嵌合抗原受體巨噬細(xì)胞免疫療法及其在實(shí)體瘤治療中的應(yīng)用*

楊艷 甘妮翠 彭寧馨 張嵐萱 張繼虹 李錦媛**

（1）昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500；2）云南省第一人民醫(yī)院普外一科，昆明 650032）

隨著腫瘤免疫療法研究的逐漸深入，以過(guò)繼性嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法、免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的多種免疫治療策略相繼被開(kāi)發(fā)并進(jìn)入臨床應(yīng)用［1］。然而當(dāng)前的免疫療法主要針對(duì)適應(yīng)性免疫，CAR-T在實(shí)體瘤中浸潤(rùn)不足，療效并不理想［2-3］。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)先天免疫細(xì)胞也確實(shí)具有發(fā)揮抗腫瘤活性的潛力［4］。巨噬細(xì)胞是實(shí)體腫瘤微環(huán)境中主要的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞，可吞噬腫瘤細(xì)胞，并將腫瘤抗原呈遞給T細(xì)胞進(jìn)而啟動(dòng)腫瘤特異性免疫應(yīng)答［5-6］。因此，改造巨噬細(xì)胞成為嵌合抗原受體巨噬細(xì)胞（chimeric antigen receptor macrophage，CAR-M）代表了一種新型抗腫瘤固有免疫療法，可與放療或者針對(duì)適應(yīng)性免疫的治療方法協(xié)同作用，發(fā)揮更強(qiáng)勁的抗腫瘤免疫作用。本文主要介紹CAR-M的發(fā)展歷程、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和臨床試驗(yàn)相關(guān)研究進(jìn)展，以期為其未來(lái)的臨床應(yīng)用提供參考。

1 嵌合抗原受體（CAR）修飾的免疫細(xì)胞用于腫瘤免疫治療

21世紀(jì)初，靶向T細(xì)胞活化的相關(guān)免疫療法就已啟動(dòng)，CAR-T細(xì)胞是通過(guò)基因工程技術(shù)制備的抗原受體T細(xì)胞，可與腫瘤細(xì)胞表面的抗原特異性結(jié)合，具有效應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體（T cell receptor ，TCR）特異性和非主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性抗腫瘤活性的特點(diǎn)。CAR的主要結(jié)構(gòu)涉及識(shí)別抗原的單鏈抗體可變區(qū)片段（single chain antibody variable fragments，scFvs）、跨膜區(qū)、TCR β鏈CD3ζ（T細(xì)胞活化第一信號(hào)）和協(xié)同刺激信號(hào)結(jié)構(gòu)域（T細(xì)胞活化第二信號(hào)）（圖1）［7-8］。 雖然CAR-T細(xì)胞治療血液腫瘤的臨床效果良好，但由于實(shí)體腫瘤細(xì)胞中抗原缺失、缺乏特異抗原以及免疫抑制腫瘤微環(huán)境等原因，其對(duì)實(shí)體瘤的治療效果并不理想。同時(shí)在臨床上還發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞療法會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）、神經(jīng)方面的相關(guān)不良反應(yīng)［3］。由此在完善CAR-T免疫療法的同時(shí)，拓寬CAR策略也非常必要。目前CAR策略已經(jīng)用于修飾自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NK）、γδT細(xì)胞（gammadelta T cells ，γδT）、自然殺傷性T細(xì)胞（natural killer T cells，NKT）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）等免疫細(xì)胞，研究表明通過(guò)對(duì)以上免疫細(xì)胞進(jìn)行CAR修飾對(duì)腫瘤免疫治療具有積極作用［9-13］。

