實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件下麥穗魚Pseudorasbora parvaeDNA濃度與生物量相關(guān)性曲線的擬合與比較分析

郭娟 曾燏 鄭羽晨 趙雨雙 鐘清

摘? ? 要：為探究實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件下麥穗魚（Pseudorasbora parva）eDNA濃度與其生物量間關(guān)系，根據(jù)麥穗魚線粒體COⅠ基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR），得到qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用線性、指數(shù)和對(duì)數(shù)3種模型對(duì)麥穗魚生物量與eDNA濃度的相關(guān)性曲線進(jìn)行擬合和比較分析。結(jié)果表明：基于CO I基因設(shè)計(jì)的引物對(duì)麥穗魚DNA具有特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增效率為90.94%；qPCR的閾值循環(huán)數(shù)（Cycle threshold，Ct值）與已知濃度或拷貝數(shù)的樣品（標(biāo)準(zhǔn)品）間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.995 2），說明標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)與Ct值之間相關(guān)的可信度較好。通過3種曲線進(jìn)一步擬合比較分析顯示：線性模型為麥穗魚生物量與eDNA濃度間的最佳擬合模型，其R2高達(dá)0.933 8，y=72.087x+81.978。這表明在本試驗(yàn)條件下，eDNA濃度與麥穗魚生物量呈正相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：eDNA濃度；生物量；麥穗魚

中圖分類號(hào)：S932? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.06.008

Abstract：In order to investigate the relationship between the environmental DNA （eDNA） concentration and biomass of Pseudorasbora parva reared in the laboratory， specific primers were designed based on the mitochondrial COI gene sequence of Pseudorasbora parva. The qPCR standard curve was obtained through quantitative real-time PCR （qPCR）. The correlation curves between Pseudorasbora parva biomass and eDNA concentration were fitted and compared using linear， exponential， and logarithmic models. The results showed that the primers designed based on the COI gene specifically amplified Pseudorasbora parva DNA， with an amplification efficiency of 90.94%. The cycle threshold （Ct） value of qPCR showed a good linear relationship with known concentration or copy number of samples （standards） （R2=0.995 2）， indicating a good credibility of the correlation between the copy number of standards and the Ct value. Further fitting and comparison of the three curves revealed that the linear model was the best fit for the relationship between Pseudorasbora parva biomass and eDNA concentration， with a high R2 of 0.933 8 and y=72.087x+81.978. This indicates a positive correlation between eDNA concentration and Pseudorasbora parva biomass under the experimental conditions.

Key words： eDNA concentration; biomass; Pseudorasbora parva

監(jiān)測(cè)魚類生物量是入侵物種種群管理工作的重要組成部分，然而，直接使用傳統(tǒng)捕撈調(diào)查方法會(huì)破壞水生生態(tài)環(huán)境，也難以準(zhǔn)確評(píng)估個(gè)體小和群眾數(shù)量少的物種生物量[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，eDNA技術(shù)作為一種新的監(jiān)測(cè)方法，憑借便捷、環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)在珍稀瀕危物種和入侵物種監(jiān)測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[2-3]。環(huán)境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指從環(huán)境樣本中（水、土壤、空氣等）提取到的總DNA[4]。目前，eDNA主要運(yùn)用于4個(gè)方面。一是檢測(cè)目標(biāo)物種的有無，通過檢測(cè)水體中是否有目標(biāo)物種釋放的DNA來判斷水體中是否有該物種的存在[5]；二是生物多樣性評(píng)估，高通量測(cè)序的出現(xiàn)使得從一個(gè)eDNA樣品中同時(shí)檢測(cè)多種生物的DNA成為可能，現(xiàn)階段已被用于水生生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的檢測(cè)[6-7]；三是魚類分布，利用eDNA方法可以識(shí)別出一個(gè)特定物種在一個(gè)大區(qū)域（如海灣和大湖泊）上的分布，明確目標(biāo)物種分布將有助于管理和監(jiān)測(cè)海洋和大型湖泊中的魚類[8]；四是生物量估算，對(duì)目標(biāo)生物的生物量進(jìn)行調(diào)查是水生生物資源監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容[9-10]。

