玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)研究

胡昕

摘? ? 要：種子純度檢測(cè)是產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)的中心，檢驗(yàn)種子純度是促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展和維護(hù)種業(yè)秩序的必經(jīng)之路。隨著信息化發(fā)展，種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)不斷更新優(yōu)化，如何使用現(xiàn)代化純度快速分子檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證玉米種子純度是值得思考的問(wèn)題。文章闡述了機(jī)器視覺(jué)技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、DNA快速提取法，分析了玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用方法，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果得出玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)步驟以及梯度要求。

關(guān)鍵詞：種子純度；快速分子檢測(cè)；檢測(cè)技術(shù)

文章編號(hào)：1005-2690（2023）10-0031-03? ? ? ?中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：S513? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

作者簡(jiǎn)介：胡 昕（1973—），男，漢族，山東濟(jì)南人，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)檗r(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)測(cè)。

種子是農(nóng)業(yè)發(fā)展的核心，是保證國(guó)家糧食安全、促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。2020年中央經(jīng)濟(jì)工作會(huì)議提出要充分解決種子質(zhì)量問(wèn)題和耕地問(wèn)題?；谥甘揪瘢b定種子質(zhì)量問(wèn)題是保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要工作之一。新時(shí)代背景下，保證玉米種子純度真實(shí)性是控制玉米種子質(zhì)量的關(guān)鍵，如何借助現(xiàn)代化新農(nóng)業(yè)技術(shù)和基因鑒定技術(shù)鑒定玉米種子純度是核心問(wèn)題之一。

文章分析了現(xiàn)代化新農(nóng)業(yè)技術(shù)、種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合玉米種子特性進(jìn)行種子純度快速分子檢測(cè)試驗(yàn)，以期可以為促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展貢獻(xiàn)一份力量。

1 玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)述

1.1 機(jī)械視覺(jué)技術(shù)

機(jī)械視覺(jué)技術(shù)是一種包含了人工智能、神經(jīng)生物學(xué)、自然科學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、圖片信息處理、模型認(rèn)知等眾多方面的高新技術(shù)[1]。該技術(shù)主要利用計(jì)算機(jī)模仿人類(lèi)視覺(jué)功能，從客觀的圖象中抓取視覺(jué)感覺(jué)信號(hào)，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行信息處理、分析，用于試驗(yàn)測(cè)試、試驗(yàn)控制。機(jī)械視覺(jué)技術(shù)的發(fā)展取代了人工觀察測(cè)量方式，改善了投放于市場(chǎng)的產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)獲取大量信息，并對(duì)信息進(jìn)行自動(dòng)化處理，可用于設(shè)計(jì)信息、信息集成、信息加工等[2]。因此，在自動(dòng)化制造流程中，機(jī)械視覺(jué)技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于工況監(jiān)測(cè)、成品檢驗(yàn)、品質(zhì)管理等環(huán)節(jié)。

1.2 分子標(biāo)記技術(shù)

理解分子標(biāo)記技術(shù)概念需要從分子標(biāo)記入手，廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)，狹義的分子標(biāo)記是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段[3]。分子標(biāo)記技術(shù)是檢測(cè)分子DNA序列或蛋白質(zhì)，并反映生物個(gè)體DNA組差異的技術(shù)?，F(xiàn)階段，分子標(biāo)記技術(shù)主要分為隨機(jī)引物PCR標(biāo)記技術(shù)、特異引物PCR標(biāo)記技術(shù)等。隨機(jī)引物PCR標(biāo)記技術(shù)試驗(yàn)選擇的單核苷酸序列是隨機(jī)的，但由于試驗(yàn)DNA范圍不明，因此通過(guò)該方法在擴(kuò)增的DNA范圍上形成的多型性分子變化結(jié)果主要來(lái)自于模板DNA擴(kuò)增范圍上的融合部位的堿基順序變化情況，該技術(shù)試驗(yàn)結(jié)果中顯隱性差異體現(xiàn)了不同試驗(yàn)基因組所在區(qū)域的擴(kuò)增查結(jié)果的差異。特異引物PCR標(biāo)記技術(shù)根據(jù)試驗(yàn)中已知序列的DNA區(qū)段進(jìn)行標(biāo)記，可在常規(guī)PCR重復(fù)性溫度下擴(kuò)增，然后對(duì)試驗(yàn)的DNA特異區(qū)段進(jìn)行多態(tài)化研究[4]。

