)較為持久［17］，且該模型與臨床抑郁患者的癥狀更為相似。雖然外周注射LPS誘發(fā)慢性抑郁的機制不清，但研究表明LPS可上調(diào)血液中的氨基脲敏感胺氧化酶（semicarbazidesensitive amine oxidase，SSAO，一種甲醛生成酶）的活力［18］。這提示，LPS可能激活SSAO產(chǎn)生甲醛，而甲醛直接刺激炎癥因子釋放，誘發(fā)抑郁。

近20年來，光生物調(diào)節(jié)作用（photobiomodulation，PBM）療法逐步被用于臨床治療抑郁等心理疾病［19］。如紅光（red light，RL）/近外紅光（near-infrared，NIR）具有抗炎作用［20］，可減少小鼠抑郁樣行為［20-21］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，630 nm紅光照射作為一種非侵入性手段，可以有效激活甲醛脫氫酶（formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)DH），并消除小鼠腦中蓄積的甲醛［22］。基礎(chǔ)和臨床結(jié)果都顯示，紅光具有良好的穿透性，紅光照射未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，是一種潛在的臨床治療抑郁的方法。

基于上述研究結(jié)果，本實驗探索甲醛是否是LPS誘發(fā)抑郁發(fā)生的關(guān)鍵觸發(fā)因子，630 nm紅光療法是否對慢性抑郁模型小鼠的抑郁樣行為具有改善效應(yīng)，從而為臨床使用紅光療法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性C57BL/6J小鼠，9周齡，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級。動物進入動物房后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分籠喂養(yǎng)，每籠4只，室內(nèi)溫度為（25±2）℃，12 h光照周期，照明時間模擬白晝（每日7:30~19:30），每周兩次更換墊料，并及時予以充足的飼料及水。全部實驗根據(jù)溫州醫(yī)科大學倫理委員會指導原則進行，倫理批號：xmsq20022-1135。

1.2 實驗試劑與耗材

1.2.1 實驗試劑

Mouse IL-1β ELISA Kit，碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：PI301。Rabbit Mouse IL-6 ELISA Kit，碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號PI326。Mouse TNF-α ELISA Kit，碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號PT512。小鼠氨基脲敏感胺氧化酶（SSAO）酶聯(lián)試劑盒/Mouse SSAO ELISA kit，北京奇松生物科技有限公司，貨號：QS451642-96T。Mouse IL-1β ELISA Kit，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-EL-M0037c。Mouse TNF-α ELISA Kit，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-EL-M3063。LPS（reagent grade），碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號ST1470。Na-FA熒光探針，濟南大學生物醫(yī)學成像中心贈送。甲醛，美國 Thermo Fisher Scientific公司，貨號F1635。DMSO，北京索萊寶科技有限公司，貨號D8731。

1.2.2 實驗耗材

一次性丁腈手套，Biosharp，貨號BC010-L。1.5 ml EP管，Labselect，貨號MCT-001-150。15 ml離心管，Labselect，貨號CT-002-15A。30 ml離心管，Labselect，貨號CT-002-50A。200 μl黃色袋裝吸頭，Biosharp，貨號BS-200-T。1 000 μl藍色袋裝吸頭，Biosharp，貨號BS-1000-T。

1.3 實驗儀器與設(shè)備

移液槍，德國 Eppendorf公司，型號31110008。酶標儀，美國 Molecular DEVICES公司，型號Spectra Max i3x。多功能酶標儀，美國BioTek公司，型號Synergy Neo2。超低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號905。渦旋振蕩器，海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號VORTEX-5。凈化工作臺，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司，型號SW-CJ-2FD。微量高速冷凍離心機，瑞沃德生命科技有限公司，型號M1324R。超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司，型號SCIENTZ-IID。紅光治療儀（專利號：ZL 2015 1 0354267.5.）［22］。小動物活體光學成像，PerkinElmer，型號IVIS Spectrum。

