莪術(shù)醇對胃癌AGS細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制研究

周桂香 鄧帥 班江文 陳雯雯 譚寶

胃癌已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤之一,其高發(fā)病率與死亡率不僅嚴(yán)重危害國民的生命健康,并且在很大程度上也給國家及社會(huì)的進(jìn)步和發(fā)展帶來沉重的疾病負(fù)擔(dān)[1]。近年來,隨著中草藥不斷進(jìn)入人們的視野,越來越多的中草藥及中藥單體被發(fā)現(xiàn)在抗腫瘤中具有獨(dú)特的作用和顯著的優(yōu)勢,在抑制腫瘤增長的同時(shí)可以提高機(jī)體的免疫力,還可以增敏減毒,與化療藥配合使用起到協(xié)同增效的作用[2]。

莪術(shù),又稱黑心姜、烏姜、姜七,為姜科姜黃屬植物,功擅破血行氣,消積止痛[3],主開胃消食,破積聚,行血瘀,除腹痛?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),莪術(shù)揮發(fā)油具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗腫瘤的功效[4],課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)莪術(shù)揮發(fā)油能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯來發(fā)揮抗腫瘤的功效[4]。因此,本實(shí)驗(yàn)以莪術(shù)揮發(fā)油中所占含量比最多的單體成分莪術(shù)醇為實(shí)驗(yàn)對象,選取磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路為研究切入點(diǎn),通過探討莪術(shù)醇作用于胃癌AGS細(xì)胞后對該信號(hào)通路的影響,以期進(jìn)一步闡明莪術(shù)醇抗腫瘤作用可能的機(jī)制,為今后的臨床疾病治療及新藥開發(fā)提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

胃腺癌AGS細(xì)胞株,購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的胃癌AGS細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中(含10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗)培養(yǎng),放入5% CO2、37℃的恒溫飽和濕度的培養(yǎng)箱,觀察細(xì)胞生長情況,根據(jù)生長狀態(tài)進(jìn)行換液,細(xì)胞約鋪滿培養(yǎng)瓶底85%左右時(shí),用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.3 主要藥物與試劑

莪術(shù)醇購于成都曼斯特生物科技有限公司(批號(hào):MUST-20060802,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為99.76%),將其溶于二甲基亞砜中,然后用全培進(jìn)行稀釋,使稀釋后的二甲基亞砜終濃度≤5‰;順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào):601210605,規(guī)格:6 mL∶30 mg);胎牛血清(杭州四季青有限公司,批號(hào):21090706);DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):MA0212)、0.25%胰酶(批號(hào):MA0232)、PBS溶液(批號(hào):MA0015)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號(hào):Jan-18G)均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞周期試劑盒(批號(hào):A10734)購于聯(lián)科生物公司;CCK-8檢測試劑盒(批號(hào):SC119-02)購于大連美侖生物技術(shù)有限公司;B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(批號(hào):3560006120)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)抗體(批號(hào):3560138106)、β-actin抗體(批號(hào):2021040708)購于武漢ABclonal公司;PI3K抗體(批號(hào):ab151549)、p-Akt抗體(批號(hào):AF0908)、p-mTOR抗體(批號(hào):CST-5536)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)抗體(批號(hào):GB11767c)均購于武漢塞維爾生物科技有限公司;增強(qiáng)型RIPA裂解液(批號(hào):16128C02)、BCA蛋白濃度測定試劑(批號(hào):16H10A46)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(批號(hào):16J20B12)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號(hào):16J27C38)均購于博士德生物有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱和-80℃低溫冰箱(美國Thermo公司);酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(ZEISS公司);低速離心機(jī)(中科中佳有限公司);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司);WB顯影儀(Protein Simple公司);水平搖床、電泳儀(北京六一生物科技有限公司);電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司);各種量程手動(dòng)移液器(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法與指標(biāo)檢測

1.5.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 將用0.25%胰酶消化后的胃癌AGS細(xì)胞調(diào)整至濃度約為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,選取96孔板進(jìn)行種板。設(shè)空白對照組、莪術(shù)醇低濃度組、莪術(shù)醇中濃度組、莪術(shù)醇高濃度組和陽性對照組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每孔100 μL細(xì)胞懸液。

