藏茵陳環(huán)烯醚萜類化合物改善油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性

溫授惠,宋 陽(yáng),何 杰,李 剛,董 琦,王洪倫,王振華

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/線粒體與健康衰老研究中心,山東 煙臺(tái) 264005;2. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海 西寧 810008)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)為當(dāng)代社會(huì)的重大慢性疾病[1],其特點(diǎn)是肝臟脂質(zhì)過度積累和代謝功能障礙。然而截止目前,NAFLD病理生理機(jī)制尚未完全闡明,臨床上仍缺乏有效且副作用小的特異性藥物。因此,深入揭示其發(fā)病機(jī)制,尋找特異性較好的藥物成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

藏茵陳始載于《四部醫(yī)典》,是傳統(tǒng)藏藥中用來治療肝膽疾病的具有特色的常用藥物,現(xiàn)代藏醫(yī)藥研究者認(rèn)為川西獐牙菜是藏茵陳的原植物[2]。從川西獐牙菜中分離的化合物主要有氧蒽雜酮類,環(huán)烯醚萜類和三萜類,其中環(huán)烯醚萜類化合物是川西獐牙菜發(fā)揮保肝作用的有效成分之一[3]。龍膽苦苷(Gentiopicroside,GPS)、苦龍膽酯苷(Amarogentin,AG)和獐牙菜苷(Sweroside,SW)均能通過抑制花生四烯酸介導(dǎo)的分裂作用,增強(qiáng)線粒體的呼吸來提高脂肪酸作用后肝細(xì)胞的活力,保護(hù)肝細(xì)胞,但是相關(guān)化合物在降低肝細(xì)胞脂質(zhì)積聚中的作用尚未進(jìn)行研究[4]。

為進(jìn)一步研究三種環(huán)烯醚萜化合物降低脂質(zhì)積聚的作用,本文以油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積建立非酒精性肝損傷的體外模型,探究藏茵陳中提取的龍膽苦苷(圖1(a))、苦龍膽酯苷(圖1(b))和獐牙菜苷(圖1(c))改善非酒精性肝損傷的機(jī)制,并進(jìn)行降脂活性比較。

圖1 龍膽苦苷,苦龍膽酯苷和獐牙菜苷的結(jié)構(gòu)式

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系

HepG2人肝癌細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心上海細(xì)胞庫(kù)(CCTCC,Shanghai),由本實(shí)驗(yàn)室自行傳代使用。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%抗生素(含有100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于細(xì)胞達(dá)80%融合后使用胰蛋白酶進(jìn)行傳代。

1.2 藥品與試劑

龍膽苦苷(HPLC≥98%)、苦龍膽酯苷(HPLC≥98%)、獐牙菜苷(HPLC≥98%)由中科院西北高原研究所王洪倫課題組提供;DMEM培養(yǎng)基粉末購(gòu)自GIBCO公司;油酸(OA)、油紅O、牛血清白蛋白、非諾貝特酸(Fenofibric acid,Feno)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;SRB粉末購(gòu)自拜爾迪公司;BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶抑制劑、蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天公司;甘油三酯試劑盒購(gòu)自南京建成公司;RNA快速提取試劑盒、SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit、2×SYBR Green qPCR Mix購(gòu)自思科捷生物技術(shù)有限公司;DNA基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;引物由上海生物工程股份有限公司合成;Mito-SOX、DCFH-DA探針購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;β-actin、AMPK、P-AMPK、ACC、P-ACC、FAS一抗購(gòu)自CST公司, SREBP1c、ACOX1、CPT1A一抗購(gòu)自Abcam公司;HRP耦聯(lián)山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 儀器與設(shè)備

HF151 UV CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司);SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司);多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices Corporation);流式細(xì)胞儀(杭州艾森公司);Micro 21R高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific Inc);數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市科興儀器廠);電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);MH-2微孔板孵育振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);蛋白電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司);Tanon 5500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);超微量紫外分光光度計(jì)ND5000(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 非酒精性肝損傷模型的建立

2.1.1 細(xì)胞活力測(cè)定 HepG2細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,細(xì)胞貼壁后,用含有不同濃度油酸的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。處理終點(diǎn)時(shí),用終濃度為10%三氯乙酸(TCA)于4 ℃固定1 h,固定結(jié)束后用去離子水沖洗5遍,室溫晾干。每孔加入70 μL 0.4% SRB染料,避光染色30 min,用1%乙酸沖洗,室溫晾干。檢測(cè)時(shí),加入100 μL 10 mmol/L unbuffered Trisbase (pH=10.5),平板振蕩15 min溶解,于酶標(biāo)儀540 nm測(cè)定吸光度。