1.4 小鼠分組

將雄性C57BL/6J小鼠隨機分為3組：a. 溶劑對照組（Con組，僅腹腔注射PBS）；b. LPS組，按濃度梯度進行腹腔注射LPS；c. 630 nm紅光治療組，與LPS相同模式建立抑郁模型，并在LPS注射1周后使用630 nm LED-RL（0.5 mW/cm2）照射，每周持續(xù)5 d，每次30 min，與下一周照射之間間隔2 d。每組12只，分3籠飼養(yǎng)，每籠4只標尾并記錄。腹腔注射時間均為早上9點，紅光治療時間為腹腔注射后4 h，即當天的下午1點。每周最后一天進行行為學評估，實驗共進行4周。

1.5 LPS誘導慢性抑郁模型的構(gòu)建

LPS腹腔注射是構(gòu)建抑郁樣模型的常見方法之一，具有操作簡單快捷、致死率低等優(yōu)勢。外周注射LPS可參與中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)，由外周炎癥導致中樞神經(jīng)炎癥的發(fā)生以誘導抑郁模型的建立，符合由外周炎癥誘發(fā)抑郁的臨床疾病特征。由于單次注射LPS后，小鼠可出現(xiàn)急性抑郁樣行為，在24 h左右出現(xiàn)頂峰，后逐漸消退［16］，同時為避免LPS引發(fā)的敗血癥等不良反應(yīng)以及小鼠對相同濃度LPS產(chǎn)生耐受性［23］，本實驗采用重復多次注射濃度梯度LPS的方式來構(gòu)建持續(xù)慢性LPS抑郁模型［17］。實驗共注射4周LPS。前2周每周的第3~5天連續(xù)注射3 d（0.208/0.415/0.83 mg/kg），與下一周注射之間間隔4 d；后2周每周的第3~6天連續(xù)注射4 d（0.208/0.415/0.83/0.83 mg/kg），與下一周注射之間間隔3 d。

1.6 抑郁樣行為學評價

1.6.1 糖水偏愛實驗（sucrose preference test，SPT）

糖水偏愛實驗可以客觀反映抑郁癥動物快感缺失表現(xiàn)［13］。造模前給小鼠雙瓶供水24 h（1%濃度葡萄糖150 ml與清水150 ml），12 h時將清水與1%葡萄糖溶液交換位置以消除小鼠對于瓶子位置的偏愛。禁水禁食24 h后再度給予水150 ml與1%濃度葡萄糖150 ml并持續(xù)24 h。24 h糖水偏愛實驗前后雙瓶分別稱重并計算糖水偏愛系數(shù)，糖水偏愛系數(shù)為糖水攝入量/（糖水攝入量+清水攝入量）×100%。

1.6.2 曠場實驗（open field test，OFT）

曠場實驗是檢測小鼠自發(fā)活動行為的經(jīng)典行為學實驗［13］。實驗裝置為小鼠曠場反應(yīng)箱規(guī)格為50 cm×50 cm×40 cm（長×寬×高），利用行為學軟件框出中間區(qū)域，小鼠可在箱內(nèi)自由活動。實驗時，開啟攝像，將小鼠按同一個方向置于曠場箱底部中央?yún)^(qū)域，使其適應(yīng)1 min后正式記錄軌跡5 min，進入中間區(qū)域、中心區(qū)停留時間等數(shù)據(jù)均由軟件設(shè)置。對下一只小鼠進行實驗前，先去除排泄物，用75%酒精擦拭裝置箱，再以干凈紙巾擦干，避免實驗裝置內(nèi)原有動物氣味對實驗結(jié)果的干擾。

1.6.3 強迫游泳測試（forced swimming test，F(xiàn)ST）

強迫游泳實驗是有效評估小鼠絕望行為的行為學檢測方法［13］。準備高50 cm、直徑20 cm的圓柱形玻璃水箱，注水至小鼠在游泳期間無法用腳或尾巴接觸水箱底部且確保老鼠不能逃脫的高度。溫度計測量水溫（23~25°C），使用淺色分隔板分離各個水箱以確保小鼠之間無法互相觀望。實驗持續(xù)時間6 min，記錄后4 min小鼠在水中總不動時間。實驗結(jié)束后立即取出小鼠放在吸水紙上吸干后放回鼠籠。