近年來我國(guó)開展了大量與eDNA技術(shù)相關(guān)的研究，但主要運(yùn)用的是檢測(cè)目標(biāo)物種、生物多樣性評(píng)估和魚類分布3個(gè)方面，關(guān)于eDNA技術(shù)評(píng)估生物量的研究較少[1]。魚類資源的評(píng)估不僅要定性地評(píng)估魚類多樣性，也要定量地評(píng)估生物量，實(shí)現(xiàn)這些將有助于eDNA技術(shù)成為管理魚類資源的一般工具[11]。生物量是指某一特定時(shí)刻單位空間的個(gè)體數(shù)、質(zhì)量，如何科學(xué)地開展生物量評(píng)估是魚類種群生態(tài)的一個(gè)重難點(diǎn)問題，準(zhǔn)確的生物量評(píng)估有助于魚類資源的合理開發(fā)利用和外來入侵物種的有效管理，建立eDNA濃度與生物量間關(guān)系是基于eDNA技術(shù)探究野生魚類生物量的重要依據(jù)[12]。

麥穗魚（Pseudorasbora parva）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鮈亞科（Gobioninae）、麥穗魚屬（Pseudorasbora）。麥穗魚主要以浮游動(dòng)物為食，分布廣，世代周期短，繁殖能力和適應(yīng)能力強(qiáng)，已成功入侵全球超過30個(gè)國(guó)家[13-14]。當(dāng)前通過傳統(tǒng)種群生態(tài)學(xué)方法難以準(zhǔn)確的評(píng)估麥穗魚種群的生物量，eDNA方法的大量應(yīng)用使得這一難題的順利解決成為了可能。目前關(guān)于麥穗魚的研究主要包括麥穗魚養(yǎng)殖、生活史和疾病等方面，而基于eDNA評(píng)估麥穗魚生物量未見報(bào)道[15-17]。

因此，本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室人工養(yǎng)殖的麥穗魚為目標(biāo)物種，通過設(shè)計(jì)麥穗魚的特異性引物，實(shí)時(shí)熒光定量PCR建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，采用線性、指數(shù)和對(duì)數(shù)3種模型對(duì)麥穗魚生物量與eDNA濃度的相關(guān)性曲線進(jìn)行了擬合和分析。研究結(jié)果有助于建立實(shí)驗(yàn)室條件下eDNA濃度與其生物量的最佳相關(guān)性曲線，為eDNA濃度評(píng)估野外麥穗魚生物量提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 特異性引物設(shè)計(jì)

針對(duì)麥穗魚的線粒體CO I基因設(shè)計(jì)特異性引物。在GenBank上檢索麥穗魚的基因序列，根據(jù)已發(fā)表的麥穗魚序列（基因序列號(hào)MT805712.1），利用相關(guān)軟件Primer-Blast設(shè)計(jì)引物，使用引物分別對(duì)麥穗魚DNA和12種鮈亞科魚類DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR試驗(yàn)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增后對(duì)PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)，DNA的膠回收、連接和測(cè)序，最后比對(duì)測(cè)序結(jié)果是否是目的基因。

1.2 eDNA采集和提取

在5個(gè)魚缸（50 cm×45 cm×40 cm）中加入50 L曝氣水，溫度為5 ℃。分別在5個(gè)缸中放置0、2、4、8、16尾麥穗魚，平均每尾質(zhì)量4.5 g。試驗(yàn)期為7 d，7 d內(nèi)不喂食，不換水。在試驗(yàn)第7天采集樣本，使用消毒殺菌后的EP管取養(yǎng)殖缸表層水50 mL，每個(gè)缸做3次重復(fù)，設(shè)置1個(gè)蒸餾水陰性對(duì)照，共計(jì)18個(gè)樣本。采樣后立即用直徑為50 mm，孔徑為0.45 μm的混合纖維素濾膜進(jìn)行無菌真空抽濾裝置抽濾，每次抽濾之前用無菌水沖洗過濾漏斗，防止交叉污染。抽濾完成后，用無菌鑷子將每張濾膜單獨(dú)卷起來，放入5 mL 的離心管中并做好標(biāo)記，按照DNeasy PowerWater kit（Qiagen，Germany）試劑盒的操作方法提取eDNA，將收集到的DNA放置-20 ℃保存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TOYOBO的SYBR Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒和 Applied Biosystems StepOneTM qPCR儀。將10 μL的2× SYBR real-time PCR premixture和0.4 μL的正向引物與0.4 μL反向引物（10 μmol·L-1）混合為mixture A體系，上機(jī)體系為：8 μL的mixture A和8 μL模板稀釋樣。試驗(yàn)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，在每次運(yùn)行退火之后采集熒光信號(hào)。首先，將目標(biāo)片段用Taq酶擴(kuò)增，連接T載體，裝入感受態(tài)細(xì)菌，挑單克隆，搖菌，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)片段正確后，在潔凈工作臺(tái)進(jìn)行質(zhì)粒小抽和定量。將標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋，形成 101～107 copies·μL-1的7個(gè)梯度，制作熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次試驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照品。為了確定PCR反應(yīng)效率和定量未知樣本，計(jì)算并繪制熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 擬合曲線模型的選擇

