基于HMGB1/NF-κB/NLRP3軸探討褪黑素對氧誘導視網膜病變的保護作用

褚芳芳 趙巖松 趙玉澤 白晨 肖培倫 王曉莉 于樹娜 蔣吉英

（1.濰坊醫(yī)學院人體解剖學教研室，山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科中心，山東濰坊 261031；3.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學影像學院，山東濰坊 261053）

早產兒視網膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）是一種以視網膜新生血管為特征的視網膜病變，隨著早產兒存活率的提高，ROP 的發(fā)病率也顯著提高，已成為兒童致盲的主要原因之一［1］。然而，ROP 的發(fā)病機制尚不明確，缺乏明確的治療措施。因此，探索ROP 的相關機制及新的治療方法具有重要的臨床意義。氧誘導視網膜病變（oxygen-induced retinopathy，OIR）新生小鼠模型可以較好地模擬高氧刺激后視網膜血管閉塞和新生血管的形成，是研究ROP 的經典模型。以往的研究多側重于血管新生，近年來的研究顯示，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體介導的炎癥也參與了OIR的病理進程，提示抑制炎癥反應亦可作為ROP 的治療靶點。褪黑素（melatonin，Mel）是一種具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用的內分泌激素［2-3］，已有研究證實Mel對ROP、視網膜缺血再灌注損傷等眼部疾病有保護作用［4-5］。由此推測Mel 可能通過抑制NLRP3 炎性小體的活化減輕OIR。為驗證上述假說，本研究通過建立OIR 新生小鼠模型，觀察HMGB1/NF-κB/NLRP3 軸在Mel 對新生小鼠OIR 保護作用中的影響，以期為Mel在ROP中的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及模型建立

健康成年C57BL/6J 小鼠20 只（山東省濟南朋悅實驗動物繁育有限公司），體重22～25 g，SPF級，常規(guī)鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，雄鼠與雌鼠按1∶3 比例合籠。取27 只自然分娩喂養(yǎng)至出生后第7 天（postnatal day 7，P7）的新生小鼠進行實驗，雌雄不限，體重3.13±0.16 g。將P7新生小鼠隨機分為對照組（n=9）、模型組（OIR 組，n=9）與Mel 處理組（OIR+Mel 組，n=9）。參照文獻［6］建立OIR 小鼠模型，即將哺乳母鼠與P7 新生小鼠置于氧氣體積分數為75%±2%的氧艙（DYC-Ⅰ，武漢七〇一研究所）內飼養(yǎng)5 d，隔日更換母鼠和墊料、加食換水。于P12時移出氧箱，置于常氧環(huán)境繼續(xù)飼養(yǎng)5 d。對照組小鼠在常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。Mel 處理組從P12 開始，每日上午8:00 腹腔注射Mel 10 mg/kg（美國Sigma公司）［4］，連續(xù)5 d，于P17時處死動物、取材。

1.2 視網膜鋪片法觀察視網膜新生血管

P17小鼠乙醚麻醉后固定，暴露心臟，剪開右心耳，從左心室依次注入0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛溶液、5%明膠墨汁（上海晨光墨汁），以口、鼻、四肢呈黑色為灌注成功，冰上靜置30 min使明膠墨汁凝固后取眼，置于4%多聚甲醛固定2 h。在體視顯微鏡下沿角鞏膜緣剪開眼球，分離鞏膜和脈絡膜，去除晶狀體、殘存的玻璃體及色素，以視神經乳頭為中心沿鼻上、鼻下、顳上、顳下4個方向將視網膜剪為四葉草形狀，置于準備好的載玻片上，甘油明膠封片，研究級正置光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 標本的采集及處理

P17小鼠乙醚麻醉下摘取眼球，去除角膜及晶狀體，用4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（厚4 μm），每3～5 張切片取1 張切片，分別行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色及免疫熒光染色；取眼后保留視網膜組織，稱重，行髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測。

1.4 HE染色

石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，采用HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）染色，蘇木素染核10 min，鹽酸酒精分化30 s，去離子水沖洗，伊紅胞漿染色2 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察視網膜結構、計數突破內界膜的血管內皮細胞核數。

