生姜枯萎病致病菌的鑒定與生物藥劑篩選

范天宇 朱書(shū)興 繆才凌 楊秋華 李鑫 孫向成 黃科

摘要 ［目的］探明生姜幼苗枯萎病致病菌與生物藥劑篩選。［方法］通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定與ITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，并進(jìn)行回接與生物防治試驗(yàn)。［結(jié)果］菌株zj1在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形、乳白色，分生孢子鐮刀狀；基于ITS構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，菌株zj1鑒定為Fusarium graminearum；致病菌回接生姜幼苗后，引發(fā)生姜葉片失綠，與田間原發(fā)病癥一致。F.graminearum在10～30 ℃均能生長(zhǎng)，在 25～30 ℃生長(zhǎng)效果較好；殺菌劑春雷霉素與農(nóng)用鏈霉素對(duì)致病菌均有毒力，EC50分別為15.08與343.32 mg/L，盆栽試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)防效為55.78%與51.23%。［結(jié)論］引起重慶榮昌生姜枯萎病的致病菌是禾谷鐮刀菌，有效成分6%春雷霉素和72%農(nóng)用鏈霉素均能對(duì)禾谷鐮刀菌有很好的防治效果。

關(guān)鍵詞 生姜；枯萎??；禾谷鐮刀桿菌；生物藥劑

中圖分類號(hào) S 436.32? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2023）12-0124-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.029

Identification and Biological Control of the Pathogens of Leaves Yellows in Ginger

FAN Tian-yu1，2，ZHU? Shu-xing1，2，MIAO? Cai-ling1，2 et al

（1.College of Biology and Food Engineering，Chongqing Three Gorge University， Chongqing 404120;2.College of Landscape Architecture and Life Science（Institute of Special Plants），Chongqing University of Arts & Sciences，Chongqing 402160）

Abstract ［Objective］To explore pathogens of Fusarium wilt of ginger seedlings and screen biological agents.［Method］Morphological identification and ITS multi-gene phylogenetic analysis were used to identify the species of pathogens.Furthermore，pathogens inoculation and prevention tests were also performed.［Result］The morphological results showed the colony of pathogens was round，milky white on PDA medium and the macroconidiums were sickle shape.The strain of zj1 was identified as Fusarium graminearum based on the evolutionary tree constructed by its ITS gene sequences.The leaves were chlorisis，which was similar with symptoms in filed after ginger seedlings inoculated by pathogen spores suspension.On top of that，F(xiàn).graminearum proliferated from 10 to 30 ℃and the best proliferation temperature was both on 25 and 30 ℃.Both kasugamycin and streptomycin biocides had virulence effect on F.graminearum and the value of EC50 was 15.08 and 343.32 mg/L，respectively.Meanwhile the relative controlling effect of kasugamycin and streptomycin arrived 55.78% and 51.23%.respectively in greenhouse pot test.［Conclusion］F.graminearum was the cause agent of ginger Fusarium wilt in Rongchang.Effective ingredients of 6% Kasugamycin and 72%? streptomycin biocides were effective prevention on F.graminearum.

Key words Ginger;Fusarium wilt;F.graminearum;Biological agents

基金項(xiàng)目 重慶市人力資源和社會(huì)保障局項(xiàng)目“基于“魯中大姜” 新品種應(yīng)用的鄉(xiāng)村振興實(shí)用人才培訓(xùn)”（2021-388-4）。

作者簡(jiǎn)介 范天宇（1994—），女，四川達(dá)州人，碩士研究生，研究方向：食品加工。 *通信作者，副教授，博士，從事經(jīng)濟(jì)植物栽培與病害綠色防控研究。

收稿日期 2022-12-09

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是藥食同源植物。生姜無(wú)性繁殖過(guò)程中易累積大量細(xì)菌、真菌、蟲(chóng)卵等致病微生物，導(dǎo)致生姜在儲(chǔ)藏、生產(chǎn)過(guò)程中易發(fā)生腐爛、細(xì)菌性枯萎、葉斑等病癥［1-2］。生姜枯萎病的主要致病菌是鐮刀桿菌（Fusarium spp），其病癥是生姜葉緣發(fā)黃、卷曲，并逐漸擴(kuò)展到整個(gè)葉片［3-4］。鐮刀桿菌通過(guò)種傳（seed-born）和土傳（soil-born）在宿根中不斷累積，在生姜繁殖時(shí)發(fā)生病癥，新生幼芽黃萎、無(wú)活力甚至壞死［5-6］。鐮刀桿菌（Fusarium spp.）是重要的植物病原菌，寄主范圍廣，還能引起其他寄主發(fā)生萎蔫、根腐、穗腐、莖腐等病害［7-8］。