2.1.2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的測(cè)定 HepG2細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后用不同濃度油酸處理48 h,處理結(jié)束后棄掉培養(yǎng)基,細(xì)胞用PBS洗滌兩次,并用4%多聚甲醛中固定30 min,然后在室溫下與油紅O工作溶液共孵育1 h,然后用60%異丙醇脫色。用PBS洗滌三次后,每孔加入300 μL異丙醇,置于搖床上振蕩10 min待其溶解后,取70 μL至96孔板中,于酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)各孔的吸光度,計(jì)算脂質(zhì)相對(duì)含量。

2.1.3 TG含量測(cè)定 HepG2細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后用不同濃度油酸處理48 h。處理終點(diǎn)時(shí)收集細(xì)胞,并使用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞制備勻漿,使用甘油三酯測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量,并用BCA試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白含量。

2.2 化合物給藥濃度的篩選

2.2.1 細(xì)胞活力測(cè)定 參考“2.1.1”,細(xì)胞貼壁后用不同濃度化合物處理24 h,處理終點(diǎn)時(shí)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),SRB染色后測(cè)定吸光度。

2.2.2 TG含量測(cè)定 參考“2.1.3”,細(xì)胞貼壁后,先用油酸處理24 h,再用不同濃度的化合物處理24 h,處理終點(diǎn)收集細(xì)胞,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG含量。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)基因的表達(dá)

HepG2細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后,油酸孵育24 h,然后用10 μmol/L Feno或“2.2”中確定濃度的化合物與油酸共孵育24 h。藥物處理結(jié)束后,使用RNA提取試劑盒從細(xì)胞中分離總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈,再以cDNA為模板在Taq DNA聚合酶催化下使用熒光染料法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參,目的基因上下游引物序列見表1。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次。根據(jù)Ct值,采用2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算分析,其中Ct=(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)藥物處理組-(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)空白組。

表1 PCR引物序列

2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)

HepG2細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后,處理方法同“2.3”。藥物處理終點(diǎn)時(shí),棄去培養(yǎng)基,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上進(jìn)行裂解。14 000×g離心20 min后,使用BCA試劑盒分析上清液以確定蛋白質(zhì)濃度,并將各組蛋白濃度定至等量。取30 μg蛋白上樣后,電泳分離蛋白,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到甲醇活化的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后用5%BSA或5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜。用TBST清洗膜三次,每次10 min,在室溫下用熒光標(biāo)記的二抗孵育1 h。TBST漂洗三次后,用超敏ECL顯影液顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析,譜帶密度通過Image J進(jìn)行量化。

2.5 線粒體活性氧的檢測(cè)

HepG2細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后,處理方法同2.3。處理結(jié)束后棄培養(yǎng)基,PBS洗滌兩次,然后加入2 μmol/L Mito-SOX熒光探針37 ℃避光孵育30 min,孵育結(jié)束后PBS清洗兩遍,收集細(xì)胞并用PBS重懸,利用流式細(xì)胞儀在510/580 nm下測(cè)定線粒體源ROS水平。

2.6 線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)

按照DNA基因組提取試劑盒說明書從細(xì)胞中提取總DNA,使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度與純度,并定量至終濃度為15 ng/μL。線粒體與細(xì)胞核相關(guān)基因的引物序列見表2,mtDNA的擴(kuò)增和定量使用PCR檢測(cè)試劑盒完成。獲得溶解曲線和Ct值,并計(jì)算mtDNA對(duì)于細(xì)胞核的相對(duì)數(shù)量。mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)=2×2NUct-MTct±s。

表2 線粒體與細(xì)胞核的引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性的發(fā)生

本研究在文獻(xiàn)[5]的基礎(chǔ)上,對(duì)油酸干預(yù)HepG2細(xì)胞脂代謝建立NAFLD模型的方法加以調(diào)整。以體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞與不同濃度油酸(200-1000 μmol/L)共孵育48 h,SRB法考察油酸的毒性,通過油紅O染色結(jié)合胞內(nèi)TG含量測(cè)定表征胞內(nèi)脂質(zhì)過載水平?；盍y(cè)定結(jié)果表明,油酸濃度達(dá)800 μmol/L時(shí)開始出現(xiàn)細(xì)胞毒性。600 μmol/L 油酸明顯誘導(dǎo)細(xì)胞脂滴形成及TG含量的升高,表明其誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)過載(P<0.01)(圖2)。因此,后續(xù)研究以600 μmol/L的油酸與HepG2人肝癌細(xì)胞共孵育,以建立穩(wěn)定的NAFLD肝細(xì)胞脂肪變性模型。