1.5 免疫熒光染色

石蠟切片，脫蠟水化、抗原修復、0.3%TritonX-100透膜、5% BSA-PBS封閉2 h，分別加入兔抗NLRP3（1∶100，英國Affinity公司）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）（1∶200，北京博奧森生物技術有限公司）、半胱氨酸蛋白水解酶-1 前體（procaspase-1）（1∶100，武漢愛博泰克生物科技有限公司）、剪切的半胱氨酸蛋白水解酶-1（cleavedcaspase-1，1∶100，英國Affinity 公司）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β（1∶200，武漢愛博泰克生物科技有限公司）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）（1∶100，上海愛必信生物科技有限公司）、核轉錄因子-κB（neuclear transcription factor kappa B，NF-κB）（1∶100，北京博奧森生物技術有限公司）、淋巴細胞抗原6G（lymphocyte antigen 6G，Ly-6G）（1∶200，美國CST 公司）、褪黑素受體1（melatonin receptor 1，MT1）（1∶50，美國ABBIOTEC公司）和褪黑素受體2（melatonin receptor 2，MT2）（1∶100，英國Affinity 公司）、鼠抗Toll 樣受體4 （Toll-like receptor 4，TLR4）（1∶200，美國Santa 公司）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）（1∶100，美國Santa 公司）一抗，4℃孵育過夜；次日，37℃復溫，PBS 漂洗3 次，滴加Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG或Alexa Fluor 594標記的山羊抗鼠IgG熒光二抗（1∶200，北京中杉金橋生物技術有限公司），37℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次，用含DAPI 的熒光封片劑（美國Santa 公司）封片。正置熒光顯微鏡下進行觀察拍照，并用Image J 軟件進行分析。

圖4 各組小鼠視網膜Ly-6G、TNF-α 免疫熒光染色結果（×400） Ly-6G 為中性粒細胞標志物，Ly-6G+胞漿染色為綠色，TNF-α+胞漿染色為紅色，DAPI+細胞核染為藍色。OIR+Mel組Ly-6G+、TNF-α+表達少于OIR組。［GCL］神經節(jié)細胞層；［INL］內核層；［ONL］外核層。

1.6 比色法檢測MPO活性

將視網膜組織按重量體積比1∶19加勻漿介質制備成5%的組織勻漿，按MPO測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書加入試劑后混勻，60℃水浴10 min后取出，吸取200 μL于96孔板中，立即用分光光度計在450 nm 波長處測量各組的吸光度值。根據說明書提供公式，計算MPO活力。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數±標準差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Mel 對OIR 小鼠視網膜血管新生及視網膜形態(tài)結構的影響

視網膜鋪片結果顯示，OIR組視網膜血管分布被破壞，中央部出現大片無灌注區(qū)，無灌注區(qū)附近出現新生血管，新生血管呈團簇狀，分布紊亂；OIR+Mel 組視網膜的無灌注區(qū)和新生血管數量減少。HE 染色結果顯示，OIR 組視網膜結構排列疏松紊亂，可見細胞丟失和空泡化，內界膜不完整，突出內界膜的新生血管內皮細胞核數（25.17±1.61）較對照組（0.75±0.25）多；OIR+Mel 組視網膜的內界膜基本恢復平滑，偶見細胞出現空泡變性，突出內界膜的新生血管內皮細胞核數（4.25±0.75）較OIR組減少，各組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（F=489.006，P＜0.001）。見圖1。

圖1 各組小鼠視網膜結構和新生血管變化 A：視網膜鋪片結果（光學顯微鏡，×40）。OIR組出現大量無灌注區(qū)和病理性新生血管，OIR+Mel組視網膜的無灌注區(qū)和新生血管數量減少。藍色箭頭指示視網膜的無灌注區(qū)，紅色箭頭指示新生血管。B：蘇木精-伊紅染色結果（×400）。OIR組大量新生血管內皮細胞突出內界膜，OIR+Mel組突出內界膜的新生血管內皮細胞核數減少。箭頭指示突出內界膜的新生血管內皮細胞。［GCL］神經節(jié)細胞層；［INL］內核層；［ONL］外核層；［ILM］內界膜。

2.2 Mel對OIR小鼠視網膜NLRP3炎性小體相關因子表達的影響

免疫熒光染色顯示，對照組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1 和IL-1β 陽性表達少，OIR 組和OIR+Mel 組視網膜神經節(jié)細胞層（ganglion cell layer，GCL）與內核層（inner nuclear layer，INL） 均可見其陽性表達，且OIR 組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1 和IL-1β 陽性表達較對照組顯著升高（P＜0.05），OIR+Mel 組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleavedcaspase-1 和IL-1β 陽性表達較OIR 組減少（P＜0.05）。見圖2、表1。

表1 各組小鼠視網膜NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、IL-1β平均熒光強度比較 （± s，n=3）