種板結(jié)束后將96孔板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后將預(yù)先用全培稀釋好的莪術(shù)醇依次加入。莪術(shù)醇低、中、高濃度組濃度分別為12.5、25、50 μg/mL;空白對照組加入稀釋濃度為5‰二甲基亞砜的完全培養(yǎng)基;陽性對照組加入5 μg/mL的順鉑,將96孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48小時(shí)。

將96孔板從培養(yǎng)箱中取出,棄去孔內(nèi)的舊含藥培養(yǎng)基,加入CCK-8混合工作液110 μL,孵育1小時(shí)左右時(shí),在酶標(biāo)儀450 nm波長條件下測定各個(gè)孔的吸光度(OD值),每組OD值舍棄最大和最小值,選取4個(gè)復(fù)孔,根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)×100%。

1.5.2 細(xì)胞凋亡檢測 胃癌AGS細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于6孔板內(nèi),設(shè)空白對照組、莪術(shù)醇低、中、高濃度組,每組選取3個(gè)復(fù)孔,每孔接種2 mL細(xì)胞懸液,過夜細(xì)胞貼壁后將舊培養(yǎng)基棄掉。莪術(shù)醇低、中、高濃度組依次加入濃度為12.5、25、50 μg/mL的莪術(shù)醇進(jìn)行干預(yù),空白對照組加入新鮮全培作對照。繼續(xù)培養(yǎng)24、48小時(shí),藥物干預(yù)結(jié)束后分組將孔板內(nèi)的細(xì)胞上清液收集,再用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,全培終止消化后按順序依次移入事先裝有上清液的離心管中,上機(jī)離心后(1 000r/min,離心力179 g,離心5分鐘)棄掉上清液,PBS(-20℃預(yù)冷)輕柔吹打洗滌兩次,離心棄去PBS,用稀釋后的1×Binding buffer工作液重懸細(xì)胞,濃度約為1×106個(gè)/mL。將重懸后的細(xì)胞移至流式管中,每管約100 μL,然后加入雙染試劑(Annexin V-FITC和PI)各5 μL和10 μL,充分混勻后室溫下避光孵育20分鐘左右,然后每管再次加入400-600 μL的1×Binding buffer工作液,混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(一般要求在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)為佳)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 細(xì)胞周期檢測 將離心后的胃癌AGS細(xì)胞沉淀重懸為1×105個(gè)/mL的重懸液接種于6孔板內(nèi),設(shè)空白對照組、莪術(shù)醇低、中、高濃度組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每個(gè)復(fù)孔2 mL細(xì)胞重懸液,待細(xì)胞在培養(yǎng)箱中貼壁后加藥,莪術(shù)醇低、中、高濃度組依次加入濃度為12.5、25、50 μg/mL的莪術(shù)醇進(jìn)行干預(yù),空白對照組更換為不含藥物的全培。加藥后允許細(xì)胞繼續(xù)生長24、48小時(shí),干預(yù)時(shí)間完成后用0.25%的胰酶進(jìn)行消化,全培終止后輕輕吹打培養(yǎng)板底部的細(xì)胞,然后用移液器移入離心管上機(jī)離心(1 000r/min,離心力179 g,離心5分鐘)。棄掉上清液,加入室溫下PBS(約1 mL)重懸,然后將混懸液一邊高速攪拌一邊緩緩加入約3 mL的無水乙醇中(-20℃預(yù)冷),-20℃固定過夜保存。上機(jī)檢測時(shí),將在-20℃固定的細(xì)胞先離心棄掉乙醇固定液,然后加入PBS水化細(xì)胞(室溫條件下3-5 mL),室溫下水化5分鐘左右,然后移至流式管中,再次離心棄上清。加入1 mL的DNA staining solution試劑進(jìn)行細(xì)胞染色,渦旋機(jī)混勻后室溫下避光孵育約30分鐘,上機(jī)檢測細(xì)胞的周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4 Wound healing檢測胃癌AGS細(xì)胞的遷移、修復(fù)能力 將胃癌AGS細(xì)胞重懸為約1×105個(gè)/mL的濃度進(jìn)行種板,6孔板每孔接種1.5 mL懸液,設(shè)空白對照組、莪術(shù)醇低、中、高濃度組,每組3個(gè)復(fù)孔。鋪板結(jié)束后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長情況,待細(xì)胞在6孔板底部形成單細(xì)胞層時(shí),用10 μL的移液器槍頭尖端在各個(gè)孔底垂直畫一條直線,操作過程要保證槍頭垂直,用無菌PBS將脫落的細(xì)胞清洗三次,然后將空白組加入無血清的培養(yǎng)基,莪術(shù)醇低、中、高濃度組分別加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的濃度為12.5、25、50 μg/mL的莪術(shù)醇;藥物干預(yù)48小時(shí)后,每組分別在藥物干預(yù)前、后選擇三個(gè)不同的視野進(jìn)行拍照,用Image J軟件分析干預(yù)前后的劃痕面積,根據(jù)劃痕面積差異計(jì)算劃痕愈合率。

