溫脾養(yǎng)胃顆粒中黃芪甲苷和芍藥苷含量測定方法及其應(yīng)用

高溶溶,王 磊,孫福友,李艷麗,顧雪晶,李秋實,陳大全,許 卉

(1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院,山東 煙臺 264005;2.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心,山東 煙臺 264003;3.煙臺市牟平區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,山東 煙臺 264100;4.濱州市中醫(yī)醫(yī)院,山東 濱州 256601)

溫脾養(yǎng)胃顆粒具有溫脾健胃、理中止痛的功效,臨床廣泛用于脾胃虛弱諸證,癥見胃脘疼痛、噯氣泛酸、食欲不振、大便稀溏、舌苔淡、苔白、脈沉細(xì)弱等[1-2]。方中黃芪甘溫純陽、補(bǔ)中益氣而壯脾胃,白芍扶脾抑肝、堅木疏土而消郁結(jié),兩藥補(bǔ)氣溫中,疏肝郁而振脾陽,共為君藥。藥典規(guī)定,黃芪含量測定的指標(biāo)成分是黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷,其中黃芪甲苷為評判黃芪質(zhì)量優(yōu)劣的標(biāo)志物,白芍含量測定的指標(biāo)成分則是芍藥苷,故測定黃芪甲苷和芍藥苷對溫脾養(yǎng)胃顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立具有重要意義[3-4]。藥典中采用 HPLC-ELSD 聯(lián)用法測定黃芪甲苷含量[4-6]。ELSD是通用型檢測器,對所有物質(zhì)均有響應(yīng),在中藥復(fù)方復(fù)雜樣品測定中存在靈敏度低、信號不穩(wěn)定、專屬性差等缺點[7]。芍藥苷具有紫外吸收,藥典中采用 HPLC-UV 聯(lián)用法測定其含量,但溫脾養(yǎng)胃顆粒成分復(fù)雜、干擾成分多,在其芍藥苷的含量測定過程中存在分離度差且保留時間較長等缺點,故需對其含量測定方法進(jìn)一步優(yōu)化。

UHPLC-MS/MS具有分離效果好、特異性和靈敏度高等優(yōu)點,是中藥復(fù)方樣品測定中最常用的分析方法[8]。本文建立了適用于溫脾養(yǎng)胃顆粒中功效成分黃芪甲苷含量測定的UHPLC-MS/MS方法及芍藥苷含量測定的HPLC-UV方法,并以芍藥苷含量變化為指標(biāo),進(jìn)行影響因素試驗和經(jīng)典恒溫試驗,為制定溫脾養(yǎng)胃顆粒的貯藏條件和有效期提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器

AB 4500 Otrap質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB Sciex公司);Waters e2695型高效液相色譜儀、2489UV-Vis檢測器(沃特世科技(上海)有限公司);AR-1140型電子天平(美國奧豪斯儀器有限公司,讀數(shù)精度0.01 mg);Vortex Genie 2渦旋混合器(上海精科儀器有限公司);SK250HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);TGL-20W型臺式高速冷凍離心機(jī)(上海湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 藥物與試劑

黃芪甲苷對照品(批號:2128625,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%)、芍藥苷對照品(批號:111610-201908,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.6%),均購自中國食品藥品檢定研究院;溫脾養(yǎng)胃顆粒(批號:20210329,20210330,20210331)、缺味(黃芪)陰性制劑(批號:20210329-0)、缺味(白芍)陰性制劑(批號:20210329-0),均為實驗室自制,規(guī)格為每袋凈重10 g;甲醇、乙腈、甲酸為色譜純,其余試劑均為分析純,純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方 法

2.1 黃芪甲苷含量測定的UHPLC-MS/MS方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相:0.1%甲酸溶液-乙腈(68∶32);流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧電離源(ESI),正離子模式;氣簾氣壓力:20 psi;噴撞氣:Medium;離子化電壓:5500 V;加熱器溫度:400 ℃;噴霧氣壓力:55 psi;輔助氣壓力:50 psi;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的定量離子對:m/z758.4→143.108(黃芪甲苷);碰撞能(CE):12 eV;去簇電壓(DP)為14 V。

2.1.3 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量,精密稱定,加80%甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,即得。

