血小板-白細胞聚集體及其在川崎病發(fā)病中的研究進展

高立超 綜述 龔方戚 審校

（浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心，浙江杭州 310052）

血小板是源自巨核細胞系的無核細胞，長期以來一直被認為僅負責凝血和纖溶過程。然而，最近數(shù)據(jù)表明血小板也是炎癥反應中的效應細胞，是免疫應答的重要組成部分［1］。血小板儲存和釋放多種生物活性物質(zhì)，如生長因子、細胞因子和趨化因子等，影響免疫系統(tǒng)的各個組成部分，從而調(diào)節(jié)免疫應答和炎癥反應。當感染或創(chuàng)傷后，血小板與活化的內(nèi)皮細胞相互作用，進而導致血小板活化［2］，該過程導致血小板的形狀從光滑的橢圓形變?yōu)槎啻痰那蛐危?］，功能也隨之發(fā)生變化，開始分泌各種生物活性物質(zhì)，最終演化為不可逆的活化狀態(tài)?；罨难“鍟c各類白細胞相互作用，觸發(fā)細胞間信號轉(zhuǎn)導，導致血栓形成和炎癥介質(zhì)的大量合成［4］。在多種血栓性疾病和炎癥性疾病中發(fā)現(xiàn)血液中血小板-白細胞聚集體（platelet leukocyte aggregates，PLAs）水平升高［5-6］。血液循環(huán)或局部炎癥部位的PLAs 被認為可能是多種血栓、炎癥性疾病的標志物，可用于評估血栓形成風險和疾病進展情況［7］。PLAs 在心血管疾病中同樣具有重要意義［8］，已有研究表明川崎病（Kawasaki disease，KD）患者中PLAs 水平顯著升高。該文綜述了最新文獻，探討血小板-白細胞聚集體形成機制、作用、檢測方法及其在KD 發(fā)病中的相關作用，為KD 發(fā)病機制的研究提供新的思路。

1 PLAs的形成

血小板活化是PLAs 形成的先決條件，血小板-白細胞的初始結(jié)合由血小板P-選擇素（又稱CD62P） 和白細胞P-選擇素糖蛋白配體1 （Pselectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1） 介導（圖1）［9］。CD62P是一種黏附分子，血小板是其主要來源，CD62P最初位于血小板α顆粒膜上，當血小板活化后CD62P 在血小板質(zhì)膜上表達，隨后CD62P通過PSGL-1交聯(lián)血小板和白細胞，而PSGL-1在中性粒細胞、單核細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞和內(nèi)皮細胞的表面表達［10］。除了與PSGL-1 結(jié)合，CD62P 還能與S 位點受體激酶（S-locus receptor kinase，SRK）家族的酪氨酸激酶、磷脂酰肌醇3激酶、肌動蛋白和細胞骨架蛋白分子級聯(lián)激活白細胞，最終誘導β2 整合素巨噬細胞分化抗原-1（macrophage-1 antigen，Mac-1）的活化［11］。Mac-1則進一步與血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰbα（GP Ⅰbα）、血小板GP Ⅱb/Ⅲa相互作用［12］，后者介導白細胞和血小板之間的相互作用［13］。當血小板活化后，白細胞分化抗原40 配體（cluster of differentiation 40 ligand，CD40L）轉(zhuǎn)移到血小板表面，與內(nèi)皮細胞、單核細胞上白細胞分化抗原40（cluster of differentiation 40，CD40）作用，從而促進血小板與白細胞的相互作用［14］。

2 PLAs的作用

血小板和白細胞的直接相互作用可導致可溶性介質(zhì)的靶向釋放和血小板-白細胞的相互激活［15］。PLAs在血栓形成中起重要作用［16］，其可能通過增加組織因子表達導致纖維蛋白沉積［17］。血小板-白細胞相互作用促進白細胞募集和外滲至炎癥部位［18］，促進白細胞釋放促炎介質(zhì)、活性氧爆發(fā)、吞噬作用、釋放中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）［19-21］，同時還可以在某些病理條件下抑制炎癥［1，22］。在動脈粥樣硬化中，血小板與中性粒細胞、單核細胞和樹突狀細胞的相互作用促進白細胞外滲和泡沫細胞形成，從而加速了動脈粥樣硬化的形成。白細胞反過來也可調(diào)節(jié)血小板，導致血小板破壞增強或產(chǎn)生增加［23-24］。