1.3 DNA快速提取方法

傳統(tǒng)DNA提取方法大多以種子幼芽或葉片為試驗(yàn)材料提取DNA，但是此類(lèi)技術(shù)操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，極易交叉感染，污染試驗(yàn)環(huán)境，影響試驗(yàn)結(jié)果?；诖?，此次試驗(yàn)在搜集對(duì)比了多種DNA快速提取方法后選擇使用多重PCR技術(shù)。多重PCR又名多重引物PCR或復(fù)合PCR，指在一個(gè)常規(guī)PCR的反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)添加多對(duì)引物，擴(kuò)增出多種擴(kuò)增片段的PCR反應(yīng)體系，其反應(yīng)機(jī)理、反應(yīng)試劑以及反應(yīng)過(guò)程均與常規(guī)PCR基本相同。與傳統(tǒng)DNA快速提取方法相比，多重PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)高效，目前已被廣泛應(yīng)用于DNA檢測(cè)領(lǐng)域。

2 玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用

2.1 試驗(yàn)材料

玉米種子：100粒。緩沖液：0.5 mol / L NaCl、100 mol/L Tris-HCL（pH值8.0）、50 mol/L MEDTA、5％SDS、1％PVP（pH值8.0）、1×TE 緩沖液（Tris-EDTA）、1×TBE（Tris-硼酸）緩沖液、5×TBE（Tris-硼酸）緩沖液、TEMED（四甲基乙二胺）、Acr-Bis（丙烯酰胺＋甲叉丙烯酰胺復(fù)合液）、溴化乙錠（EB）。SDS 法提取液：酚氯仿異戊醇溶液、氯仿異戊醇溶液、異丙醇溶液、乙醇溶液等。電泳試劑：1.2％瓊脂糖、9％PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)玉米種子純度檢測(cè)要求與玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)功能對(duì)試驗(yàn)作出相應(yīng)設(shè)計(jì)。此次試驗(yàn)主要使用DNA快速提取法、通用多重PCR技術(shù)。其中DNA快速提取法分為以下2種：一是參照CTAB法、SDS法提取試驗(yàn)樣本；二是使用快速法提取試驗(yàn)樣本DNA。完成DNA快速提取法后得出DNA濃度和完整性檢測(cè)結(jié)果，使用通用多重PCR技術(shù)鑒定DNA因子并得出試驗(yàn)結(jié)果[5]。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 DNA快速提取法

1）SDS法提取DNA。將樣本磨碎后稱(chēng)取0.1 g放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL 65 ℃ DNA提取緩沖液后充分混合（緩沖液成分：0.5 mol NaCl、100 mol Tris-HCl pH值8.0、50 mol MEDTA、5％SDS、1％PVP）；室溫下（26 ℃），1 000 g離心10 min，取上清1.5 mL溶液加入等體積酚氯仿異戊醇后充分混合；室溫下（26 ℃），1 000 g離心10 min，取上清1.5 mL溶液加入等體積氯仿異戊醇后充分混合；室溫下（26 ℃），1 000 g離心10 min，取上清1.5 mL溶液加入等體積異丙醇后充分混合；室溫下（26 ℃），1 000 g離心10 min，取上清1.5 mL溶液加入15μL 70％乙醇清洗沉淀，清洗2次；除去乙醇容易，晾干沉淀；加50μL 1×TE緩沖液，溶解DNA后置于冷凍室保存，冷凍室溫度為-20 ℃[6]。