1.6.4 懸尾實驗（tail suspension test，TST）

懸尾實驗是有效評估小鼠絕望行為的行為學檢測方法［13］。實驗開始前先在小鼠尾巴距尾尖2 cm處（防止小鼠順膠布攀爬）粘一條膠布，用架子夾住膠布，并懸掛至距桌面30 cm高處，開啟行為學檢測軟件并攝像記錄，總懸掛時間為6 min，記錄后4 min內(nèi)累計不動時間（不動狀態(tài)即小鼠停止掙扎不動或無任何活動）。實驗完成后仔細清理懸尾箱，并用75%的酒精來擦拭懸尾箱底及內(nèi)壁，避免遺留氣味對下次實驗產(chǎn)生影響。

1.7 甲醛檢測及甲醛相關(guān)酶檢測

1.7.1 整腦甲醛熒光成像

小鼠腹腔內(nèi)注射5 μmol/L的Na-FA（甲醛熒光探針），30 min后用1.25%三溴乙醇溶液麻醉，將小鼠頸椎脫臼處死，取出腦組織，PBS沖洗表面血液及雜質(zhì)。將同組的腦組織置于同一玻璃器皿中，不同組之間進行區(qū)分標記，吸干腦組織周圍水分后放入成像暗箱平臺。以上步驟均在冰上避光操作。選擇激發(fā)和發(fā)射濾片（λex/λem=430 nm/540 nm），調(diào)整軟件進行成像［22］。

1.7.2 血液與腦組織內(nèi)甲醛定量檢測（Na-FA熒光定量法）

a. 樣本制備

第2、3、4周行為學檢測結(jié)束后12 h將每組3~6只小鼠稱重，根據(jù)小鼠體重腹腔注射對應(yīng)體積的3%三溴乙醇麻醉液（0.1 ml，5 g）。待小鼠肌肉松弛、反射消失后，剪去胡須及眼周毛發(fā)眼球取血，將血液收集到EP管中，冰上快速剝離腦組織，取出皮層、海馬、中腦備用。組織樣本保存于-80℃低溫冰箱。小鼠腦組織稱重后，按1∶9的比例加入PBS，并用超聲波破碎儀破碎至勻漿至無明顯塊狀組織為止，在此期間設(shè)置低溫高速離心機，使其預冷至4℃后將組織勻漿離心（12 000 r/min×30 min）后取上清，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中。

b. 操作步驟

使用黑色96孔板，每空分別加入40 μl小鼠組織樣本或甲醛標準品、120 μl PBS、40 μl Na-FA工作液。在室溫環(huán)境中孵育30 min后檢測熒光強度（λex/λem=440 nm/543 nm）。根據(jù)甲醛標準品熒光強度繪制標準曲線，并計算小鼠組織樣本甲醛濃度［22］。

1.7.3 血清SSAO檢測

根據(jù)SSAO試劑盒說明書進行。標準品和樣本孔中每孔50 μl標準品或待檢樣品，后依次按照說明加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μl、底物50 μl、終止液50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的吸光度（A）值。繪制標準曲線，按照曲線方程計算各樣本中SSAO的濃度。

1.8 小鼠腦組織相關(guān)炎癥因子檢測

1.8.1 腦組織IL-1β活性檢測

根據(jù)Mouse IL-1β ELISA Kit說明書進行。小鼠大腦皮層樣本以原液作為樣品進行檢驗；海馬樣本用樣品分析緩沖液1∶1稀釋，并用標準平稀釋液補至200 μl，即50 μl原液加入50 μl樣品分析緩沖液，后加入100 μl標準瓶稀釋液體；中腦樣本以樣品分析緩沖液1∶1稀釋。每孔依次按說明加入樣品或不同濃度的標準品（100 μl/孔）、生物素化抗體100 μl/孔、辣根過氧化物酶（100 μl/孔）、顯色劑TMB溶液（100 μl/孔）、終止液（50 μl/孔），每次加入前均洗板5次。最后用酶標儀測定450 nm波長處的A值，繪制標準曲線，根據(jù)公式計算待測樣本中的IL-1β活性。

1.8.2 腦組織TNF-α活性檢測

根據(jù)Mouse TNF-α ELISA Kit說明書進行。實驗操作同上。

1.9 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組之間數(shù)據(jù)采用t檢驗分析多組之間比較采用One-way ANOVA分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS注射第一周誘發(fā)抑郁樣行為并伴隨腦甲醛蓄積和炎癥反應(yīng)

