miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 挽救聽力減退在耳聾中的作用

叢林海 ，湯 勇 ，殷家志 ，鄧 苙 ，高慧芳 ，方紅麗 ，李 昕

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科;2）健康管理中心;3）檢驗(yàn)科，云南 昆明 650032）

聽力損失影響著全球約15 億人，而在中國(guó)所有年齡段中就有約2 億多人，這些病例中有大約一半被認(rèn)為是遺傳性的[1-2]。在遺傳性耳聾的基因變異中，SLC26A4 是除GJB2 外最常見的耳聾致病基因，是導(dǎo)致大前庭導(dǎo)水管綜合征（large vestibular aquduct syndrome，LVAS）的致病基因，在聾人中占19.4%，正常人群中的攜帶率為2%，典型表現(xiàn)為兒童時(shí)期的聽力損失，90%的患者為雙側(cè)性，聽力損失程度不一，病程一般為進(jìn)行性或波動(dòng)性聽力下降，在跌倒、撞擊等行為時(shí)易致明顯的不可逆的聽力下降[3]。在此種情況下，找到能對(duì)SLC26A4 基因進(jìn)行調(diào)控的方法就顯得尤為重要。目前對(duì)于聽力損失的治療方案仍然局限于聲音放大和人工耳蝸植入，但是聽力恢復(fù)遠(yuǎn)非完美，特別是對(duì)嘈雜環(huán)境中的聲音的感知[4-5]。這就迫切需要找到針對(duì)人類聽力損失的生物治療方法，去尋找并開發(fā)針對(duì)于各種類型聽力損失的基因、細(xì)胞和藥物療法，從而為廣大聽力損失患者提供新的治療手段和決策。miRNAs 已被證實(shí)廣泛存在于不同的細(xì)胞和組織中，在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，有許多研究表明miRNA 的異常導(dǎo)致了耳聾的發(fā)生，而關(guān)于miR-26a-5p 與耳聾的機(jī)制研究非常少，因此，本文擬對(duì)miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 表達(dá)在聽力減退中的作用做一研究，以期能為SLC26A4 基因突變導(dǎo)致的耳聾的治療提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物及分組本實(shí)驗(yàn)所使用的SPF 級(jí)別雄性C57 小鼠（標(biāo)準(zhǔn)體重）均購(gòu)自于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，本研究的實(shí)驗(yàn)方法和操作方法均已得到昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有小鼠都飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，飼養(yǎng)環(huán)境均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。18 只C57 小鼠被分為3 組，為假手術(shù)組、聽力損傷組和耳聾組。假手術(shù)組是注射生理鹽水，而不注射致聾藥物D-半乳糖。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑D-半乳糖購(gòu)自于山東萍聚生物科技有限公司，氯化鈉注射液（Nacl）購(gòu)自于云南南詔藥業(yè)有限公司，無(wú)水乙醇、三氯甲烷、異丙醇均購(gòu)自于天津市瑞明威化工有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PerfectStartUniRTKIT）和qPCR 擴(kuò)增試劑盒（PerfectStartUnigPCRKIT）均購(gòu)自于昆明云科生物技術(shù)有限公司，異氟烷購(gòu)自于深圳瑞沃德生命科技有限公司，miR-26a-5p 和SLC26A4 引物均購(gòu)自于安徽九德科技有限公司，miR-26a-5p 和SLC26A4 的干擾和過表達(dá)載體均購(gòu)自于廣州銳博生物有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備高速低溫離心機(jī)購(gòu)自于湖南赫西儀器裝備有限公司，熒光定量PCR 儀和酶標(biāo)儀購(gòu)自于美國(guó)伯樂公司，TDT 聽覺誘發(fā)電位工作站購(gòu)自于北京愛生科貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型構(gòu)建參照郝帥的D-半乳糖造模方法[6]進(jìn)行一定改良，觀測(cè)指標(biāo)為：小鼠活動(dòng)是否遲緩，小鼠雙側(cè)耳廓反應(yīng)是否靈敏。對(duì)聽力損傷模型制造組給予100 mg/kg 的量進(jìn)行腹腔注射給D-半乳糖，耳聾模型制造組給D-半乳糖150 mg/kg的量，假手術(shù)組根據(jù)小鼠的體重比例，腹腔注射同等量的Nacl 注射液。以上注射時(shí)間均為每天2 次，持續(xù)1 個(gè)月。