2.1.4 供試品溶液的制備 取溫脾養(yǎng)胃顆粒粉末(過四號篩)約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液50 mL,密塞,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,用含4%濃氨試液的80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液25 mL,蒸干,殘渣用80%甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加80%甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.1.5 陰性對照溶液的制備 取制劑處方下相同條件制備的缺味(黃芪)陰性制劑樣品,按“2.1.4”項下方法同法制備陰性對照溶液。

2.2 芍藥苷含量測定的HPLC-UV方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:0.1%甲酸溶液-乙腈(85∶15);流速:1.0 mL/min;檢測波長:230 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量,精密稱定,加20%甲醇溶解,制成每1 mL含40 μg的溶液,即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取溫脾養(yǎng)胃顆粒粉末(過四號篩)約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入20%甲醇溶液25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用20%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取制劑處方下相同條件制備的缺味(白芍)陰性制劑樣品,按“2.2.3”項下方法同法制備陰性對照溶液。

2.3 影響因素試驗方法

由于溫脾養(yǎng)胃顆粒為易吸濕的水溶性藥物,儲存不當(dāng)可能嚴(yán)重影響其穩(wěn)定性,所以進(jìn)行高溫、高濕、強(qiáng)光條件下的影響因素試驗,為確定包裝和貯藏條件提供依據(jù)[9-10]。

2.3.1 高溫試驗 取溫脾養(yǎng)胃顆粒1袋,除去外包裝,置潔凈培養(yǎng)皿中(厚度<3 mm),置WD-A穩(wěn)定性檢查儀中在60 ℃下放置10 d,于第0、5、10天末取樣,按穩(wěn)定性重點考察項目進(jìn)行檢測。

2.3.2 高濕試驗 取溫脾養(yǎng)胃顆粒1袋,除去外包裝,置潔凈培養(yǎng)皿中(厚度<3 mm),置WD-A穩(wěn)定性檢查儀中在溫度25 ℃、相對濕度90%±5%下放置10 d,于第5、10天末取樣,按穩(wěn)定性重點考察項目進(jìn)行檢測,同時準(zhǔn)確稱量試驗前后供試品的重量,以考察供試品的吸濕潮解性能。于第5天準(zhǔn)確稱量試驗前后供試品的重量,發(fā)現(xiàn)吸濕增重大于5%,則在相對濕度75%±5%條件下,同法進(jìn)行試驗。

2.3.3 強(qiáng)光照射試驗 取溫脾養(yǎng)胃顆粒1袋,除去外包裝,置潔凈培養(yǎng)皿中(厚度<3 mm),置WD-A穩(wěn)定性檢查儀中在照度為4500±500 lx下放置10 d,于第0、5、10天末取樣,按穩(wěn)定性重點考察項目進(jìn)行檢測。

2.4 經(jīng)典恒溫試驗方法

經(jīng)典恒溫法是測定藥物穩(wěn)定性的一種常規(guī)試驗方法,對水溶性藥物制劑的研究效果顯著[11-12]。其原理是根據(jù)化學(xué)動力學(xué),將樣品存放至不同溫度的恒溫器中,定時取樣并測定其含量,對各溫度下不同時間藥物進(jìn)行含量測定。所得結(jié)果經(jīng)處理,即可推算出樣品在25 ℃下分解10%所需時間,該時間即為藥物的有效期。取溫脾養(yǎng)胃顆粒24份,每份約2 g,置帶蓋恒重瓶中,密封,分為4組,每組6份,分別放入60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃恒溫干燥箱中,按圖3中各溫度下的時間順序依次取樣,迅速冷卻,用研缽研成細(xì)粉,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,測定芍藥苷的含量。

3 結(jié) 果

3.1 黃芪甲苷含量測定的UHPLC-MS/MS方法學(xué)驗證

3.1.1 專屬性試驗 依據(jù)“2.1”項下色譜及質(zhì)譜條件,分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各2 μL測定,得典型質(zhì)譜圖如圖1所示。由圖1可以看出,在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時間處,供試品溶液有黃芪甲苷特征吸收峰,而陰性對照溶液無相應(yīng)吸收峰,表明方法專屬性良好。