PLAs可誘導多種促炎因子表達增加［25-26］，如單核細胞趨化蛋白1、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8、IL-12、巨噬細胞炎癥蛋白1β、干擾素α 等。然而，PLAs 還具有負反饋機制，抑制局部炎癥［27］。血小板與單核細胞的相互作用會推動單核細胞向抗炎表型發(fā)展，降低促炎因子IL-1β、IL-12 和IL-6 水平，提高IL-10 水平［28］。而血小板與中性粒細胞的相互作用也可導致抗炎作用，PLAs促進脂氧素A4的產(chǎn)生，從而下調(diào)中性粒細胞的黏附和外滲［29］。

3 PLAs的分類

不同的白細胞亞群可以與血小板相互作用形成PLAs，從而產(chǎn)生各種作用［30］。由于血小板CD62P 對不同類型白細胞PSGL-1 的親和力不同［31］，血小板優(yōu)先結(jié)合單核細胞，而與淋巴細胞的親和力最低。

3.1 血小板-中性粒細胞聚集體

中性粒細胞上的PSGL-1 或Mac-1 與血小板CD62P的結(jié)合會引發(fā)中性粒細胞向內(nèi)皮遷移，通過CD40 與血小板衍生的可溶性CD40L 結(jié)合形成血小板- 中性粒細胞聚集體（platelet neutrophil aggregates，PNAs），是血管內(nèi)遷移的先決條件［26］。血小板進一步參與NET 的形成，Toll 樣受體4激活的血小板與中性粒細胞結(jié)合，黏附在內(nèi)皮細胞上，啟動了NET 形成［32］，導致釋放中性粒細胞DNA，從而誘捕細菌。此外，PNAs 會導致中性粒細胞脫顆粒和釋放IL-1β、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9），還能促進脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠模型中髓過氧化物酶的形成［29］，但Cleary 等［33］發(fā)現(xiàn)小鼠吸入脂多糖后，阻斷PSGL-1、CD62P 或耗盡血液中性粒細胞并不能影響肺部血小板的募集。

3.2 血小板-單核細胞聚集體

循環(huán)單核細胞根據(jù)其CD14 和CD16 表達可分為3 個亞組：（1）經(jīng)典單核細胞（CD14++CD16-），高表達與吞噬作用相關的基因并產(chǎn)生活性氧；（2）非經(jīng)典單核細胞（CD14+CD16++），在血管巡邏和監(jiān)視中發(fā)揮作用并參與自身免疫性疾病；（3）中間單核細胞（CD14++CD16+），不僅釋放促炎的IL-1β 和TNF-α，也和抗炎因子IL-10 的產(chǎn)生有關［34］。血小板優(yōu)先與CD16+單核細胞結(jié)合，可能誘導經(jīng)典單核細胞向中間單核細胞轉(zhuǎn)換，Hottz 等［35］發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒感染的危重患者中血小板-單核細胞聚集體（platelet monocyte aggregates，PMAs）形成增加，同時確定了高CD16 和低人類白細胞DR 抗原表達的炎性單核細胞亞組與血小板相互作用。

3.3 其他PLAs

血小板和淋巴細胞相互作用的報道相對較少。血小板-淋巴細胞相互作用參與T 細胞表型極化，如輔助性T細胞1［4］和調(diào)節(jié)性T細胞［36］。CD62P和淋巴細胞PSGL-1 結(jié)合可導致CD11a 聚集，通過與細胞間黏附分子1結(jié)合增強白細胞黏附，支持淋巴細胞向外周淋巴結(jié)高內(nèi)皮小靜脈的歸巢［29］。CD40與CD40L 相互作用是血小板誘導的適應性免疫反應的重要介質(zhì)，CD40在成熟B細胞、部分輔助性T細胞和細胞毒性T 淋巴細胞上表達［37］。通過CD40L，血小板可以直接誘導B細胞產(chǎn)生抗體并介導生發(fā)中心的形成。

血小板與樹突狀細胞通過CD62P/PSGL-1 及隨后的Mac-1相互聚集，啟動單核細胞的交叉呈遞和樹突狀細胞分化［38］。和血小板與其他白細胞亞群的作用類似，血小板也可以減少樹突狀細胞的活化，如血小板能夠抑制樹突狀細胞的促炎特性，甚至可能誘導其抗炎表型，從而降低對T細胞的啟動能力［39］。

4 PLAs的檢測方法

目前流式細胞術和顯微鏡技術是檢測PLAs 的主要手段［7］。這些技術相互補充，不僅用于研究PLAs 對白細胞亞群和分子的影響，還可以明確其在組織中的位置、相互作用及功能的動態(tài)變化。