傷口劃痕愈合率=[(劃痕面積0小時(shí)-劃痕面積48小時(shí))/劃痕面積0小時(shí)]×100%

1.5.5 蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 將生長狀態(tài)良好的胃癌AGS細(xì)胞消化離心后,以1×105個(gè)/mL濃度于6孔板中種板,每孔約2 mL懸液。設(shè)空白對照組、莪術(shù)醇低、中、高濃度組和陽性對照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后棄掉孔內(nèi)舊培養(yǎng)基,空白對照組更換新鮮全培,莪術(shù)醇低、中、高濃度組加入濃度分別為12.5、25、50 μg/mL的莪術(shù)醇干預(yù),陽性對照組加入5 μg/mL的順鉑。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后去除孔板內(nèi)原有培養(yǎng)基,用PBS清洗各孔,然后每孔加入200 μLRIPA裂解液,晃動(dòng)6孔板,使裂解液與細(xì)胞完全接觸,孔板在冰上裂解10分鐘左右,將經(jīng)過裂解的細(xì)胞移入EP管中,繼續(xù)在冰上進(jìn)行裂解,然后渦旋震蕩3次,每次間隔10分鐘,結(jié)束后4℃低溫離心機(jī)離心(12 000 r/min,離心15分鐘),提取總蛋白。然后用BCA試劑盒進(jìn)行樣本總蛋白濃度定量,將EP管中取樣定量后剩余的蛋白高溫變性,-20℃冰箱保存。每組等量的蛋白質(zhì)(每孔15 μg蛋白)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶4℃冰箱封閉過夜,TBST洗膜后,加一抗PI3K、p-Akt、p-mTOR、Caspase-3、Bcl-2、Bax及β-actin(按比例進(jìn)行稀釋),4℃冰箱孵育過夜后棄去一抗,加二抗(羊抗兔IgG-HRP,1∶5 000),室溫下孵育2小時(shí),結(jié)束后再次用TBST洗膜3次,每次大約10分鐘,滴加ECL發(fā)光液,凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影、拍照。選取β-actin為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參蛋白,用Image J軟件進(jìn)行目標(biāo)蛋白條帶灰度值的統(tǒng)計(jì)分析,通過目標(biāo)蛋白的條帶灰度值表達(dá)差異來計(jì)算各個(gè)蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇對胃癌AGS細(xì)胞生長活力的影響

用不同濃度的莪術(shù)醇干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24小時(shí)后,胃癌AGS細(xì)胞活力從89.32%下降到51.21%;干預(yù)48小時(shí)后,胃癌AGS細(xì)胞活力從65.03%下降到19.14%,經(jīng)計(jì)算得出莪術(shù)醇干預(yù)24小時(shí)和48小時(shí)的半抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)值分別為50.04 μg/mL和19.91 μg/mL。因此,莪術(shù)醇濃度不同,干預(yù)時(shí)間不同,其增殖抑制率有明顯差別。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,莪術(shù)醇對胃癌AGS細(xì)胞增殖抑制作用呈現(xiàn)出良好的濃度-時(shí)間依賴性。見表1,圖1。

圖1 莪術(shù)醇干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)的IC50值

表1 莪術(shù)醇對AGS細(xì)胞活力的影響

2.2 莪術(shù)醇對胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響

莪術(shù)醇干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24、48小時(shí)后,采用Annexin V-FITC和PI雙染法將凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞區(qū)分,上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度和不同干預(yù)時(shí)間的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示,莪術(shù)醇干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24小時(shí)后,細(xì)胞凋亡率從22.7%上升到52.43%;干預(yù)48小時(shí)后,凋亡率從37.17%上升到64.37%。不同濃度的莪術(shù)醇干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞后,隨著時(shí)間的延長凋亡率逐漸增加,呈現(xiàn)出良好的時(shí)效-量效關(guān)系。見表2、圖2、表3、圖3。