表1 各組小鼠視網膜NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、IL-1β平均熒光強度比較 （± s，n=3）

注：a示與對照組比較，P＜0.05；b示與OIR組比較，P＜0.05。［NLRP3］核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3；［ASC］凋亡相關斑點樣蛋白；［pro-caspase-1］半胱氨酸蛋白水解酶-1前體；［cleaved-caspase-1］剪切的半胱氨酸蛋白水解酶-1；［IL-1β］白細胞介素-1β。

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圖3 各組小鼠視網膜HMGB1、TLR4、NF-κB表達的變化（免疫熒光染色，×400） HMGB1+、NF-κB+胞漿染色為綠色，TLR4+胞漿染色為紅色，DAPI+細胞核染為藍色。OIR+Mel 組HMGB1+、NF-κB+、TLR4+表達少于OIR組。［GCL］神經節(jié)細胞層；［INL］內核層；［ONL］外核層。

2.3 Mel對OIR小鼠視網膜HMGB1、TLR4、NFκB表達的影響

免疫熒光染色顯示，對照組HMGB1、TLR4和NF-κB陽性表達較少，OIR組和OIR+Mel組GCL與INL 均可見其陽性表達，OIR+Mel 組HMGB1、TLR4和NF-κB陽性表達低于OIR組（P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 各組小鼠視網膜HMGB1、TLR4、NF-κB平均熒光強度比較 （± s，n=3）

表2 各組小鼠視網膜HMGB1、TLR4、NF-κB平均熒光強度比較 （± s，n=3）

注：a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OIR 組比較，P＜0.05。［HMGB1］高遷移率族蛋白B1；［TLR4］Toll 樣受體4；［NF-κB］核轉錄因子-κB。

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2.4 Mel 對OIR 小鼠中性粒細胞浸潤和促炎因子表達的影響

免疫熒光染色顯示，對照組中性粒細胞標志物Ly-6G 和TNF-α 陽性表達較少，OIR 組和OIR+Mel 組GCL 與INL 均可見Ly-6G、TNF-α 陽性表達，且OIR+Mel 組Ly-6G、TNF-α 陽性表達顯著低于OIR 組（P＜0.05）。MPO 活力檢測結果顯示，與對照組相比，OIR組MPO活力顯著升高，OIR+Mel組較OIR 組MPO 活力降低（均P＜0.05）。見圖4、表3。

表3 各組小鼠視網膜Ly-6G、TNF-α平均熒光強度及MPO活力比較 （± s，n=3）

表3 各組小鼠視網膜Ly-6G、TNF-α平均熒光強度及MPO活力比較 （± s，n=3）

注：a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OIR 組比較，P＜0.05。［Ly-6G］淋巴細胞抗原6G；［TNF-α］腫瘤壞死因子-α；［MPO］髓過氧化物酶。

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2.5 Mel對OIR小鼠Mel受體表達的影響

免疫熒光染色顯示，對照組可見MT1 和MT2的陽性表達主要位于GCL 與INL，OIR 組GCL 與INL 中MT1 和MT2 陽性表達較對照組顯著減少，OIR+Mel組MT1和MT2陽性表達較OIR組增多（均P＜0.05）。見表4、圖5。

表4 各組小鼠視網膜MT1、MT2平均熒光強度比較（± s，n=3）

表4 各組小鼠視網膜MT1、MT2平均熒光強度比較（± s，n=3）

注：a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OIR 組比較，P＜0.05。［MT1］褪黑素受體1；［MT2］褪黑素受體2。

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圖5 各組小鼠視網膜中MT1和MT2表達變化（免疫熒光染色，×400） MT1+、MT2+胞漿染色為綠色，DAPI+細胞核染為藍色。OIR+Mel組MT1+、MT2+表達較OIR組多。［GCL］神經節(jié)細胞層；［INL］內核層；［ONL］外核層。

3 討論

ROP 作為一種新生血管性視網膜疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明，且已有研究證實高氧在誘導ROP 新生血管生成中起著關鍵作用，新生小鼠OIR模型已被廣泛應用于ROP的研究［7］。本研究亦采用經典的Smith 等［6］設計的方法建立新生小鼠OIR模型。視網膜鋪片結果顯示，視網膜血管的正常分布被破壞，中央部出現大片無灌注區(qū)，無灌注區(qū)附近出現病理性新生血管；HE 染色結果顯示，視網膜結構疏松、排列紊亂，內界膜不完整，可見較多的新生血管內皮細胞突破內界膜，均提示OIR模型建立成功。