圖2 不同濃度的油酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響

3.2 GPS,AG,SW對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成的影響

為排除藏茵陳環(huán)烯醚萜類化合物通過細(xì)胞毒活性干擾細(xì)胞脂質(zhì)合成,采用SRB法考察了GPS、AG和SW對(duì)HepG2的細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明,受試物暴露24 h后,40 μmol/L及以下濃度的GPS、AG和SW處理對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活力及形態(tài)學(xué)均無(wú)明顯影響(圖3)。為探究受試物對(duì)脂代謝的特異性影響,本研究選用5、10、20 μmol/L受試物干預(yù),考察其對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞TG合成的影響。結(jié)果表明,油酸處理組細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高(P<0.01),不同濃度的GPS、AG、SW以及陽(yáng)性對(duì)照Feno處理后均明顯下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)TG水平(P<0.01),且其中SW活性最優(yōu),并表現(xiàn)出一定量效關(guān)系(圖4)。結(jié)合細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)及對(duì)TG合成影響結(jié)果,后續(xù)研究選擇了安全高效的20 μmol/L的受試物暴露濃度,進(jìn)一步考察化合物對(duì)脂質(zhì)合成影響的相關(guān)機(jī)制。

圖3 GPS,AG和SW對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

圖4 GPS,AG和SW對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響

3.3 GPS,AG和SW對(duì)脂質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了探討GPS、AG、SW改善脂質(zhì)代謝紊亂的途徑,比較三種化合物的降脂活性,實(shí)驗(yàn)考察了三者對(duì)脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。在脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)方面(圖5(a)、(b)、(c)),與對(duì)照組相比,模型組FAS,二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因(DGAT1)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1基因(SCD1)的表達(dá)劇增;與模型組相比,Feno組顯著降低FAS、DGAT1以及SCD1的表達(dá),結(jié)合GPS、AG與SW處理后與模型組相比結(jié)果共同分析,以SW降低脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的活性最為顯著,GPS次之,且均優(yōu)于Feno,其中AG處理組僅顯著降低DGAT1的表達(dá)優(yōu)于Feno,降低SCD1表達(dá)水平次于Feno組,降低FAS表達(dá)未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在脂質(zhì)分解方面相關(guān)基因表達(dá)方面(圖5(d)),與對(duì)照組相比,模型組未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與模型組相比,Feno、GPS、AG組未有顯著變化,SW極顯著地升高CPT1A表達(dá)水平。以上結(jié)果提示,GPS、AG以及SW均能抑制脂質(zhì)合成,但活性強(qiáng)度不一;SW能顯著促進(jìn)脂質(zhì)分解。

圖5 GPS,AG和SW對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.4 GPS,AG和SW對(duì)脂質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

AMPK作為細(xì)胞能量供求以及平衡調(diào)節(jié)的中心,在AMPK/ACC/CPT1A信號(hào)通路上游起關(guān)鍵性作用。與對(duì)照組相比(圖6(a)),模型組AMPK磷酸化水平顯著下調(diào);與模型組相比,GPS與SW均能上調(diào)AMPK表達(dá)水平,而Feno呈下調(diào)趨勢(shì),AG則未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示GPS與SW可激活A(yù)MPK磷酸化,AG與Feno可能未通過AMPK途徑發(fā)揮生物活性。

在脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達(dá)方面,與對(duì)照組相比(圖6(b)),在脂質(zhì)合成前期,GPS、AG、SW均顯著上調(diào)磷酸化ACC表達(dá)水平進(jìn)而抑制ACC的表達(dá)。同時(shí),與對(duì)照組相比,模型組FAS(圖6(c))和SREBP1c(圖6(d))表達(dá)上調(diào);經(jīng)化合物處理后,與模型組相比,GPS與SW使FAS表達(dá)水平下調(diào),AG與Feno未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。僅GPS下調(diào)了SREBP1c表達(dá),AG與SW未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示GPS與SW參與并顯著抑制脂肪合成階段相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)合AMKP表達(dá)水平(圖6(a))變化,推斷Feno與AG未參與該信號(hào)通路調(diào)控蛋白表達(dá)。

在脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)方面,與模型組相比(圖6(e)),GPS、AG、SW相似地上調(diào)CPT1A表達(dá)水平,但不同程度上調(diào)ACOX1表達(dá)。提示GPS、AG與SW均能顯著促進(jìn)脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá),尤以AG在激活A(yù)COX1表達(dá)水平最為顯著。

圖6 GPS,AG和SW對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.5 GPS,AG和SW對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