2）CTAB法提取DNA，包括DNA完整性電泳檢測(cè)與DNA質(zhì)量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。一是DNA完整性電泳檢測(cè)。根據(jù)試驗(yàn)樣本質(zhì)量確定膠量，取1.2％瓊脂糖，1×TBE作為溶劑，將溶液放置于微波爐中使其溶解后取出放涼。待溶液溫度在60 ℃以下后加入適量EB，將膠倒至膠盒之中，待凝固后取出放入電泳槽；參照上述步驟進(jìn)行濃度加樣；用移液器將膠體加到樣孔之中；接通電源，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。二是DNA質(zhì)量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。從樣本中篩選出多態(tài)性高、特異性好的樣本，選取phi 0.6用于檢測(cè)。隨后PCR擴(kuò)增檢測(cè)采用20μL擴(kuò)增體系，其中上下游引物各0.5μL；用9％聚丙烯酰胺凝膠溶液檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.3.2 PAGE檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

完成DNA質(zhì)量PCR擴(kuò)增檢測(cè)試驗(yàn)操作后需要使用PAGE檢測(cè)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體試驗(yàn)步驟如下。溶液配制（9％聚丙烯酰胺凝膠溶液），使用50 mL蒸餾水、20 mL 5×TBE、30 mL 30％Acr-Bis、750μL10％過(guò)硫酸銨、75μL四甲基乙二胺；將配制度完成的溶液灌入玻璃制膠板并觀察是否有氣泡產(chǎn)生，待溶液凝固后取出梳架，取出樣孔內(nèi)殘留液體，待樣孔干燥后放置于電泳槽上并注入1×TBE電極緩沖液；吸取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物于樣孔內(nèi)；用150 V電泳穩(wěn)壓至凝膠底部；電泳結(jié)束后取出凝膠，放置于去離子水中清洗，清洗完成后加入AgNO3溶液并進(jìn)行3 min染色，染色完成后加入去離子水清洗，清洗完成后加入顯影液，輕輕搖晃至條帶清晰后即可進(jìn)行清洗；完成清洗后進(jìn)行讀帶，進(jìn)而分析目標(biāo)帶情況。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 提取液濃度及體積對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響

本次試驗(yàn)分別取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.20、0.30 mol/L 12個(gè)濃度梯度和200、400、600、800、1 000μL 5個(gè)體積梯度進(jìn)行試驗(yàn)，分析試驗(yàn)結(jié)果。

1）對(duì)DNA完整性的影響。取10μL試驗(yàn)樣本用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA的完整性，得出提取液濃度及體積對(duì)玉米種子DNA提取質(zhì)量的影響結(jié)果。從體積梯度分析，200μL體積和400μL體積的試驗(yàn)樣本均呈現(xiàn)出明顯、清晰的主帶效果，但是400μL的主帶效果圖弱于200μL主帶效果。相比之前，600μL的樣品主帶效果更弱，但是仍能觀察到部分成像。800、1 000μL的樣品主帶效果幾乎不明顯。從濃度梯度分析，12個(gè)濃度梯度呈現(xiàn)呈“不明顯—明顯—不明顯”的趨勢(shì)，其中0.01 mol/L濃度梯度的成像效果幾乎不明顯，0.2 mol/L濃度梯度后的成像逐漸明顯，0.05、0.06、0.07 mol/L濃度梯度的成像效果最為明顯。綜合提取液濃度和體積的成像結(jié)果，0.05～0.07 mol/L濃度梯度、200～600μL體積梯度為最佳提取液參數(shù)。

2）對(duì)PCR產(chǎn)物的影響。取試驗(yàn)樣本2μL行PCR擴(kuò)增，用9％ PAGE檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，驗(yàn)證提取液濃度和體積對(duì)玉米種子PCR產(chǎn)物的影響，得出試驗(yàn)結(jié)果效果。從濃度梯度分析，0.01、0.02 mol/L的樣品有較弱的目標(biāo)帶成像，0.03、0.04、0.05 mol/L的樣品有稍明顯的目標(biāo)帶成像，0.06～0.20 mol/L有明顯的目標(biāo)帶成像。從體積梯度分析，200～1 000μL溶液均有明顯、清晰的目標(biāo)帶成像。因此，綜合濃度梯度成像結(jié)果以及體積梯度成像結(jié)果得出，0.03～0.20 mol/L的濃度梯度、200～1 000μL體積梯度的溶液均滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增要求。