Mel是松果體分泌的一種內分泌激素，除了調節(jié)晝夜節(jié)律外，還具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及調節(jié)血管生成等多種生物學功能［8］。本實驗室以往的研究已證實Mel對腦缺血再灌注損傷具有保護作用［9-10］。Xu等［4］的研究證實，Mel可通過抑制視網膜血管新生，減輕OIR 小鼠模型中的視網膜損傷。本研究發(fā)現，Mel干預后，視網膜的內界膜基本恢復平整，突出內界膜的新生血管內皮細胞核數減少，病理性新生血管顯著減少，說明Mel可改善OIR新生小鼠視網膜的組織學損傷，對視網膜損傷具有保護作用。

目前的研究認為氧化應激和炎癥反應可能參與了ROP 的發(fā)生發(fā)展，因此推測抑制炎癥反應、清除氧自由基可能減輕OIR誘導的視網膜損傷。在各種視網膜疾病中，損傷相關的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）的釋放被認為是連接細胞死亡和炎癥的重要生物過程，釋放到胞外的DAMPs 通過與模式識別受體結合，如Toll樣受體家族、NOD樣受體家族，進而將損傷信號轉化為分子事件［11］。其中HMGB1是這一過程中的關鍵分子，通過與TLR4 結合，激活NFκB，誘導IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子和趨化因子的產生，這些炎癥因子和趨化因子又可募集大量的中性粒細胞浸潤，使更多細胞死亡，形成炎癥級聯反應，從而加重視網膜損傷［12-14］。本研究結果顯示，HMGB1、TLR4、NF-κB、TNF-α、Ly-6G在OIR組小鼠視網膜的陽性表達及MPO活性較對照組顯著升高，Mel 處理可使之降低。此外，活化的NF-κB 是NLRP3 的上游分子，可調控NLRP3炎性小體的組裝［15-16］，使pro-caspase-1募集到NLRP3-ASC 復合物上，發(fā)生自體的剪切活化，參與IL-1β 的成熟、分泌，而IL-1β 是炎癥反應的重要介質［4，17-18］，提示NLRP3炎性小體在OIR誘導的炎癥反應中充當重要角色。Sui 等［19］的研究證明，OIR模型小鼠中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β 等的表達升高，而NLRP3 的抑制劑（MCC950）使視網膜的新生血管減少、血管滲漏減輕。另有研究顯示，視網膜缺血再灌注誘導的TLR4的表達先于NLRP3炎性小體的活化，并且TLR4的抑制劑吡格列酮可以抑制NLRP3 炎性小體的激活，從而減輕缺血再灌注誘導的視網膜損傷［20-21］。本研究發(fā)現，OIR 組小鼠視網膜NLRP3、ASC、procaspase-1、cleaved-caspase-1和IL-1β的陽性反應強度較對照組顯著升高，Mel處理可使之降低。以上提示Mel可有效減弱小鼠OIR損傷后視網膜的炎癥反應，且Mel可能通過HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抑制OIR 誘導的NLRP3 炎性小體的活化和中性粒細胞浸潤。

Baba等［22］研究證實視網膜、角膜等多種眼部組織中均有MT1 和MT2 的表達；Jiang 等［23］報道，在實驗性糖尿病視網膜病變中，Mel可以通過受體介導的信號傳導對視網膜炎癥發(fā)揮保護作用，表明Mel 可能通過受體途徑對眼部疾病發(fā)揮保護作用。本研究結果顯示，OIR組MT1、MT2表達顯著減少，Mel處理后可挽救OIR誘導的受體丟失，提示Mel對小鼠OIR損傷后視網膜的保護作用可能是通過褪黑素受體途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，Mel 可能通過抑制HMGB1/NF-κB/NLRP3 軸減輕OIR 誘導的視網膜損傷，且可能通過褪黑素受體途徑發(fā)揮作用的。本研究仍存在一些局限性，僅使用免疫熒光染色觀察了HMGB1/NF-κB/NLRP3 軸相關因子的表達，后續(xù)實驗將采用實時熒光定量聚合酶鏈反應和Western blot技術，檢測相關因子mRNA和蛋白質的表達；并觀察Mel受體拮抗劑N-乙酰-2-芐基色胺或MT 小干擾RNA對Mel 保護作用的影響，進一步探討Mel 對OIR 的保護作用的機制，為其在ROP 中的臨床應用提供理論基礎和實驗依據。