長(zhǎng)江上游的四川東部、重慶等地是生姜主要栽培區(qū)，在調(diào)查該區(qū)域生姜病害時(shí)發(fā)現(xiàn)生姜出芽后，葉緣發(fā)黃、卷曲，植株缺乏活力，發(fā)育遲緩，隨著病癥加深，整葉失綠、黃化，病癥嚴(yán)重的葉片枯萎，植株頂端枯死，給當(dāng)?shù)亟r(nóng)造成嚴(yán)重?fù)p失。為查明重慶生姜葉黃病的致病原因，筆者從病癥植株中分離、鑒定潛在的致病菌，并通過(guò)回接試驗(yàn)檢測(cè)其致病力，然后篩選常用的生物藥劑，旨在為生姜枯萎病的綠色防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與純化

枯萎病癥生姜葉片采集自榮昌區(qū)盤(pán)龍鎮(zhèn)生姜主栽培區(qū)。病癥樣品用清水沖洗，去除表面污漬，在病、健交界處剪取2～3 mm長(zhǎng)的病組織，然后用無(wú)菌水沖洗2 min，重復(fù)3次，用0.6% NaClO浸泡3 min，用無(wú)菌水沖洗5 min，重復(fù)3次，經(jīng)無(wú)菌濾紙吸干，移至PDA固體培養(yǎng)基（100 g馬鈴薯濾液， 葡萄糖 10 g， 瓊脂粉 12 g），25 ℃培養(yǎng)5 d，每天觀察并記錄菌落形態(tài)。純化菌落編號(hào)并在PDA平板連續(xù)培養(yǎng)3代，純化菌株儲(chǔ)藏于終濃度15 %的甘油中-80 ℃保存。

1.2 菌株的致病性鑒定

生姜種植于40 cm×40 cm 營(yíng)養(yǎng)缽中，發(fā)育60 d 后，植株高度約31 cm，約8 片真葉。生姜發(fā)育過(guò)程中使用有效成分43%的福菌·肟菌酯（氟吡菌酰胺21.5%，肟菌酯21.5%）1 500倍稀釋噴霧，接種前15 d，停止用藥。純化菌株置于PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)7 d，制備濃度為105 CFU/mL的孢子懸液，噴霧接種于盆栽生姜葉片。噴霧后，每天觀察生姜發(fā)育情況，每間隔5 d 統(tǒng)計(jì)植株發(fā)病率與病情指數(shù)。病株分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［6］執(zhí)行。0級(jí)為健康植株，葉片無(wú)病癥；1級(jí)為葉片10%以下區(qū)域出現(xiàn)黃化；2級(jí)為葉片25 %以下區(qū)域出現(xiàn)黃化；3級(jí)為葉片50 %以下區(qū)域出現(xiàn)黃化；4級(jí)為葉片75 %以下區(qū)域出現(xiàn)黃化；5級(jí)為葉片75%以上區(qū)域出現(xiàn)黃枯、壞死。病情指數(shù) =（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)別葉數(shù)）/（檢查總?cè)~片數(shù)×5）×100。

1.3 菌株ITS序列分析

提取病原菌總DNA并以其為模板，真菌通用引物ITSl （5′-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3′）;ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTAT- TGATATGC-3′）為引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增病原菌ITS核酸片段，引物由上海生物有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：總體積為25 μL，引物ITS1/ITS4 0.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2.5 μL，10×PCR Buffer（含MgCl2 25 mmol/L） 2.5 μL，DNA模板1.0 μL，TaqDNA酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，擴(kuò)增條件以標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增條件為準(zhǔn)。利用軟件對(duì)擴(kuò)增后的ITS序列，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性分析，用ClustalX1.83與MEGA5［9］軟件采用Neighbor-Jonining［10］法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以更直觀地表示其同源關(guān)系。尖孢鐮刀桿菌（F.oxysporum，MH911386.1）作為外群。