選用線性、指數(shù)和對(duì)數(shù)3種曲線模型進(jìn)行擬合，利用R軟件繪制曲線圖，通過比較不同模型曲線擬合度R2的值大小來確定最佳擬合曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA分析

從水體樣本提取的 eDNA和魚類肌肉中提取的 DNA 濃度分別為20～89? ng·μL-1和376～719 ng·μL-1。提取 eDNA 的OD值（A260/A280）為1.60～2.04，肌肉 DNA 的OD值為 1.79～2.13。盡管有部分eDNA濃度較低，但總體DNA的OD值能滿足后續(xù)試驗(yàn)需求。陰性對(duì)照組和空白組均無擴(kuò)增。

2.2 麥穗魚引物和標(biāo)準(zhǔn)曲線

得到麥穗魚引物F：CCGATTCTCATTGGGGGCTT，

R：CCTGCGAGAGGGGGATAAAC，片段長(zhǎng)度188 bp。將麥穗魚eDNA擴(kuò)增得到的PCR原液進(jìn)行凝膠電泳并測(cè)序，目的條帶單一且明亮清晰，其測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上經(jīng)過 Blast 比對(duì)分析，其結(jié)果顯示與原始序列片段同源性達(dá) 100%。如圖1所示，目的條帶清晰明亮且無非特異性擴(kuò)增。

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，閾值循環(huán)數(shù)（Cycle threshold，Ct值）平均值分別為4.83、12.75、14.53、20.09、24.56（圖2）。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板濃度越高，Ct值越??；起始模板量濃度越低，Ct值越大。系統(tǒng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與擴(kuò)增Ct值生成麥穗魚引物擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線用于確定實(shí)驗(yàn)中未知樣本的目標(biāo)DNA的相對(duì)或絕對(duì)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Ct=-3.56 x+38.89，（x為樣本中麥穗魚 eDNA 稀釋濃度的對(duì)數(shù)值），曲線的相關(guān)系數(shù) R2=0.995 2，擴(kuò)增效率為90.94%，說明標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)與Ct值之間相關(guān)的可信度較好。反應(yīng)完成后，得到的熔解曲線如圖2所示。熔解曲線是指隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。本研究得到的溶解曲線出現(xiàn)單峰，說明反應(yīng)具有特異性。

2.3 麥穗魚eDNA濃度與生物量相關(guān)性曲線

根據(jù)公式Ct=-KlogX0+b計(jì)算可得（X0表示拷貝數(shù)，k 表示標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，b 表示標(biāo)準(zhǔn)曲線截距），0、2、4、8、16尾麥穗魚養(yǎng)殖缸中得到的平均拷貝數(shù)分別為0、275.56、354.03、596.67、1 264.28個(gè)·L-1。采用線性、對(duì)數(shù)和對(duì)數(shù)3種模型對(duì)麥穗魚生物量與eDNA濃度的相關(guān)性曲線進(jìn)行了擬合。結(jié)果如圖3所示，3種曲線的擬合分析結(jié)果顯示：線性模型為麥穗魚生物量與eDNA濃度的最佳擬合模型，y = 72.087x+81.978，其R2高達(dá)0.933 8。eDNA濃度與麥穗魚生物量呈正相關(guān)性，即麥穗魚生物量越大，eDNA濃度也會(huì)越高。

3 討論與結(jié)論

3.1 引物和標(biāo)準(zhǔn)曲線

麥穗魚eDNA擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳并測(cè)序，目的條帶單一且明亮清晰，測(cè)序結(jié)果為麥穗魚。這說明基于COI基因設(shè)計(jì)的引物對(duì)麥穗魚DNA具有特異性擴(kuò)增，且其擴(kuò)增效率為90.94%，引物特異性好。