Fig. 1 Structure display of CAR-M圖1 CAR-M結(jié)構(gòu)示意圖

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子、酶類(lèi)以及胞外基質(zhì)共同組成［14］。大量活化的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤間質(zhì)，被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM），在大多數(shù)實(shí)體腫瘤的TME中占比達(dá)50%［15-16］。除此之外，巨噬細(xì)胞還能夠分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），從而破環(huán)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)層進(jìn)入到腫瘤內(nèi)部發(fā)揮作用［17-18］。巨噬細(xì)胞的這一特質(zhì)推動(dòng)了利用巨噬細(xì)胞治療腫瘤的研究。然而研究人員發(fā)現(xiàn)，直接進(jìn)行巨噬細(xì)胞移植治療效果甚微［19-21］。其主要問(wèn)題在于，TME能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為替代活化型 （M2表型），M2型巨噬細(xì)胞能通過(guò)分泌多種活性物質(zhì)促進(jìn)血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、免疫抑制、免疫逃逸和耐藥性等［22-23］。研究證明，被極化為M2表型的巨噬細(xì)胞可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)為M1表型［24］。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)炎癥細(xì)胞因子，具有較強(qiáng)的抗微生物和抗腫瘤活性。由此，逆轉(zhuǎn)M2表型在腫瘤治療中具有重要意義。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)TME中的巨噬細(xì)胞需要額外的信號(hào)來(lái)引導(dǎo)其對(duì)抗腫瘤［25］。研究人員從CAR-T的成功中獲得啟示，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段促使巨噬細(xì)胞表達(dá)靶向特定腫瘤抗原的CAR轉(zhuǎn)變?yōu)镃AR-M，從而增強(qiáng)或激活其對(duì)目標(biāo)腫瘤細(xì)胞的吞噬殺傷作用［26］。由于巨噬細(xì)胞在TME中大量存在，且能夠進(jìn)入腫瘤內(nèi)部發(fā)揮作用，因此CAR-M也成為針對(duì)實(shí)體腫瘤最有希望的臨床免疫療法之一。

2 CAR-M的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

最初，CAR的原始結(jié)構(gòu)是為T(mén)細(xì)胞設(shè)計(jì)的，沒(méi)有專(zhuān)門(mén)為巨噬細(xì)胞設(shè)計(jì)的CAR結(jié)構(gòu)。CAR-M結(jié)構(gòu)參照CAR-T進(jìn)行設(shè)計(jì)，主要由識(shí)別特定腫瘤抗原的細(xì)胞外信號(hào)域、跨膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成（圖1）。后續(xù)在CAR-NK相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，CAR結(jié)合表位的位置及其與細(xì)胞表面的距離可影響抗原結(jié)合和細(xì)胞活化［27］。第一代CAR-M主要對(duì)CAR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造，以靶向特定的抗原來(lái)識(shí)別和吞噬腫瘤細(xì)胞。目前，通過(guò)對(duì)細(xì)胞外信號(hào)域的研究，確定了幾種常見(jiàn)的腫瘤靶點(diǎn)，如CD19、CD22、HER2等［28］。

目前，第二代的CAR-M正在開(kāi)發(fā)中，除了保持第一代CAR-M技術(shù)的特點(diǎn)外，研究人員希望可以通過(guò)在CAR結(jié)構(gòu)中添加一個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原呈遞和T細(xì)胞活化等目標(biāo)。加利福尼亞大學(xué)的Morrissey團(tuán)隊(duì)［26］制備了一種名為嵌合抗原吞噬受體（chimeric antigen receptors for phagocytosis，CAR-P）的新型CARs，并將其引入巨噬細(xì)胞中。該團(tuán)隊(duì)從已知的小鼠吞噬受體庫(kù)中篩選出Megf10、FcγR作為細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，攜帶Megf10（CAR-PMegf10）或FcRV（CAR-PFcγR）細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR-P轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后其對(duì)CD19的吞噬作用顯著增強(qiáng)。這說(shuō)明CAR-PMegf10或CARPFcγR結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)特定配體靶標(biāo)的吞噬作用。已有研究表明，PI3K信號(hào)通路對(duì)于大靶點(diǎn)的內(nèi)化非常重要［29］。由此，該團(tuán)隊(duì)在CARPMegf10的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上串聯(lián)PI3K招募域，發(fā)現(xiàn)PI3K招募域的加入進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-M對(duì)癌細(xì)胞的吞噬。上述研究表明，將各類(lèi)促吞噬效應(yīng)因子的活化基序串聯(lián)至CAR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)CAR-M的吞噬活性和抗腫瘤效應(yīng)。這可以作為一種應(yīng)用于臨床治療癌癥的思路，但這種策略需要對(duì)CAR-P受體本身進(jìn)行更多優(yōu)化，技術(shù)和成本方面依然面臨較大的挑戰(zhàn)。