1.4 溫度對(duì)F.graminearum生長(zhǎng)特性的影響

取活化后長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株，用直徑8 mm的打孔器將菌落接種到PDA平板培養(yǎng)基中央，每個(gè)平板接1塊菌餅，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別放置于（10±1）、（15±1）、（20±1）、（25±1）、（30±1）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天用垂直十字交叉法測(cè)量菌落直徑，最后取平均值［11］。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后測(cè)量得出的菌落直徑減去菌餅的直徑即為菌落的直徑，菌落直徑再除以天數(shù)即是菌絲每天的生長(zhǎng)速度。菌落生長(zhǎng)速率=（菌落直徑-菌餅直徑）/天數(shù)［12］。

1.5 殺菌劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制試驗(yàn)

選擇田間常用的6%春雷霉素和72%農(nóng)用鏈霉素（華北制藥股份有限公司），并采用菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定法［13-14］檢測(cè)2種生物殺菌劑對(duì)致病菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率。在50 ℃的PDA培養(yǎng)基中加入春雷霉素或農(nóng)用鏈霉素，以不加藥劑的平板作為對(duì)照，并在PDA培養(yǎng)基中加入60 μg/mL的氨芐青霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。春雷素的濃度分別為6、12、18、24 mg/L；農(nóng)用鏈霉素的濃度分別為33.6、100.8、168.0、235.2 mg/L。用直徑8 mm的打孔器將菌落接種到不同濃度的春雷霉素和農(nóng)用鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。2 d 后，得到不同大小的菌落，用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，并計(jì)算抑菌率，抑菌率=（空白對(duì)照菌絲-8）-（藥劑菌絲-8）/（空白對(duì)照菌絲-8）。將抑菌率換算成抑制概率值，將抑制概率值作為因變量（y），藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換為10為底的對(duì)數(shù)值為自變量（x），做回歸直線，求出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并運(yùn)用最小二乘法計(jì)算EC50［15-16］。

1.6 盆栽防效試驗(yàn)

生姜宿根50 g種植于36? cm×40 cm 營(yíng)養(yǎng)袋60 d后，植株發(fā)育高度約32 cm，萌發(fā)7～8葉。 制備105 CFU/mL 的孢子懸液侵染生姜幼苗，對(duì)照組用無(wú)菌清水噴霧。噴霧5 d后，使用濃度為18 mg/L的春雷霉素與340 mg/ L的農(nóng)用鏈霉素素每間隔7 d 用藥一次，連續(xù)用藥3次，在最后1次用藥14 d后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算相對(duì)防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%［17-18］。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用Excel軟件和Origin2019b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

從葉片失綠、黃化，植株缺乏活力，發(fā)育遲緩的植株葉片（圖1A）中分離致病菌（zj1）。致病菌（zj1）在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，形成圓形、乳白色菌落（圖1B），菌落背面產(chǎn)生紅色色素，菌絲稀松，絨毛狀，分生孢子鐮刀狀，多數(shù)分生孢子3隔，產(chǎn)生球形孢囊（圖1C）。

2.2 ITS序列分析結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后進(jìn)行基因組的測(cè)序再用軟件進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，供試菌株的ITS序列（ 2248417 ）與F.graminearum（MH681145.1）的同源性達(dá)99.5%。然后通過(guò)MEGA 4.1 軟件中的neighbor joining方法（鄰接法）建立菌株zj1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），根據(jù)菌落形態(tài)檢測(cè)及ITS序列分析分離、鑒定的菌株zj1為禾谷鐮刀菌屬（F.graminearum）。

2.3 溫度對(duì)F.graminearum 生長(zhǎng)的影響 將F.graminearum在10、15、20、25、30 ℃時(shí)培養(yǎng)，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速率，F(xiàn).graminearum在10、15和20 ℃生長(zhǎng)相對(duì)較慢；在25、30 ℃時(shí)生長(zhǎng)顯著增加，在檢測(cè)的5 d內(nèi)，菌落在第3天生長(zhǎng)速率最快，在30 ℃生長(zhǎng)速率1.44 cm/d高于25 ℃的1.31 cm/d（P<0.05）；在第4天和第5天生長(zhǎng)速率下降，此時(shí)，F(xiàn).graminearum生長(zhǎng)速率差異不顯著（P>0.05）（圖3）。