圖1 典型UHPLC-MS/MS圖譜

3.1.2 線性與范圍 取“2.1.3”項下的對照品溶液適量,用80%甲醇分別配制成含黃芪甲苷濃度為1、5、10、20、40和60 μg·mL-1的系列對照品溶液。按“2.1”項下色譜及質(zhì)譜方法,依次注入超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,測定峰面積。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,典型回歸方程為:y=2.144 3×105x+28 440(r=0.999 8)。結(jié)果表明,黃芪甲苷在1～60 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度試驗 取同一份對照品溶液,按“2.1”項下色譜及質(zhì)譜條件平行進(jìn)樣6次,記錄峰面積。測得黃芪甲苷峰面積的RSD值為1.10%,表明儀器精密度良好。

3.1.4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品,按“2.1.4”項下方法平行制備6 份供試品溶液,進(jìn)樣測定,結(jié)果黃芪甲苷的平均含量為24.91 μg/mL,RSD為1.37%,說明方法重復(fù)性可靠。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液,室溫下放置,分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,黃芪甲苷含量的RSD為1.99%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.6 加樣回收試驗 取已知含量的同一批樣品9份,每份約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,根據(jù)供試品中待測量與對照品加入質(zhì)量之比1∶0.8、1∶1、1∶1.2三種比例,分別加入黃芪甲苷對照品溶液,按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定,測得黃芪甲苷的平均回收率為99.64%(RSD=0.89%,n=9),表明方法準(zhǔn)確度良好。

3.2 樣品中黃芪甲苷的含量測定

取3批溫脾養(yǎng)胃顆粒,按“2.1.4”項下方法平行制備3份供試品溶液,再按“2.1”項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定,測得溫脾養(yǎng)胃顆粒制劑中黃芪甲苷含量為0.124、0.126、0.127 mg/g(RSD=1.22%),平均值為0.126 mg/g。

3.3 芍藥苷含量測定的HPLC-UV方法學(xué)驗證

3.3.1 專屬性試驗 依據(jù)“2.2.1”項下色譜條件,分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL測定,得典型色譜圖如圖2所示。由圖2可以看出,在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時間處,供試品溶液有芍藥苷特征吸收峰,而陰性對照溶液無相應(yīng)吸收峰,表明專屬性良好。

圖2 典型HPLC圖譜

3.3.2 線性與范圍 取芍藥苷對照品適量,精密稱定,加20%甲醇溶解,制成每1 mL含1 mg的溶液,用20%甲醇分別配制成含芍藥苷濃度為10、20、40、60、75和100 μg·mL-1的系列對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜方法,依次注入高效液相色譜儀,測定峰面積。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,典型回歸方程為:y=1.601 8×104x-34 806(r=0.999 6)。結(jié)果表明,芍藥苷對照品在10～100 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.3 精密度試驗 取同一份對照品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件平行進(jìn)樣6次,記錄峰面積。測得芍藥苷峰面積的RSD值為1.56%,表明儀器精密度良好。

3.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品,按“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液,進(jìn)樣測定,結(jié)果芍藥苷的平均含量為40.80 μg/mL,RSD為1.09%,說明方法重復(fù)性可靠。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液,室溫下放置,分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,芍藥苷含量的RSD為1.80%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.6 加樣回收試驗 取已知含量的同一批樣品9份,每份約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,根據(jù)所取供試品中待測定量與對照品加入質(zhì)量之比1∶0.8、1∶1、1∶1.2三種比例,分別加入芍藥苷對照品溶液,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,測得芍藥苷的平均回收率為99.86%(RSD=0.95%,n=9),表明方法準(zhǔn)確度良好。

3.4 樣品中芍藥苷的含量測定

取3批溫脾養(yǎng)胃顆粒,按“2.2.3”項下方法平行制備3份供試品溶液,再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,測得3批溫脾養(yǎng)胃顆粒制劑中芍藥苷含量分別為1.02、1.02、1.03 mg/g(RSD=0.56%),平均值為1.02 mg/g。

3.5 影響因素試驗結(jié)果

高溫、高濕、強(qiáng)光照射試驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明,樣品在高溫及強(qiáng)光條件下放置10 d,穩(wěn)定性重點考察項目均無明顯變化,說明本顆粒劑在高溫及強(qiáng)光條件下基本穩(wěn)定;樣品在相對濕度90%±5%下放置5 d,顆粒吸潮軟化,吸濕增重大于5%,重新在相對濕度75%±5%下放置10 d,顆粒略有結(jié)塊,說明本顆粒劑對濕度較為敏感。因此,生產(chǎn)應(yīng)控制在較低濕度下進(jìn)行,嚴(yán)格密封且置陰涼干燥處保存[13]。