為了使CAR-M獲得更廣譜的抗癌功效，除了CAR-M的結(jié)構(gòu)，CAR基因的轉(zhuǎn)染方法也需要考慮。在過(guò)去的CAR轉(zhuǎn)染策略中，多以慢病毒作為載體對(duì)體內(nèi)免疫細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，但其是否可以安全地用于臨床治療一直飽受爭(zhēng)議［30］。為了更高效地轉(zhuǎn)染原始人類(lèi)巨噬細(xì)胞，賓夕法尼亞大學(xué)的Klichinsky團(tuán)隊(duì)［31］設(shè)計(jì)了一種復(fù)制缺陷型嵌合腺病毒載體（Ad5f35），并將抗HER2的CAR克隆到Ad5f35載體中，實(shí)驗(yàn)證明HER2-CAR-Ad5f35轉(zhuǎn)染的人巨噬細(xì)胞高效表達(dá)了HER2-CAR，多呈現(xiàn)經(jīng)典激活途徑的M1型。同時(shí)腺病毒轉(zhuǎn)染不影響巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)和遷移能力。為突破限制CAR-M體外大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸、高額費(fèi)用和病毒載體修飾體內(nèi)巨噬細(xì)胞導(dǎo)致的致癌可能性。Kang等［32］利用非病毒載體，對(duì)TME中的巨噬細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)修飾以治療實(shí)體腫瘤。該團(tuán)隊(duì)首先將CAR-γ干擾素（IFN-γ）抗ALK基因克隆到非病毒載體piggyBac轉(zhuǎn)座子中，得到CAR-IFN-γ載體（CAR-IFN-γpDNA）。隨后利用一種22 ku大小且?guī)д姾傻霓D(zhuǎn)染試劑PEI的衍生物——jetPEI-macrophage （MPEI）與帶負(fù)電荷的CAR-IFN-γpDNA通過(guò)靜電作用形成納米復(fù)合物 MPEI/pCAR-IFN-γ，該復(fù)合物對(duì)人巨噬細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)染效率為14%。對(duì)比病毒載體而言，MPEI/pCARIFN-γ轉(zhuǎn)染復(fù)合物更加簡(jiǎn)單實(shí)惠，但仍需進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)染率（表1）。

Table 1 Characteristics of different transfection vectors for CAR-M表1 CAR-M不同轉(zhuǎn)染載體的特點(diǎn)

3 CAR-M的抗腫瘤效應(yīng)

目前，CAR-M研究的重點(diǎn)是通過(guò)引入各類(lèi)胞內(nèi)致敏結(jié)構(gòu)域激活和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，以促進(jìn)CAR-M發(fā)揮抗腫瘤作用（表2）。

Table 2 The anti-tumor effect of CAR-M表2 CAR-M抗腫瘤研究進(jìn)展

加利福利亞大學(xué)的Morrissey團(tuán)隊(duì)［26］制備的CAR-P巨噬細(xì)胞與人Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞Raji B共培養(yǎng)44 h后，發(fā)現(xiàn)CAR-P巨噬細(xì)胞的加入顯著減少了Raji B細(xì)胞的數(shù)量。但該研究沒(méi)有進(jìn)一步探究Raji B細(xì)胞的減少主要是由巨噬細(xì)胞的吞噬效應(yīng)介導(dǎo)還是巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬性死亡?？偟膩?lái)說(shuō)，CAR-P是一種成功的策略，可以引導(dǎo)巨噬細(xì)胞作用于腫瘤靶細(xì)胞，并可以啟動(dòng)細(xì)胞吞噬和自噬作用，從而清除腫瘤細(xì)胞。

浙江大學(xué)張進(jìn)團(tuán)隊(duì)［33］從健康供者的外周血中分離得到誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），將促進(jìn)M1型極化的CARs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到iPSCs中，繼而誘導(dǎo)其分化為M1-CAR-iMacs。體外腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)M1-CAR-iMacs的抗腫瘤作用及抗原依賴(lài)性的M1極化能力。在荷瘤NSG小鼠模型中，CAR-iMac細(xì)胞在體內(nèi)可以持續(xù)存活20 d以上，30 d后逐漸消失。特異靶向腫瘤間皮素的CAR（meso）-iMac處理荷瘤小鼠后第4、11和14天腫瘤負(fù)擔(dān)持續(xù)減輕，這說(shuō)明CAR（meso）-iMac在體內(nèi)具有抗癌細(xì)胞活性，但是需要進(jìn)一步改進(jìn)CAR-iMac以維持其活性。

南京大學(xué)沈萍萍研究團(tuán)隊(duì)［34］設(shè)計(jì)了一種靶向腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的嵌合抗原受體巨噬細(xì)胞（CAR-147），CAR-147可特異性識(shí)別抗原HER2，并有效激活巨噬細(xì)胞中MMP的表達(dá)。CAR-147巨噬細(xì)胞在體外并不抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中CAR-147巨噬細(xì)胞可降解腫瘤周?chē)旅艿哪z原基質(zhì)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤模型中T細(xì)胞的浸潤(rùn)。同時(shí)，CAR-147巨噬細(xì)胞顯著增加腫瘤組織中細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的表達(dá)水平。