2.4 回接試驗(yàn)致病性

將致病菌回接盆栽生姜幼苗，侵染早期5 d后，部分葉片出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，隨著侵染加深，病灶擴(kuò)展，病癥加深，葉片上形成多個(gè)病斑，葉緣卷曲、整個(gè)葉片枯黃、部分葉片掉落，接種無(wú)菌清水生姜葉片，未見(jiàn)葉片枯黃發(fā)病癥狀（圖4A）。在調(diào)查40 d內(nèi)發(fā)病率和病情指數(shù)均增加；發(fā)病率由5 d 的8.5%增加到40 d的97.7%，發(fā)病率在10～35 d顯著增加，35～40 d變化不顯著（圖4B）。病情指數(shù)由5 d 的5.0增加到40 d的36.5，病情指數(shù)在10 ～30 d顯著增加，30～40 d變化不大（圖4C）。對(duì)病癥中致病菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)，形態(tài)特征鑒定為鐮刀桿菌。

2.5 生物藥劑對(duì)F.graminearum的毒力與防效

采用的2種生物殺菌劑對(duì)禾谷鐮刀桿菌平板毒力抑制試驗(yàn)表明，6%春雷霉素和72%農(nóng)用鏈霉素對(duì)F.graminearum均有毒力（表1），6%春雷霉素的EC50為15.08 mg/L。72%農(nóng)用鏈霉素的EC50為343.32 mg/L。盆栽藥效試驗(yàn)表明，18 mg/L 6%春雷霉素對(duì)盆栽60 d生姜幼苗葉黃病的防效比340 mg/L 72%農(nóng)用鏈霉素的防效高（P<0.05），分別為55.78%和51.23%。

3 結(jié)論與討論

該研究從生姜枯萎病葉片中分離了1株禾谷鐮刀桿菌，禾谷鐮刀桿菌不僅能引起谷類作物如小麥赤霉病、玉米莖腐病，還能產(chǎn)生大量毒素威脅人畜健康［19-21］。因此，研究生姜枯萎病的病原菌及其生物藥劑篩選既可促進(jìn)生姜安全生產(chǎn)，又可提高食品安全。

溫度對(duì)F.graminearum的生長(zhǎng)特性研究表明，在10～30 ℃培養(yǎng)條件下，F(xiàn).graminearum的生長(zhǎng)速度隨溫度的升高而加快，25與30 ℃生長(zhǎng)速率較快，這與茄病鐮刀桿菌的生長(zhǎng)特性一致［22］。而川東與重慶沿江地區(qū)生姜幼苗葉黃病的發(fā)病時(shí)期為4月下旬至5月下旬，此時(shí)該區(qū)域日間溫度均高于25 ℃，較有利于F.graminearum 在生姜中的繁殖累積。研究表明F.graminearum 在生姜宿根中累積越冬，次年栽培發(fā)育的早期，鐮刀菌在生姜體內(nèi)繁殖侵染，造成植株畸形、黃葉、枯萎［5］。

F.graminearum 噴霧回接生姜幼苗后，5 d 后出現(xiàn)病癥，25 d 后，隨著病癥的加深，發(fā)病率和病情指數(shù)顯著上升，葉片開(kāi)始出現(xiàn)枯萎、凋落。這一病癥與生姜細(xì)菌性枯萎病快速發(fā)病的特點(diǎn)不一致，生姜細(xì)菌性枯萎病暴發(fā)具有突發(fā)、快速的特點(diǎn)［23-24］，與鐮刀菌引發(fā)生姜的病癥及發(fā)病周期一致［5-6］。

春雷霉素和農(nóng)用鏈霉素是防控真菌病害的常用生物藥劑，2種殺菌劑對(duì)F.graminearum 的菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用，同時(shí)2種殺菌劑在安全用藥范圍內(nèi)對(duì)生姜葉黃病的盆栽防效達(dá)50%以上，可作為備選殺菌劑在田間交替使用，替代化學(xué)殺菌劑防治生姜枯萎病，達(dá)到病害綠色防控的目的，實(shí)現(xiàn)生姜的安全生產(chǎn)。

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