本研究得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Ct=- 3.56 x + 38.89，曲線的相關(guān)系數(shù) R2=0.995 2，說明Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)與Ct值之間相關(guān)的可信度較好。結(jié)果表明，本研究在此麥穗魚eDNA濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠正確反映出麥穗魚目的基因的擴(kuò)增。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的SYBR Green Ⅰ熒光染料法其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低。不足之處是染料與DNA雙鏈分子的結(jié)合是非特異性的，它可以和反應(yīng)體系中的所有DNA分子結(jié)合，易受到非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的影響，使定量結(jié)果不可靠[18]。解決這一問題可以借助熔解曲線分析法來區(qū)分非特異性產(chǎn)物和引物二聚體而排除假陽性[19]。熔解曲線如出現(xiàn)多峰，證明反應(yīng)非特異或存在二聚體。本研究得到的熔解曲線中出現(xiàn)單峰（圖2），說明定量結(jié)果是特異可靠的。

3.2 eDNA濃度與生物量相關(guān)性曲線

Takahara[9]等發(fā)現(xiàn)eDNA 濃度在第6天至第9天之間變化不大，得出eDNA濃度在第6天趨于穩(wěn)定的結(jié)論。因此，本研究在試驗(yàn)第7天進(jìn)行采樣時(shí)，eDNA濃度差異不明顯，得到的eDNA濃度與生物量的關(guān)系更為可靠。

通過3種曲線進(jìn)一步擬合比較分析顯示：線性模型為麥穗魚生物量與eDNA濃度間的最佳擬合模型，其R2高達(dá)0.933 8，y=72.087x+81.978，表明在本試驗(yàn)條件下，eDNA濃度與麥穗魚生物量呈正相關(guān)性。雖然在小型水族箱和人工池塘中eDNA濃度與生物量存在線性關(guān)系[20-22]，但在湖泊河流中eDNA與生物量的關(guān)系會(huì)更加的復(fù)雜，可能是線性或非線性。閆卉果[9]等在養(yǎng)殖桶中得到巖原鯉eDNA濃度與其生物量為線性關(guān)系；Coulter[23]等在河流中發(fā)現(xiàn)鰱魚eDNA濃度與其生物量存在非線性關(guān)系。本研究的擬合分析結(jié)果顯示：線性模型為麥穗魚生物量與eDNA濃度的最佳擬合模型，y=72.087x+81.978，其R2高達(dá)0.933 8，研究結(jié)果與養(yǎng)殖桶條件下目標(biāo)魚eDNA濃度與其生物量間關(guān)系一致。

3.3 eDNA濃度的影響因素

eDNA技術(shù)作為一種新的監(jiān)測(cè)方法，具有便捷、環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)。eDNA產(chǎn)生后能在水體中保留一段時(shí)間，直至被降解不能檢測(cè)[24]。因此，它被認(rèn)為提供了近似的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。eDNA的降解與產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致eDNA濃度發(fā)生變化，但eDNA濃度的變化受多種因素的影響，進(jìn)而影響eDNA濃度與其生物量的關(guān)系，主要包括生物因素和非生物因素2個(gè)方面。

生物因素方面體現(xiàn)在魚類的生物量會(huì)影響eDNA濃度。Michael等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大馬哈魚的密度越高，eDNA濃度也越高；Lacoursière等[26]研究表明，在同一溫度條件下，生物量越大，eDNA濃度越高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖缸中麥穗魚的增加（0、2、4、8、16尾），eDNA濃度也呈正相關(guān)的線性關(guān)系。除生物因素外，其他非生物因素也會(huì)影響eDNA濃度，主要包括溫度、紫外線、pH等外界環(huán)境因素[27-30]。因此，在實(shí)際野外工作中需要綜合考慮各種因素，建立麥穗魚生物量和eDNA濃度關(guān)系模型才能準(zhǔn)確評(píng)估麥穗魚的種群生物量。

本研究通過麥穗魚線粒體COI基因設(shè)計(jì)了麥穗魚特異性引物，F(xiàn)：CCGATTCTCATTGGGGGCTT，R： CCTGCGAGAGGGGGATAAAC，片段長(zhǎng)度188 bp。確定了實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖麥穗魚eDNA濃度與其生物量的最佳擬合模型為線性模型，y=72.087x+81.978，R2=0.933 8。eDNA濃度與麥穗魚生物量呈正相關(guān)性。

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