賓夕法尼亞大學(xué)的Klichinsky團(tuán)隊(duì)［31］將特異性識(shí)別HER2的CAR克隆到Ad5f35載體中，轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞得到HER2-CAR-Ms。體外實(shí)驗(yàn)證明，HER2-CAR-Ms對(duì)HER2陽(yáng)性微珠和腫瘤細(xì)胞具有特異性吞噬作用，而且其對(duì)腫瘤的吞噬和殺傷水平與CAR的表達(dá)水平直接相關(guān)。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，接受HER2-CAR-Ms治療的小鼠生存期延長(zhǎng)、腫瘤轉(zhuǎn)移率降低。CAR-M在無(wú)瘤NSGS小鼠體內(nèi)存在至少62 d。且CAR-Ms在人TME中維持著一種促炎表型，可調(diào)控周?chē)庖呒?xì)胞。除了直接抗腫瘤，HER2-CAR-Ms還可交叉提呈抗原和激活T細(xì)胞。這也證實(shí)了CAR-Ms直接減輕腫瘤負(fù)擔(dān)、塑造TME和產(chǎn)生疫苗效應(yīng)。該團(tuán)隊(duì)正在開(kāi)展首次CAR-M的人類(lèi)臨床試驗(yàn)。

韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)的Kang團(tuán)隊(duì)［32］使用納米顆粒載體，將編碼CAR和IFN-γ的基因轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞得到MPEI/pCAR-IFN-γ。腦神經(jīng)瘤（Neuro-2a）荷瘤小鼠瘤內(nèi)注射MPEI/pCAR-IFN-γ后生存期顯著延長(zhǎng)，且治療期間小鼠平均體重未出現(xiàn)明顯變化，提示MPEI/pCAR-IFN-γ治療可以抑制腫瘤生長(zhǎng)且副作用輕微。

4 總結(jié)

2021年9月，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）給Klichinsky團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的CAR-M（CT-0508）開(kāi)通快速審批通道，表明了對(duì)基于CAR設(shè)計(jì)的腫瘤免疫療法的迫切需求［31］。盡管各種CAR-M設(shè)計(jì)的腫瘤免疫療法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)優(yōu)良，但仍有許多問(wèn)題需要解決。首先，體外改造后的巨噬細(xì)胞注射進(jìn)入機(jī)體后不會(huì)增殖，不僅細(xì)胞耗費(fèi)較大，而且療效也因此受限。其次，轉(zhuǎn)染CAR進(jìn)入巨噬細(xì)胞的方法，也存在較多的技術(shù)限制，如載體的選擇和長(zhǎng)期安全性［35］。雖然表達(dá)CARs的病毒載體可以大量生產(chǎn)，并可在-80°C下保存約9年，但是載體的安全性、無(wú)菌性、效價(jià)、純度至關(guān)重要［36-38］。另外，病毒載體的DNA通過(guò)插入突變整合到宿主細(xì)胞也是一個(gè)令人擔(dān)憂(yōu)的問(wèn)題，目前開(kāi)發(fā)的病毒載體較之前載體大大降低了突變的風(fēng)險(xiǎn)。然而，慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體都有潛在的致癌作用。非病毒載體不存在細(xì)胞毒性，但其最小有效劑量需要后續(xù)的臨床研究證實(shí)［32］。更關(guān)鍵的是其轉(zhuǎn)染率較低，在未來(lái)仍需攻克這一難題。同時(shí)，TME組成呈現(xiàn)復(fù)雜性和異質(zhì)性，當(dāng)前的CAR-M產(chǎn)品在動(dòng)物模型中得到良好的效果，但對(duì)于人的臨床效果未知［39］。根據(jù)以往CAR設(shè)計(jì)的經(jīng)驗(yàn)，靶抗原的暴露不夠充分可能導(dǎo)致CAR-M的治療效果不如預(yù)期［28］。最后，巨噬細(xì)胞在體內(nèi)的遷移特性也可能導(dǎo)致CARM策略治療效果的不佳［40］。外源性的巨噬細(xì)胞一般先通過(guò)肺，再在肝臟中富集［41］。過(guò)去的CAR相關(guān)免疫治療也表明，大多數(shù)靶向腫瘤抗原的免疫細(xì)胞傾向于在健康組織中集聚，導(dǎo)致潛在的脫靶毒性，導(dǎo)致功效受限，甚者產(chǎn)生毒性傷害機(jī)體［42-45］。在未來(lái)的臨床治療中，應(yīng)最大限度地提高CAR-M的有效性和安全性。