4.1 流式細胞術

流式細胞術是檢測PLAs 的首選方法，它是一種快速且靈敏的技術，可以同時分析同一樣本中的血小板活化和PLAs的形成［40］，并可對稀有白細胞亞群進行評估。對于基本的PLAs 分析，只需要標記血小板特異性抗體和泛白細胞特異性抗體［41］，前向散射光和側(cè)向散射光可以基本區(qū)分中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞。當需要更準確地區(qū)分各白細胞亞群時，常需加入特異性抗體［7］，如CD66b（人）或Ly6G（小鼠）標記中性粒細胞，CD14、CD16、CD64（人）或CD115、Ly6C（小鼠）標記單核細胞，CD3、CD4、CD8（小鼠和人）標記T 細胞，CD19（人）或CD19、B220（小鼠）標記B 細胞，CD56（人）或NK1.1（小鼠）標記NK細胞。

4.2 顯微鏡技術測量組織內(nèi)的靜態(tài)和動態(tài)PLAs

對冷凍或石蠟包埋的組織切片行組織化學和免疫熒光檢測可提供有關血小板募集和PLAs 在眾多組織器官微環(huán)境中的位置信息［7］。當與共聚焦或電子顯微鏡相結(jié)合時，可提供高分辨率的圖像以定位PLAs 的位置。然而，組織切片只能提供靜態(tài)終點分析，并不能完全模擬復雜的動態(tài)行為。隨著體內(nèi)成像技術（如活體顯微鏡）的發(fā)展，現(xiàn)在可以長時間追蹤活體動物體內(nèi)不同器官中的細胞［7，42］，這有利于分析血小板和白細胞之間動態(tài)的相互作用，如持續(xù)時間和行為變化［43］。

4.3 微流控檢測

微流控檢測是另一種基于顯微鏡的實時研究血小板-白細胞相互作用的方法［44］。分離的細胞或全血通過涂有固定化蛋白質(zhì)或細胞的腔室進行灌注，從而可以精確控制細胞輸入。類似于活體免疫熒光成像，PLAs 可以通過細胞跟蹤器或特異性抗體實現(xiàn)可視化。微流控檢測雖然不如體內(nèi)成像技術那么接近生理，但當條件明確的情況下，它能夠低成本地實時分析血小板-白細胞的相互作用。

5 抗血小板藥物對PLAs的影響

常用的抗血小板治療包括環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）抑制劑阿司匹林和二磷酸腺苷受體P2Y12 抑制劑如氯吡格雷、普拉格雷和替格瑞洛等。阿司匹林和P2Y12 抑制劑均能減弱血小板與白細胞的相互作用，不僅影響血小板聚集和血栓形成，還能調(diào)節(jié)白細胞募集和效應功能，使抗血小板藥物能夠作用于多種疾?。?5-46］。

5.1 阿司匹林

阿司匹林通過抑制COX-1 和COX-2 來阻止前列腺素的合成，從而抑制血小板生成血栓素A2（thromboxane A2，TxA2），而TxA2 是血小板活化的重要介質(zhì)［47］。低劑量阿司匹林可大幅減弱血小板中的COX-1 酶活性［48］，而高劑量阿司匹林通過干擾其他細胞中構建型COX-1 和誘導型COX-2 的表達發(fā)揮抗炎作用［49］。抑制TxA2 合成會阻斷CD40L釋放，從而減少血小板誘導的活性氧生成和趨化因子CXCL7 釋放，以及血小板介導的單核細胞和中性粒細胞的活化、募集、黏附和外滲［29，50］。

5.2 P2Y12抑制劑

在血小板活化過程中，P2Y12信號是其中一個重要的自分泌和旁分泌反饋回路，在血小板活化放大中具有核心作用［51］。氯吡格雷可提高內(nèi)皮一氧化氮的生物利用度并抑制血小板活化、血小板脫顆粒、PLAs 形成、炎性細胞因子和組織因子的表達，在內(nèi)毒素血癥中發(fā)揮重要作用［52］。與阿司匹林相比，氯吡格雷在減少動脈粥樣硬化性血管疾病中PLAs 的形成方面更有效［53］。有研究顯示，在接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的患者中，普拉格雷對降低二磷酸腺苷刺激的血小板-白細胞的相互作用強于氯吡格雷［54］。替格瑞洛是一類新型抗血小板藥物，可有效抑制血小板P2Y12 受體，并通過抑制平衡型核苷轉(zhuǎn)運體1 抑制細胞對腺苷的攝?。?5］。由于替格瑞洛對血小板P2Y12 受體和平衡型核苷轉(zhuǎn)運體1的雙重抑制，替格瑞洛對炎癥的影響可能是復雜的。在肺炎患者中，替格瑞洛減少了PLAs 的形成及IL-6 的表達，接受替格瑞洛治療后，患者肺功能獲得了改善，降低了氧依賴［56］。