1.2.2 聽性腦干反應(yīng)測(cè)試（ABR）本實(shí)驗(yàn)在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行測(cè)試，通過不同頻率的刺激信號(hào)在8 kHz、16 kHz、24 kHz 和32 kHz 時(shí)誘導(dǎo)小鼠在麻醉狀態(tài)下的電生理反應(yīng)，儀器通過平均技術(shù)進(jìn)行相關(guān)信號(hào)處理，通過解析聽性腦干反應(yīng)測(cè)試頻譜中8 個(gè)諧波的相位和幅度，采用序貫檢驗(yàn)的方法來(lái)消除持續(xù)的EEG 噪聲和診斷聽力的其他干擾。刺激聲音強(qiáng)度以5 dB 依次遞減，如果能分辨出最低刺激強(qiáng)度的即為ABR 閾值，重復(fù)3 次。

1.2.3 注射治療對(duì)聽力損傷和耳聾模型小鼠進(jìn)行尾靜脈注射miR-26a-5p 和SLC26A4 的干擾和過表達(dá)載體，每天1 次，持續(xù)10 d。

1.2.4 小鼠耳蝸取材在實(shí)驗(yàn)達(dá)到終止階段，對(duì)所有小鼠進(jìn)行異氟烷吸入過度麻醉處死，然后取出小鼠兩側(cè)聽泡，放入液氮中保存用于后續(xù)qPCR 實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 qPCR 實(shí)驗(yàn)在Pubmed 官網(wǎng)上下載miR-26a-5p 及內(nèi)參U6 和SLC26A4 及內(nèi)參β-actin 的核酸序列，通過PrimerPremier 6 軟件對(duì)它們的引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，將引物序列發(fā)九德科技有限公司進(jìn)行合成，具體序列見表1。使用電動(dòng)研磨液對(duì)小鼠的耳蝸進(jìn)行研磨處理，使用Trizol 法對(duì)耳蝸組織進(jìn)行總RNA 的提取。得到總RNA 后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA 的濃度及純度，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PerfectStartUniRTKIT 說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再根據(jù)熒光定量試劑盒PerfectStartUnig-PCRKIT 說(shuō)明書進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR 擴(kuò)增的CT 值后根據(jù)2-△△CT 公式來(lái)計(jì)算miR-26a-5p 和SLC26A4 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)2 組之間（antagomir 和agomir 注射后小鼠miR-26a-5p 和SLC26A4 的相對(duì)表達(dá)量）的數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析統(tǒng)計(jì)3 組及3 組以上（18 只小鼠聽性腦干測(cè)試及小鼠miR-26a-5p 和SLC26A4 的相對(duì)表達(dá)量）的數(shù)據(jù)，而后根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)比較組內(nèi)差異，P＜ 0.05 即表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠聽力損傷模型和小鼠耳聾模型構(gòu)建成功

使用聽性腦干反應(yīng)測(cè)試來(lái)檢測(cè)各組C57 小鼠的右耳聽力情況，結(jié)果顯示，無(wú)論是8 kHz、16 kHz、24 kHz 還是32 kHz，同組之間的小鼠之間的聽力閾值無(wú)明顯差異，但是相對(duì)于假手術(shù)組來(lái)說(shuō)，聽力損傷和耳聾小鼠聽力閾值明顯提高，耳聾小鼠閾值有顯著的翻倍，見圖1，結(jié)果表明模型構(gòu)建成功。

圖1 聽力損傷和耳聾小鼠模型的鑒定Fig.1 Identification of mouse model of hearing loss and deafness

2.2 小鼠聽力損傷和耳聾后miR-26a-5p 下調(diào)和SLC26A4 上調(diào)

在使用qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠聽力損傷和耳聾后耳蝸中miR-26a-5p 和SLC26A4 的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，miR-26a-5p 在小鼠聽力損傷和耳聾后表達(dá)異常，出現(xiàn)明顯降低，見圖2A；相反的是SLC26A4 的表達(dá)卻明顯升高，見圖2B。

圖2 miR-26a-5p 和SLC26A4 在聽力損傷和耳聾小鼠耳蝸中的表達(dá)Fig.2 Expression of miR-26a-5p and SLC26A4 in the cochlea of mice with hearing impairment and deafness

2.3 miR-26a-5p 可以靶向調(diào)控SLC26A4 的表達(dá)

使用TargetScan 網(wǎng)站（https://www.targetscan.org/vert_72/）對(duì)miR-26a-5p 和SLC26A4 的靶向結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行生信預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示miR-26a-5p 和SLC26A4 可以靶向結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)共有7 對(duì)堿基，見圖3A。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)檢測(cè)miR-26a-5p 和SLC26A4 兩者之間是否靶向結(jié)合，可以看到野生型SLC26A4 組熒光素酶活性與對(duì)照組相比明顯降低，而突變型SLC26A4 無(wú)明顯差異，見圖3B。對(duì)C57 小鼠分別注射miR-26a-5p 的antagomir 和agomir，而后對(duì)小鼠的耳蝸使用qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-26a-5p 和SLC26A4 的表達(dá)量，結(jié)果顯示，miR-26a-5p 的antagomir 可以顯著降低miR-26a-5p 的表達(dá)，而SLC26A4 正好相反；此外agomir 明顯提高了miR-26a-5p 的表達(dá)，同時(shí)也抑制了SLC26A4 的表達(dá)，見圖3C 和圖3D。