實驗流程見圖1a。實驗結(jié)果顯示，注射LPS 1 h后，小鼠腦部甲醛即整體升高（圖1b），一周后行為學結(jié)果表明LPS實驗組小鼠即出現(xiàn)抑郁樣行為：LPS組小鼠曠場實驗中總運動距離、中心區(qū)運動距離顯著減少（圖1c，d），懸尾不動時間無顯著差異（圖1e），強迫游泳不動時間顯著增加（圖1f），糖水偏好系數(shù)顯著降低（圖1g）。

注射LPS 1周后，皮層甲醛含量無明顯變化（圖1h），海馬、中腦中的甲醛含量均顯著上升（圖1i，j）。第1周LPS組血液中SSAO含量較Con組顯著上升（圖1k）。ELISA檢測結(jié)果顯示，皮層、海馬、中腦中TNF-α因子也均較Con組顯著上升（圖1l~n），IL-6在中腦中顯著上升（圖1o）。

以上結(jié)果表明，LPS一周即誘發(fā)腦部特別是中腦甲醛蓄積、炎癥因子增加，并出現(xiàn)抑郁樣行為。

2.2 630 nm紅光照射改善第二、三周LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、甲醛蓄積、抑郁樣行為

每周各組藥物及紅光治療方案見圖2a，實驗開始第二周起，每周第2~6天進行紅光照射治療，每周間隔2 d。實驗結(jié)果顯示，注射LPS兩周后，較Con組，LPS組小鼠曠場實驗中總運動距離、中心區(qū)運動時間顯著降低（圖2b，c）。較LPS組，紅光治療組小鼠曠場實驗中總運動距離、中心區(qū)運動時間均顯著升高（圖2b，c）。較Con組，LPS組懸尾不動時間無明顯變化，強迫游泳實驗不動時間顯著增長；較LPS組，紅光治療組懸尾實驗、強迫游泳實驗中總不動時間顯著減少（圖2d，e）。小鼠運動路線圖見圖2f。

注射LPS 3周后，較Con組，LPS組小鼠曠場實驗中總運動距離、中心區(qū)運動距離顯著減少。較LPS組，紅光治療組總運動距離顯著增加，中心區(qū)運動距離無顯著變化（圖2g，h）。較Con組，LPS組懸尾不動時間顯著增加，強迫游泳不動時間無顯著差異；較LPS組，紅光治療組懸尾不動時間顯著減少（圖2i），強迫游泳不動時間無顯著差異（圖2j）。小鼠運動路線圖見圖2k。較Con組，LPS組糖水偏好系數(shù)顯著降低，紅光治療組則無顯著差異（圖2l）。

中腦甲醛檢測中，第2周LPS組中腦甲醛顯著低于Con組，紅光治療組中腦甲醛則無明顯差異（圖2m）。第3周的甲醛相關(guān)檢測中，LPS組小鼠中腦甲醛含量較Con組顯著上升（圖2n）。

以上結(jié)果表明，重復濃度梯度注射LPS小鼠持續(xù)表現(xiàn)抑郁樣行為，中腦甲醛發(fā)生波動變化并最終蓄積，紅光照射則顯著改善小鼠抑郁樣行為，維持中腦甲醛正常代謝。

Fig. 1 LPS-injected mice showed formaldehyde (FA) accumulation, inflammation reaction, and depressive-like behaviors in the first week

Fig. 2 Red light treatment alleviated the depressive behaviors in LPS-injected mice in 2nd and 3rd week

Fig. 3 Red light treatment inhibited neuroinflammation and alleviated depressive behaviors in LPS-injected mice in the 4th week by scavenging FA in the hippocampus and midbrain

Fig. 4 The correlation between the levels of IL-1β, TNF-α, or FA and indexes of depressive-like behaviors

Fig. 5 Mechanism of red light-alleviated depression-like behaviors in LPS-induced chronic depression model mice by scavenging midbrain FA levels

