血管性血友病因子活性檢測在病毒滅活冷沉淀質(zhì)量控制中的應(yīng)用

李庚娣，鄭瑤玲，劉永梅，于 洋，曾凌曉，鐘波婷

(深圳市寶安區(qū)中心血站，廣東深圳518101)

血管性血友病因子活性檢測在病毒滅活冷沉淀質(zhì)量控制中的應(yīng)用

李庚娣，鄭瑤玲，劉永梅，于 洋，曾凌曉，鐘波婷

(深圳市寶安區(qū)中心血站，廣東深圳518101)

目的建立血管性血友病因子標(biāo)準(zhǔn)曲線，探討在血管性血友病因子檢測病毒滅活冷沉淀質(zhì)量控制中的應(yīng)用。方法將80袋200ml新鮮冰凍血漿在4℃血漿解凍箱溶解后平均分為兩袋，每袋約100ml，分兩組做實(shí)驗(yàn)研究，一組直接做成冷沉淀（對照組）留標(biāo)本2ml，另一組做病毒滅活后做冷沉淀（實(shí)驗(yàn)組）留標(biāo)本2ml，將標(biāo)本急凍統(tǒng)一檢測血管性血友病因子活性。結(jié)果80袋對照組血管性血友病因子(vWF)活性為262.40+22.35%；實(shí)驗(yàn)組血管性血友病因子(vWF)活性為211.72+16.32%。結(jié)論病毒滅活血漿做冷沉淀除了不穩(wěn)定因子VIII及纖維蛋白原有不同程度降低外，血管性血友病因子活性降低的幅度大約為19%，也可作為一項(xiàng)監(jiān)測病毒滅活冷沉淀的指標(biāo)使用。

血管性血友病因子(vWF)；病毒滅活；冷沉淀

冷沉淀是采用特定的方法將保存期內(nèi)的新鮮冰凍血漿在1℃~6℃融化后，分離出大部分的血漿，并將剩余的冷不溶解物質(zhì)在1h內(nèi)速凍成固態(tài)的成分血[1]。也是臨床常用重要的血液產(chǎn)品之一，除了常規(guī)的止血及凝血功能障礙的補(bǔ)充外，亦有外用的諸多功效如深度燒傷、皮膚和黏膜疾病、角膜疾病修復(fù)視力的作用[2]。冷沉淀主要含有Ⅷ因子、纖維蛋白原、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)、第XIII因子以及纖連蛋白等成分。冷沉淀中一個重要組成部分是血管性血友病因子(vWF)。輸注冷沉淀是臨床患者補(bǔ)充vWF的常見治療手段。因此，冷沉淀中vWF含量應(yīng)該值得重視[3]。特別是新鮮冰凍血漿經(jīng)過病毒滅活工藝處理后制備的冷沉淀，vWF因子水平的影響，就值得研究。本文就選用vWF因子含量測定探討病毒滅活冷沉淀的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料及材料

1.1 標(biāo)本來源及方法2015年11月-2016年6月按照GB18467《獻(xiàn)血者健康檢查要求》2011版[4]，經(jīng)體檢征詢及初篩檢測合格后，并在嚴(yán)格控制采集時間規(guī)格為200ml新鮮冰凍血漿80袋。分四批進(jìn)行，每批次20袋，將新鮮冰凍血漿在4℃血漿解凍箱溶解后平均分為兩袋，每袋約100ml，分兩組做實(shí)驗(yàn)研究，一組直接做成冷沉淀（對照組）留標(biāo)本2ml，另一組做病毒滅活后做冷沉淀（實(shí)驗(yàn)組）留標(biāo)本2ml，將標(biāo)本急凍統(tǒng)一檢測。

1.2 試劑材料及設(shè)備

1.2.1 制備設(shè)備及耗材血漿速凍機(jī)MBF21（盧森堡多美達(dá)），醫(yī)用病毒滅活柜HDME-1A(上海輸血技術(shù))，冰凍血漿解凍箱KJX-III（蘇州），離心機(jī)6000i(德國賀利氏)，一次性使用濾白采血袋（上海輸血技術(shù)有限公司），一次性使用病毒滅活輸血過濾器材(MBPF.04B上海輸血技術(shù)有限公司)

1.2.2 檢測試劑及設(shè)備人血管性血友病因子-酶聯(lián)免疫法（上海酶聯(lián)生物科技有限公司lot：201607，EXP：201701），TECAN洗板機(jī)（瑞士）、TECAN酶標(biāo)儀（瑞士）。