6 KD中PLAs的作用

KD 患兒常常表現(xiàn)為血小板增多，體內(nèi)血小板活化，表現(xiàn)出異型黏附性，可與白細胞、紅細胞聚集，多個臨床研究發(fā)現(xiàn)血小板增多、活化患者更易合并冠狀動脈損傷［57-58］。KD 中循環(huán)因子誘導血小板聚集和5-羥色胺釋放，導致血小板增多，而血小板衍生的血管活性物質(zhì)會增加血管通透性并促進免疫復合物在組織中的進一步沉積，其中血小板衍生微?？赡軙苯哟碳ぶ行粤＜毎?、單核細胞和血管內(nèi)皮細胞，從而導致組織因子的表達并增加血栓形成的風險。使用阿司匹林后KD患者的血小板衍生微粒水平顯著下降，當停用阿司匹林后其水平會再次上升［57］。

目前PLAs 在KD 發(fā)病中的研究較少，僅有幾個單中心臨床研究報告了PLAs 可能與KD 及其冠狀動脈損傷有關。Ueno 等［59］研究了KD 患者中PNAs 水平，發(fā)現(xiàn)KD 患兒中PNAs 水平明顯高于細菌感染患者和正常志愿者，且冠狀動脈異?；颊叩腜NAs水平顯著高于無冠狀動脈異常者，同時發(fā)現(xiàn)與單獨使用靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治療相比，接受IVIG 聯(lián)合潑尼松龍治療的患者PNAs 顯著降低。Vignesh等［60］研究了KD患者中PMAs水平，發(fā)現(xiàn)與同年齡同性別的發(fā)熱和健康對照組相比，KD兒童隊列中PMAs 比例顯著升高。KD 中PLAs 增高的機制尚不明確，據(jù)推測當血小板活化后其表面CD62P 表達升高，與白細胞上的PSGL-1結(jié)合導致PLAs的初始聚集，其后通過CD40L/CD40、Mac-1/GP Ⅰbα等相互作用，導致PLAs的進一步增加。PLAs形成后介導TNF-α、IL-6、MMP-9等介質(zhì)的靶向釋放和白細胞-血小板的相互激活，白細胞大量遷移并在血管內(nèi)皮細胞中聚集，進一步導致KD患者的冠狀動脈擴張。已有研究表明，KD 患兒CD62P 的表達升高［58］。Arora 等［57］研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，KD患兒的可溶性CD40L水平較高。

7 抗血小板藥物在KD中的應用

抗血小板藥物在KD治療期間占據(jù)極其重要的作用，薈萃分析表明IVIG 聯(lián)合阿司匹林能最大程度地防止KD后發(fā)生冠狀動脈異常［61］，但大劑量阿司匹林在冠狀動脈保護方面并不優(yōu)于低劑量阿司匹林［62］，甚至最近的一項大型薈萃分析發(fā)現(xiàn)急性期應用低劑量阿司匹林的患者較大劑量阿司匹林，冠狀動脈損傷概率更低［63］。目前對中型及以上冠狀動脈瘤（Z 值≥5），建議應用阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷等抗血小板，多項研究已證實氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林對KD合并冠狀動脈瘤患兒的抗血栓治療安全有效［64-65］。Zhang 等［66］報道了在阿司匹林基礎上加用氯吡格雷能更有效地降低炎癥因子IL-2受體和IL-10，并建議在血小板持續(xù)升高時應更早加用氯吡格雷。成人中應用氯吡格雷存在部分抵抗現(xiàn)象，北京的一項前瞻性單中心研究證實了攜帶CYP2C19功能缺失等位基因、低水平高密度脂蛋白和高水平低密度脂蛋白是我國KD患兒氯吡格雷抵抗的獨立危險因素［67］。

8 小結(jié)

近來研究表明，血小板不僅在止血、血栓形成中起作用，其在炎癥和免疫應答中也發(fā)揮了重要作用，通過與白細胞的相互作用，血小板可以重新編程免疫網(wǎng)絡，在多種疾病中調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應，包括KD。已有少量研究表明KD 中存在血小板活化及PLAs的形成，但鑒于PLAs作用的復雜性，后續(xù)仍需更多的研究，以明確PLAs 在KD發(fā)病及其冠狀動脈損傷中的具體作用，這可能成為KD研究的新方向。