2.3 630 nm紅光照射改善第四周LPS誘發(fā)炎癥反應(yīng)、甲醛蓄積、抑郁樣行為

第4周行為學檢測表明，較Con組，LPS組小鼠曠場實驗中總運動距離、中心區(qū)運動距離顯著降低。較LPS組，紅光治療組總運動距離、中心區(qū)運動距離均無顯著差異（圖3a，b）。小鼠運動軌跡見圖3c。較Con組，LPS組懸尾實驗、強迫游泳不動時間顯著增加；紅光治療組懸尾、強迫游泳不動時間較LPS組顯著減少（圖3d，e）。

注射LPS 4周后，甲醛相關(guān)檢測中，LPS組小鼠海馬甲醛含量呈上升趨勢，中腦甲醛含量較Con組顯著上升，紅光治療組小鼠較LPS組在海馬、中腦中甲醛含量均顯著下降（圖3f，g）。

LPS組小鼠血液中SSAO含量顯著下降，紅光治療組較LPS則無顯著差異（圖3h）。

ELISA檢測結(jié)果顯示，LPS組小鼠海馬IL-1β顯著升高，紅光治療組小鼠則較LPS組顯著下降（圖3i）。較Con組，LPS組中腦IL-1β、TNF-α、IL-6因子均顯著上升；較LPS組，紅光治療組中腦中IL-1β、TNF-α因子均較LPS組顯著下降（圖3j~l）。

以上結(jié)果表明，第4周LPS注射小鼠持續(xù)表現(xiàn)抑郁樣行為，紅光治療顯著消除中腦甲醛蓄積，并抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生，改善小鼠抑郁樣行為。

2.4 LPS誘發(fā)蓄積的甲醛和炎癥因子、抑郁樣行為正相關(guān)

對甲醛與TNF-α、IL-1β進行回歸分析發(fā)現(xiàn)，中腦甲醛含量與TNF-α、IL-1β水平正相關(guān)（圖4a，b），這提示了中腦甲醛蓄積與神經(jīng)炎癥發(fā)生高度相關(guān)。中腦甲醛含量與小鼠曠場實驗中心區(qū)運動距離（圖4c）、懸尾實驗不動時間（圖4d）負相關(guān)，這提示了中腦甲醛蓄積與小鼠抑郁樣行為高度相關(guān)。同時，中腦IL-1β水平與小鼠曠場中心區(qū)運動距離也成負相關(guān)（圖4e），這提示了中腦炎癥反應(yīng)水平與小鼠抑郁樣行為高度相關(guān)。對中腦甲醛含量的進一步分析中，在LPS重復注射的1~4周內(nèi)，LPS組中腦甲醛含量在第1周急性升高，并在第3、4周蓄積；紅光治療組中腦甲醛含量則均與Con無明顯差異（圖4f）。

以上結(jié)果提示，在LPS誘導的小鼠慢性抑郁模型中，中腦內(nèi)源甲醛蓄積是抑郁發(fā)生的促發(fā)因素，誘導神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生并導致小鼠抑郁樣行為。

3 討論

本實驗主要聚焦兩個尚未闡明的問題：一是甲醛與SSAO在小鼠慢性抑郁模型中的變化及作用機制；二是630 nm紅光是否通過清除甲醛蓄積改善抑郁樣行為。結(jié)果表明，LPS通過激活SSAO急性生成大量甲醛，并主要蓄積于中腦，急性升高的內(nèi)源甲醛激活腦膠質(zhì)細胞等生成IL-1β、TNF-α等炎癥因子，產(chǎn)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)并導致抑郁樣行為的發(fā)生，630 nm紅光照射則通過激活FDH清除急性升高的甲醛，穩(wěn)定內(nèi)源甲醛代謝，抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生，改善抑郁癥狀（圖5）。這提示蓄積的腦內(nèi)源甲醛可能是治療抑郁的新靶點，消除腦內(nèi)源甲醛可減輕其產(chǎn)生的一系列神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)，而納米紅光可清除甲醛蓄積，對抑郁具有改善作用。