注A 空白對照組;B 莪術(shù)醇低濃度組;C 莪術(shù)醇中濃度組;D 莪術(shù)醇高濃度組。圖2 莪術(shù)醇干預(yù)24小時(shí)對胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響

注A 空白對照組;B 莪術(shù)醇低濃度組;C 莪術(shù)醇中濃度組;D 莪術(shù)醇高濃度組。圖3 莪術(shù)醇干預(yù)48小時(shí)對胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響

表2 莪術(shù)醇干預(yù)24小時(shí)對胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響

表3 莪術(shù)醇干預(yù)48小時(shí)對胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響

2.3 莪術(shù)醇對AGS細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測胃癌AGS周期分布結(jié)果可知,莪術(shù)醇干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24小時(shí)后,出現(xiàn)細(xì)胞的G2/M期周期阻滯,干預(yù)后處于G2/M期的細(xì)胞由3.95%上升到17.03%,并且藥物濃度越高細(xì)胞G2/M期周期阻滯比率越高;莪術(shù)醇干預(yù)48小時(shí)后,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,細(xì)胞所占比由52.34%增加到72.04%,周期阻滯作用呈現(xiàn)出藥物濃度依賴性。由此可知,在莪術(shù)醇濃度相同的情況下,可能由于干預(yù)時(shí)間的差異,使得AGS細(xì)胞的周期阻滯作用出現(xiàn)差異。見表4、表5,圖4、圖5。

注A 空白對照組;B 莪術(shù)醇低濃度組;C 莪術(shù)醇中濃度組;D 莪術(shù)醇高濃度組。圖4 莪術(shù)醇干預(yù)24小時(shí)對胃癌AGS細(xì)胞周期的影響

注A 空白對照組;B 莪術(shù)醇低濃度組;C 莪術(shù)醇中濃度組;D 莪術(shù)醇高濃度組。圖5 莪術(shù)醇干預(yù)48小時(shí)對胃癌AGS細(xì)胞周期的影響

表4 莪術(shù)醇干預(yù)24小時(shí)對胃癌AGS細(xì)胞周期分布的影響

表5 莪術(shù)醇干預(yù)48小時(shí)對胃癌AGS細(xì)胞周期分布的影響

2.4 莪術(shù)醇對AGS細(xì)胞遷移和修復(fù)能力的影響

與空白對照組相比,不同濃度的莪術(shù)醇干預(yù)AGS細(xì)胞48小時(shí)后各組的傷口愈合率呈明顯下降趨勢,傷口愈合率從對照組的78.05%下降到17.51%。同時(shí),隨著莪術(shù)醇濃度的梯度遞增,傷口的愈合率明顯下降,表明莪術(shù)醇能夠抑制胃癌AGS細(xì)胞的遷移,降低傷口的修復(fù)能力。見圖6,表6。

圖6 各組胃癌AGS細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)愈合情況

表6 莪術(shù)醇對胃癌AGS細(xì)胞劃痕愈合率的影響

2.5 莪術(shù)醇對PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

胃癌AGS細(xì)胞經(jīng)不同濃度的莪術(shù)醇及陽性藥順鉑干預(yù)48小時(shí)后,與空白對照組相比,各給藥組PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05);與莪術(shù)醇高濃度組相比,陽性對照組的PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明莪術(shù)醇的干預(yù)可使PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)下降,但高濃度莪術(shù)醇和順鉑抑制效果相差不大。

與空白對照組相比,各藥物組Bax蛋白表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢,Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào),Caspase-3蛋白表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)(均P<0.05),說明莪術(shù)醇可能通過改變Bax和Bcl-2蛋白兩者之間的表達(dá)比例,激活Caspase-3蛋白,使其執(zhí)行凋亡功能,實(shí)現(xiàn)促凋亡作用。見表7、表8,圖7。

注A 空白對照組;B 莪術(shù)醇低濃度組;C 莪術(shù)醇中濃度組;D 莪術(shù)醇高濃度組;E 陽性對照組。圖7 莪術(shù)醇對PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表7 莪術(shù)醇對PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