圖3 miR-26a-5p 可靶向SLC26A4 調(diào)控其表達(dá)Fig.3 miR-26a-5p targets SLC26A4 and regulates its expression

2.4 miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 改善了聽力減退

通過分別給聽力損傷小鼠注射miR-26a-5p的干擾和過表達(dá)載體以及SLC26A4 的干擾和過表達(dá)載體，繼而使用ABR 監(jiān)測(cè)小鼠的聽力閾值情況，結(jié)果顯示，si-SLC26A4 和miR-26a-5p agomir 可以顯著降低小鼠的聽力閾值，見圖4A 和圖4B，這表明miR-26a-5p 可以通過調(diào)控SLC26A4 達(dá)到改善小鼠聽力減退的功能。

圖4 miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 達(dá)到改善小鼠聽力減退Fig.4 miR-26a-5p regulates SLC26A4 to improve hearing loss in mice

3 討論

遺傳性耳聾在出生缺陷中已經(jīng)是一種非常常見的臨床現(xiàn)狀，許多與耳聾（聽力損傷）相關(guān)的基因已經(jīng)被陸續(xù)確定[7]，這就表明致病基因的檢測(cè)在未來(lái)先天性耳聾患者中進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢查是不可或缺的[8]。第一個(gè)miRNA 在1993 年被發(fā)現(xiàn)，miRNA可以結(jié)合到mRNA 上，導(dǎo)致靶mRNA 完全降解，從而使得靶mRNA 的翻譯受到抑制[9-10]。miRNAs已被證實(shí)廣泛存在于不同的細(xì)胞和組織中，在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[11]，同樣在遺傳性耳聾中也擔(dān)任重要的角色[12]。有許多研究表明miRNA的異常導(dǎo)致了耳聾的發(fā)生，如Mohammad-Reza發(fā)現(xiàn)miR-183 的異常會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)胞逐漸失去頂端結(jié)構(gòu)，聽力閾值增加，而通過提高miR-183 家族在聽細(xì)胞中的水平，可以恢復(fù)耳尖結(jié)構(gòu)和聽力[13]。而關(guān)于miR-26a-5p 與耳聾的機(jī)制研究非常少，這就值得筆者去探究miR-26a-5p 在耳聾中是什么樣的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p 在小鼠聽力損傷后尤其是耳聾后表達(dá)異常的降低，在小鼠體內(nèi)增加其表達(dá)后發(fā)現(xiàn)小鼠聽力閾值變得更高，聽力損傷加重，這些結(jié)果都說(shuō)明miR-26a-5p 是耳聾的潛在保護(hù)基因。

SLC26A4 是溶質(zhì)載體家族的一員，是一種pendrin 蛋白編碼基因，主要在甲狀腺、內(nèi)耳和腎臟中表達(dá)[14]。已有許多研究表明該基因的致病性變異可導(dǎo)致耳聾伴前庭導(dǎo)尿管增大（EVA），包括感音神經(jīng)性聽力損失[15-16]。本次研究發(fā)現(xiàn)了SLC26A4 在小鼠聽力損傷后表達(dá)異常高，且miR-26a-5p 可以靶向調(diào)節(jié)SLC26A4 的相關(guān)表達(dá)。在小鼠體內(nèi)提高miR-26a-5p 的表達(dá)后，SLC26A4表達(dá)明顯受到抑制，此外筆者發(fā)現(xiàn)小鼠的聽力減退得到了改善。同時(shí)筆者在小鼠體內(nèi)抑制掉SLC26A4 表達(dá)，結(jié)果與上面一致，這表明SLC26A4 是耳聾的致病基因，會(huì)引起一系列的聽力損傷。

綜上所述，miR-26a-5p 可以通過調(diào)控SLC26A4從而挽救聽力減退，SLC26A4 是耳聾中導(dǎo)致聽力減退的罪魁禍?zhǔn)字?，而通過miR-26a-5p 吸附SLC26A4 靶向抑制其表達(dá)后在小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以有效改善聽力損傷。本次研究從miRNA 調(diào)控靶mRNA 表達(dá)機(jī)制研究，揭示了miR-26a-5p 調(diào)控SLC26A4 的作用機(jī)制，為miR-26a-5p 和SLC26A4 在遺傳性耳聾的基因治療中提供一定的科學(xué)依據(jù)。