1.3 vWF檢測

1.3.1 檢測原理vWF水平測定采用雙抗體夾心法，用ELISA試劑盒嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3.2 具體操作如下用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液對標(biāo)準(zhǔn)品原液（800U/L）進(jìn)行稀釋，稀釋成400U/L，200U/L，100U/L，50U/L，25U/L五個梯度，每個梯度做2孔檢測OD值取均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。然后將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品按每孔50μl加兩孔，在樣品檢測孔按40μl樣品稀釋液+10μl樣品（樣品最終稀釋度為5倍），將標(biāo)準(zhǔn)品及待檢樣品加入包被有抗人vWF抗體的酶標(biāo)板后，37℃孵育30min；洗板機(jī)洗板5次后，每孔中加入50μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的vWF抗體，37℃孵育30min；再次用洗板機(jī)洗板5次后，每孔加入50μl顯色液A+50μl顯色液B，37℃顯色10min；每孔中加入50μl硫酸終止液終止反應(yīng)；最后在酶標(biāo)儀上450nm處，以空白孔調(diào)零，測定各孔吸光值。利用系列標(biāo)準(zhǔn)品繪制吸光值和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式將樣品孔的吸光值代入其中，計(jì)算出相應(yīng)的vWF濃度（標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及樣品濃度的計(jì)算均在Excel 2007中進(jìn)行）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組樣本比較采用雙樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 vWF標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 vWF標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 實(shí)驗(yàn)組和對照組結(jié)果

2.2.1 測得的VWF因子活性的結(jié)果為對照組262.40+20.35%，而配對的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果為211.72+ 16.32%。具體見表1。

2.2.2 結(jié)果經(jīng)兩個配對樣本的t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示sig=0.000，小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間有顯著性差異。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組VWF因子活性

3 討論

該對照組的VWF因子活性檢測結(jié)果為262.40+20.35%，姚根宏報(bào)道[3]的冷沉淀中VWF因子水平情況支持本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組結(jié)果為211.72+16.32%，對比對照組的結(jié)果顯示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)配對t檢驗(yàn)處理后，顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明新鮮冰凍血漿經(jīng)病毒滅活工藝處理后制備的冷沉淀，對vWF因子有顯著性的影響，降低的幅度大約為19%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，病毒滅活工藝對不穩(wěn)定的凝血因子Ⅷ因子的降低約為30%，纖維蛋白原會影響更明顯，并且會隨著時間的推移，活性會下降明顯；同時影響冷沉淀質(zhì)量因素也有許多，制備冷沉淀的過程實(shí)際是對凝血因子的一種濃縮過程[5]。

兩個配對樣本的t檢驗(yàn)結(jié)果顯示sig=0.000，小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間有顯著性差異。也就是說病毒滅活血漿制備病毒滅活冷沉淀，測定血管性血友病因子可以作為一項(xiàng)指標(biāo)作為病毒滅活冷沉淀的參考指標(biāo)，有一定的實(shí)際意義。據(jù)上海血液中心邱穎婕等報(bào)道，為確保病毒滅活冷沉淀凝血因子的質(zhì)量，不能對其進(jìn)行亞甲藍(lán)的濾除[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，使用冷沉淀凝血因子制備儀對保證冷沉淀質(zhì)量起了重要的作用，此設(shè)備值得在血站系統(tǒng)推廣應(yīng)用[7]。但由于VWF因子活性項(xiàng)目沒有相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，只能作為參考指標(biāo)。

血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓巨核細(xì)胞合成的一種多結(jié)構(gòu)域、多功能糖蛋白，在1期和2期止血中發(fā)揮重要作用[8-10]。通過對新鮮冰凍血漿病毒滅活病毒后制備冷沉淀對vWF因子活性的變化分析，間接反映了病毒滅活冷沉淀的質(zhì)量水平，作為一項(xiàng)指標(biāo)質(zhì)量參考指標(biāo)，有一定的實(shí)際意義。但還需加大實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量及由于人血管性血友病因子檢測試劑盒僅供科研使用，試劑的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性方面還有待深究。

[1]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB18469-2012.全血及成分血質(zhì)量要求[S].2012.

[2]馮秋斌，王艷紅，趙蘇丹，等.病毒滅活冷沉淀的外用研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥，2015，1237(24)：3792-3795.

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[4]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB18467-2011.獻(xiàn)血者健康檢查要求[S].2011.

[5]易中梅，王紅蘋，李晨晨，等.全血手工制備濃縮血小板后的血漿再制備冷沉淀的質(zhì)量評價[J].中國輸血雜志，2013，26（2）：117-120.

[6]章懌，邱穎婕，近魏名，等.冷沉淀制備時間對凝血因子的影響[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2013，15（2）：169-170.

[7]邱穎婕，徐忠，徐蓓，等.病毒滅活冷沉淀制備過程中濾除亞甲藍(lán)對凝血因子的影響[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2016，1016(4)：413-415. [8]肖樂宇.冷沉淀凝血因子制備儀制備冷沉淀的質(zhì)量評價[J].中國輸血雜志，2016，29（1）：96-97.

[9]李雪美，江淼，趙益明.血管性血友病因子的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013；21（3）：801-804.

[10]張媛，郭智，何學(xué)鵬，等.血管性血友病因子研究進(jìn)展[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2010，24(11)：1045-1047.

R554+.1

A

1674-1129(2017)01-0122-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.042

2016-10-10；

2016-11-24)

廣東省深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃社會公益（醫(yī)療衛(wèi)生類）立項(xiàng)項(xiàng)目，立項(xiàng)編號為：2015322