表8 莪術(shù)醇對Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

生命活動(dòng)的正常完成及機(jī)體內(nèi)部平衡和穩(wěn)態(tài)的維持,離不開細(xì)胞的有序增殖、分化及凋亡[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的紊亂有密切關(guān)系[6],腫瘤細(xì)胞能夠逃逸周期檢查點(diǎn)而無限制地增殖,導(dǎo)致凋亡減少。因此,如果能夠通過藥物來打破這種失控的增殖現(xiàn)象,則可在一定程度上減緩腫瘤的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇呈現(xiàn)出濃度-時(shí)間依賴性地抑制胃癌AGS細(xì)胞的增殖活性,促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)胃癌AGS出現(xiàn)G2/M期、G0/G1期的周期阻滯,并且可以抑制細(xì)胞的遷移和修復(fù)。據(jù)此可推斷莪術(shù)醇對胃癌AGS細(xì)胞的生長活性的抑制作用可能是通過促進(jìn)凋亡、抑制遷移和修復(fù)以及誘導(dǎo)周期阻滯而實(shí)現(xiàn)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的形式之一,使受損細(xì)胞被有效清除[7],維持正常新陳代謝。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來越多的疾病與凋亡異常有關(guān),癌癥為其中的一種。本實(shí)驗(yàn)用莪術(shù)醇干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞后呈現(xiàn)出時(shí)效-量效依賴性地增加細(xì)胞凋亡率。同時(shí),為了探究誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的可能原因,本研究檢測了Caspase-3、Bax和Bcl-2三個(gè)經(jīng)典凋亡蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)經(jīng)莪術(shù)醇干預(yù)后Bax和Caspase-3蛋白水平明顯上調(diào),Bcl-2蛋白水平明顯下調(diào)。Bcl-2蛋白家族在調(diào)控細(xì)胞的存活和凋亡中起著重要作用,Bcl-2是抗凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白[8]。二者可以在細(xì)胞內(nèi)形成異質(zhì)二聚體而失活,當(dāng)兩者相對的比例失衡時(shí),會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的完整性被破壞,增加線粒體自身的通透性,造成細(xì)胞膜內(nèi)外Ca2+失衡,損傷外膜,釋放出細(xì)胞色素C。當(dāng)細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)后,激活Caspase家族的級聯(lián)反應(yīng),最終激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3,引起細(xì)胞凋亡進(jìn)程的改變[9-10]。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞以及多種腫瘤實(shí)體的存活、增殖、分化及促血管生成等多方面起著重要作用[11-12],是一條經(jīng)典的抗凋亡、促增殖信號(hào)通路[13]。該信號(hào)通路組成復(fù)雜,生物功能廣泛,在胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、卵巢癌等多種癌癥中均可見其調(diào)控功能異常[14-17],是臨床上很多疾病治療藥物篩選的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中Akt信號(hào)通路異常活化,活化后的信號(hào)通路影響細(xì)胞的正常增殖、凋亡及遷移進(jìn)程,并且活化的Akt還會(huì)進(jìn)一步將信號(hào)向下傳導(dǎo)轉(zhuǎn)化底物,激活下游的眾多靶蛋白包括mTOR,調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和分化[18]。因此,PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被作為研究胃癌進(jìn)展的重要靶點(diǎn)。同時(shí)有研究證實(shí),Akt是一個(gè)重要的抗凋亡因子,當(dāng)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路時(shí),可以抑制腫瘤細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá),促進(jìn)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá),從而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[19-20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇可以顯著抑制胃癌AGS細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)蛋白的磷酸化水平,上調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達(dá),下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。因此,莪術(shù)醇可能通過失活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來抑制胃癌AGS細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述,莪術(shù)醇可以通過抑制生存信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR的表達(dá)來誘導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞凋亡增加,阻滯受損細(xì)胞的異常增殖,對腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展產(chǎn)生明顯的延緩作用,為莪術(shù)醇用于胃癌的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)的不足之處為尚未通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證莪術(shù)醇對胃癌AGS細(xì)胞的作用是否與體外實(shí)驗(yàn)相一致,以及在莪術(shù)醇的作用下PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的作用是否與其他信號(hào)通路交互影響。關(guān)于莪術(shù)醇對胃癌抗腫瘤作用的具體療效及更深入機(jī)制還需要從基因等方面進(jìn)行探討與證實(shí)。