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響

根據(jù)提取液濃度和體積對(duì)玉米種子DNA完整性和PCR產(chǎn)物的影響結(jié)果，采用最佳提取液濃度梯度和最佳體積梯度試驗(yàn)，使用0.05 mol/L濃度梯度、500μL積梯度進(jìn)行試驗(yàn)，在1、5、10、20、40、60、720、1 440、2 160、2 880、4 320 min觀察后混合提取液，得出試驗(yàn)結(jié)果成像。

1）對(duì)DNA完整性的影響。取10μL試驗(yàn)樣品用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得出提取時(shí)間對(duì)DNA完整性有影響，得出提取時(shí)間對(duì)玉米種子DNA完整性的影響試驗(yàn)結(jié)果。1～20 min的樣品成像較弱且差異變化不明顯；40 min后亮度逐漸增加，各個(gè)梯度之間差異變化逐漸明顯；60 min后樣品有明顯、清晰的成像帶；60～2 880 min樣品差異變化不明顯；4 320 min的樣品成像呈發(fā)亮狀態(tài)。因此，綜合成像結(jié)果，為了確保玉米種子DNA完整性，將提取時(shí)間控制在1～2 880 min為佳。

2）對(duì)PCR產(chǎn)物的影響。取2μL試驗(yàn)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物試驗(yàn)驗(yàn)證，用9％ PAGE檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，研究提取時(shí)間對(duì)PCR產(chǎn)物的影響，得出提取時(shí)間對(duì)玉米種子PCR產(chǎn)物的影響試驗(yàn)結(jié)果。樣品提取時(shí)間在1～2 880 min成像不明顯，各個(gè)區(qū)間差異變化不顯著；樣品提取時(shí)間在4 320 min后呈現(xiàn)出的成像帶亮度開(kāi)始減弱，逐漸趨近于無(wú)光亮狀態(tài)。因此，綜合成像結(jié)果，提取時(shí)間在1～2 880 min的玉米種子樣本均可滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增要求。

2.5 試驗(yàn)結(jié)論

在玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中，充分利用DNA快速提取法和PCR技術(shù)，綜合2種技術(shù)的試驗(yàn)成像效果確定玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)實(shí)施步驟如下。隨機(jī)選取玉米種子樣本，將玉米種子切樣、取樣后放置于離心管中，加入500μL積梯度、0.2 mol/L濃度梯度提取液；對(duì)樣品加入PCR擴(kuò)增提取液后混合樣品，完整取樣。每個(gè)樣品取2μL于多重PCR擴(kuò)增；采用多重通用PCR技術(shù)20μL增體系和9％ PAGE檢測(cè)多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變化。

綜合試驗(yàn)步驟、采樣結(jié)果、試驗(yàn)結(jié)果得出，玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)適用于玉米種子純度檢測(cè)，通用性良好、檢測(cè)結(jié)果顯著。

3 結(jié)束語(yǔ)

玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)中機(jī)械視覺(jué)技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、DNA快速提取法分別能夠應(yīng)用于玉米種子外觀觀察、DNA序列標(biāo)記、DNA檢測(cè)，是快速檢測(cè)玉米種子純度的重要技術(shù)。

此次試驗(yàn)主要綜合DNA快速提取法和PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)玉米種子純度進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為2種技術(shù)能夠快速、有效驗(yàn)證玉米種子純度。將2種技術(shù)綜合應(yīng)用于玉米種子純度檢測(cè)，能夠有效提高玉米種子純度鑒定效率，保障玉米種子真實(shí)性和純度，助力農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、種業(yè)市場(chǎng)規(guī)范化、可持續(xù)發(fā)展。

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