3.1 甲醛可能是觸發(fā)抑郁發(fā)生的關(guān)鍵分子

現(xiàn)有的抑郁癥的相關(guān)研究并未過多關(guān)注SSAO以及甲醛的變化。研究表明，腹腔注射的LPS僅有極少量能夠穿透血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）［24］，重復多次外周注射LPS即使破壞BBB，也并不會增加對中樞對LPS的攝取。這說明外周注射的LPS并不直接在腦區(qū)內(nèi)發(fā)揮作用來誘發(fā)抑郁行為。進一步分子機制研究發(fā)現(xiàn)，外周注射LPS主要引起腦毛細血管后小靜脈因SSAO/血管黏附分子1（VAP-1）導致的中性粒細胞的黏附，而中性粒細胞并未進入腦實質(zhì)［25-26］。而大量證據(jù)表明外周注射LPS后激活了大腦免疫反應(yīng)［27-28］，誘導IL-1β、TNF-α等細胞因子在腦中的表達［29］?，F(xiàn)有研究表明，LPS誘導的中樞神經(jīng)炎癥與外周炎癥機制不同，SSAO可能在LPS誘導的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用，且神經(jīng)炎癥的發(fā)生可能與SSAO的脫氨基產(chǎn)物甲醛［30］有關(guān)。而LPS可誘導SSAO活性上升，其分解單胺等底物產(chǎn)生的甲醛等產(chǎn)物水平急劇上升［18］。SSAO分解內(nèi)源甲胺脫氨基生成甲醛，是內(nèi)源甲醛的重要來源，同時生成過氧化氫、一氧化氮（NO）等產(chǎn)物［31］，作為一種生理性小分子物質(zhì)［32］，甲醛可穿過BBB［33］，并在腦區(qū)參與神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激［14，34］等反應(yīng)，從而影響認知及空間記憶。本實驗發(fā)現(xiàn)整腦甲醛熒光成像顯示注射LPS 1 h后中腦內(nèi)甲醛含量顯著上升（圖1b），且甲醛與炎癥因子的回歸分析（圖4a，b）顯示中腦甲醛含量與炎癥因子濃度呈正相關(guān)，均支持了上述觀點。另外，甲醛暴露不僅將增強小鼠前額葉皮層的氧化應(yīng)激，誘導IL-17、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生，進而促進小鼠大腦的神經(jīng)炎癥［35］，LPS注射且甲醛暴露小鼠的巨噬細胞模型中促炎細胞因子釋放增加、NO分泌升高［14］，均證實過量甲醛對于腦膠質(zhì)細胞的刺激不但可促進炎癥因子的釋放，還消除IL-1β的神經(jīng)保護作用，進而加劇神經(jīng)炎癥的發(fā)生。本實驗的實驗結(jié)果證實，中腦中甲醛含量與IL-1β、TNF-α水平呈正相關(guān)，內(nèi)源甲醛蓄積參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

3.2 慢性抑郁小鼠血漿SSAO的變化

本實驗對血清SSAO酶的檢測中，雖然第1周LPS組SSAO含量顯著上升，但在第4周的血漿SSAO含量檢測中，發(fā)現(xiàn)LPS組血漿SSAO含量較Con組顯著下降。同時，臨床研究也發(fā)現(xiàn)抑郁患者血清SSAO活性的檢測中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過治療干預的重度抑郁患者SSAO活性顯著降低［36］，在大鼠急慢性炎癥模型中同樣發(fā)現(xiàn)了SSAO活性的下降［37］。由于SSAO此前并未在抑郁癥、神經(jīng)炎癥等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，因此相關(guān)機制并不明了。目前可能針對抑郁及炎癥模型中SSAO活性及含量降低可能的解釋有：a. SSAO活性下降是對單胺含量下降的適應(yīng)性結(jié)果［36］；b. SSAO在炎癥發(fā)生早期發(fā)揮作用，而隨著膜結(jié)合形式的VAP-1在介導中性粒細胞外滲后失活或脫落［37］。然而由于缺乏相關(guān)實驗支持，上述假說仍無從證實?？梢钥隙ǖ氖?，大量研究表明，在炎癥早期SSAO/VAP-1在外周炎癥部位被激活［38］，并介導中性粒細胞的黏附、外滲，在側(cè)腦室注射LPS誘發(fā)的神經(jīng)炎癥中，腦后微血管SSAO/VAP-1同樣被激活［18，25］。本實驗中整腦甲醛熒光成像同樣表明，在實驗組注射LPS 1 h及1周后，整腦中，作為SSAO代謝產(chǎn)物之一的甲醛含量上升，佐證了LPS單次注射后SSAO活性急性上升，并參與LPS誘導的神經(jīng)性炎癥的觀點［39］。并且它的產(chǎn)物——甲醛是誘發(fā)炎癥因子上升的觸發(fā)因素。