表1 影響因素試驗結(jié)果

表1(續(xù))

3.6 經(jīng)典恒溫試驗結(jié)果

3.6.1 不同溫度下的樣品中芍藥苷含量及降解反應(yīng)速率常數(shù)k不同溫度下放置的樣品芍藥苷含量測定結(jié)果見圖3。分別以各個溫度下的lgρ對t進(jìn)行線性擬合,得各溫度下的回歸方程,線性關(guān)系顯著,說明芍藥苷的降解符合一級動力學(xué)方程。再由回歸方程斜率a求出各溫度下k值,k=-2.303a,結(jié)果見表2。

圖3 溫脾養(yǎng)胃顆粒中芍藥苷在不同溫度下的分解數(shù)據(jù)

表2 溫脾養(yǎng)胃顆粒中芍藥苷在各試驗溫度下的回歸方程和反應(yīng)速率常數(shù)

3.6.2 制劑有效期預(yù)測 根據(jù)Arrhenius定律:lgk=-E/2.303RT+lgA,以lgk對1/T做線性回歸,得回歸方程:lgk=-4 442.22/T+9.86(r=-0.995 8,n=6)。根據(jù)回歸方程,計算得室溫(25 ℃)下的反應(yīng)速度常數(shù)k25=8.978 4×10-6,帶入公式t0.9=0.105 4/k25=11 739 h=489 d=1.3年。

由E=-2.303Ra計算溫脾養(yǎng)胃顆粒中芍藥苷的分解活化能,在E=85.06 kJ·mol-1,在41.84～125.52 kJ·mol-1范圍內(nèi),因此,能夠應(yīng)用Arrhenius指數(shù)定律的經(jīng)典恒溫法[14]。

4 討 論

本研究以黃芪甲苷和芍藥苷的含量為指標(biāo)對溫脾養(yǎng)胃顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制,并以芍藥苷含量變化為指標(biāo)進(jìn)行影響因素試驗和經(jīng)典恒溫試驗以確定制劑的貯藏條件并預(yù)測其有效期。

HPLC-ELSD 聯(lián)用是目前中藥復(fù)方中測定黃芪甲苷含量的主要方法[15-16],但ELSD是通用型檢測器,具有對所有物質(zhì)均有響應(yīng)的特點,使其在中藥復(fù)方樣品測定中具有一定的局限性。溫脾養(yǎng)胃顆粒是由16味中藥制成的復(fù)方制劑,成分復(fù)雜、干擾成分多,無法用ELSD實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。UHPLC-MS/MS聯(lián)用是將離子按質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測的方法,具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點,可用于溫脾養(yǎng)胃顆粒中黃芪甲苷含量測定。

本研究所建立的適用于溫脾養(yǎng)胃顆粒中芍藥苷的HPLC-UV方法,在流動相中選擇加入0.1%甲酸使樣品中含有活潑氫的易解離組分分離效果更好,不拖尾,優(yōu)化峰形;在保證系統(tǒng)適用性的前提下,優(yōu)化流動相比例使芍藥苷的保留時間明顯縮短,為后續(xù)以芍藥苷含量測定為應(yīng)用的穩(wěn)定性研究以及溫脾養(yǎng)胃顆粒作為院內(nèi)制劑上市后的質(zhì)量控制縮短了檢測時間、節(jié)約了檢測成本。將該測定方法應(yīng)用到影響因素試驗和經(jīng)典恒溫試驗中,為溫脾養(yǎng)胃顆粒的貯藏條件及有效期提供了依據(jù),大大縮短了溫脾養(yǎng)胃顆粒作為院內(nèi)制劑的申報審批時間,加快了其上市的進(jìn)程,更好地滿足人民群眾的用藥需求。

5 結(jié) 論

本文研究建立了適用于溫脾養(yǎng)胃顆粒中黃芪甲苷含量測定的UHPLC-MS/MS方法及芍藥苷含量測定的HPLC-UV方法,并成功將芍藥苷含量測定的HPLC-UV方法應(yīng)用于該制劑的穩(wěn)定性研究,為該制劑的穩(wěn)定性及有效期提供了實驗數(shù)據(jù),是科學(xué)開展組成復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的有益探索。