3.3 炎癥因子參與抑郁機制的多條通路

近來，神經(jīng)炎癥被認為是抑郁癥的特征性反應(yīng)之一［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子激活的犬尿氨酸通路對5-HT、下丘腦-垂體-腎上腺素（hypothalamus-pituitary-adrenocortical，HPA）軸活性、海馬神經(jīng)發(fā)生的影響［40］。一方面，TNF-α通過激活吲哚胺2,3-雙加氧酶，分解生成5-HT的底物色氨酸代謝為犬尿氨酸［41］，從而減少5-HT生成，表現(xiàn)抑郁癥狀［42］。另一方面，炎癥因子已被證實可直接刺激位于中腦的下丘腦，并過度激活HPA軸，促進糖皮質(zhì)激素的大量釋放［43］，IL-1β可誘導促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的過度釋放從而促進糖皮質(zhì)激素受體抵抗［12］，進而損害HPA軸的負反饋調(diào)節(jié)。同時糖皮質(zhì)激素的促炎特性也得到越來越多證據(jù)的支持［44］。本實驗證實，中腦、海馬甲醛蓄積導致TNF-α、IL-1β、IL-6的上升，參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

3.4 630 nm紅光調(diào)節(jié)甲醛代謝抑制神經(jīng)炎癥

630 nm紅光照射作為一種新型PBM治療方法已經(jīng)被用于挽救認知與記憶［22，45］。前期研究已表明，使用波長630 nm的LED-RL（0.5 mW/cm2）能穿透小鼠的頭骨和腹部，其中顱骨的穿透率是49%，腹部的穿透率為43%，且無明顯熱效應(yīng)［22］。目前PBM治療抑郁的最佳參數(shù)尚未明確，雖然近外紅光顯示有更強的穿透力，但其對大腦的熱效應(yīng)明顯，不利于臨床治療使用［46］。另外，近紅外光的臨床試驗中，有頭痛、眼疲勞、睡眠不安和失眠等不良反應(yīng)的發(fā)生［47］。

現(xiàn)有對紅光治療抑郁的研究，主要是其對線粒體電子傳遞鏈的末端酶細胞色素c的影響。紅光可通過提高細胞色素c的活性，促使NO從雙核中心解離，增加線粒體膜電位，進而促進ATP的釋放，增強神經(jīng)保護和代謝能力［20］。本研究主要探究紅光激活甲醛脫氫酶，降解甲醛，減輕神經(jīng)炎癥的通路。在本研究中630 nm紅光改善小鼠抑郁樣行為的機制主要表現(xiàn)在兩個方面。一是，630 nm紅光照射直接激活FDH及時清除急性上升的甲醛［22］。本實驗治療組結(jié)果表明，激活FDH不僅在抑郁癥病程早期避免了高濃度甲醛的蓄積，避免參與誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)、影響神經(jīng)細胞代謝產(chǎn)生神經(jīng)毒性，同時也改善了抑郁癥病程后期因LPS重復注射導致甲醛反復升高而造成的腦部甲醛異常蓄積的狀況。二是，630 nm紅光照射激活細胞色素c［19］，挽救了因內(nèi)源甲醛被神經(jīng)元細胞分解代謝而產(chǎn)生的甲酸鹽對細胞色素c的抑制作用［48］，避免糖酵解持續(xù)升高導致的神經(jīng)細胞毒性［49］。本研究發(fā)現(xiàn)630 nm紅光治療照射1周后即改善小鼠抑郁樣行為，因此在抑郁癥早期干預中可能更具有重要的臨床應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

單次LPS外周腹腔注射激活SSAO導致小鼠腦部甲醛急性上升，重復多次LPS外周注射導致小鼠中腦、海馬甲醛蓄積，甲醛作為抑郁發(fā)生的促發(fā)因素參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)、產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導致小鼠抑郁樣行為。630 nm紅光照射消除甲醛蓄積，并抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善小鼠抑郁樣行為。因此，紅光療法，一種無創(chuàng)物理療法，有可能成為臨床抑郁干預的新策略。