過量的脂質(zhì)會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而加快NAFLD的發(fā)展。為了驗(yàn)證化合物是否通過改善氧化應(yīng)激進(jìn)而緩解脂毒性介導(dǎo)的肝損傷,對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體源活性氧進(jìn)行檢測(cè)(圖7)。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,模型組的線粒體活性氧水平顯著提高(P<0.05)。GPS、AG、SW處理后,線粒體源活性氧水平顯著降低(P<0.01),表明三種化合物均能逆轉(zhuǎn)因脂質(zhì)沉積引起的活性氧升高,這提示GPS、AG、SW減輕肝損傷可能是通過改善細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激進(jìn)行的,其中AG處理組降低活性氧的效果更好。

圖7 GPS,AG和SW對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞線粒體源ROS的影響

3.6 GPS,AG和SW對(duì)線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中mtDNA 拷貝數(shù),結(jié)果如圖8所示,油酸誘導(dǎo)后,細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)水平相比對(duì)照組明顯下降,GPS、AG、SW處理后均能顯著提高HepG2細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)。結(jié)果表明,GPS、AG、SW緩解肝損傷可能是通過提高線粒體拷貝數(shù),改善線粒體損傷進(jìn)行的,與非諾貝特酸作用機(jī)制不同。其中,AG處理組逆轉(zhuǎn)線粒體損傷的效果更好。

圖8 GPS,AG和SW對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的影響

4 討論與結(jié)論

FAS是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶,DGAT1主要負(fù)責(zé)脂肪吸收及儲(chǔ)存過程中TG的合成,SDC1將飽和脂肪轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪,三者均在增加脂質(zhì)合成的過程中發(fā)揮重要作用。脂質(zhì)氧化分解的過程中首先要將脂肪酸活化生成脂酰輔酶A,然后進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化,而CPT1是脂肪酸β氧化的限速酶[6-7]。研究證明,GPS、AG、SW處理后均能顯著性逆轉(zhuǎn)SCD1和DGAT1的升高且活性優(yōu)于陽(yáng)性藥,僅GPS和SW能降低FAS的表達(dá),AG處理后FAS表達(dá)無(wú)顯著性差異。三種化合物處理后,僅有SW能極顯著增加CPT1A的表達(dá)。由此可以初步推斷,三種環(huán)烯醚萜化合物均可降低細(xì)胞內(nèi)TG含量,但是活性強(qiáng)度和經(jīng)過的途徑不一樣,SW可顯著調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),與前述結(jié)果一致。

作為一種細(xì)胞能量傳感器,AMPK被認(rèn)為是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)最重要的調(diào)節(jié)因子之一[8]。越來越多的證據(jù)表明,AMPK可以通過增強(qiáng)FAO和抑制脂肪生成來改善肝損傷[9-10]。AMPK是信號(hào)通路AMPK/ACC/CPT1A的上游調(diào)控蛋白,AMPK的激活會(huì)抑制ACC的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞丙二酰輔酶A水平降低,提高CPT1A的表達(dá),增強(qiáng)FAO[11]。根據(jù)前述結(jié)果,GPS、SW處理后細(xì)胞中FAO的增強(qiáng)可能是通過AMPK/ACC/CPT1A通路進(jìn)行的,而AG主要是通過增加ACOX1的表達(dá)增強(qiáng)過氧化物酶體中的FAO。根據(jù)文獻(xiàn)可知[12],FAO會(huì)在NAFLD不同進(jìn)展階段發(fā)生變化。在NAFLD患者與小鼠模型中,β氧化增強(qiáng),CPT1A的表達(dá)隨之升高[13-14]。然而,隨著NASH的發(fā)生,FAO速率逐漸下降,與之相關(guān)的蛋白基因表達(dá)降低[15],本研究結(jié)果與NAFLD階段的變化相一致。

轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子,受到AMPK的負(fù)調(diào)節(jié),通過調(diào)控FAS表達(dá)來調(diào)控脂質(zhì)合成[16]。本試驗(yàn)中,油酸誘導(dǎo)后,細(xì)胞內(nèi)FAS和SREBP1c蛋白表達(dá)顯著上調(diào),經(jīng)化合物處理后,GPS和SW可顯著降低FAS蛋白表達(dá)水平,僅GPS處理顯著降低SREBP1c水平,提示AG未通過該信號(hào)通路調(diào)控蛋白,SW是否能直接抑制FAS活性尚不清楚。

研究表明,線粒體功能障礙會(huì)影響肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),線粒體功能障礙和脂質(zhì)超載相互促進(jìn),進(jìn)而加劇肝損傷的進(jìn)程[17]。因此,改善線粒體功能障礙成為減少脂質(zhì)過負(fù)荷的有效治療方法。本研究表明,GPS、AG、SW通過減少油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)線粒體源活性氧的生成和增加線粒體的拷貝數(shù)來減少氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而改善肝損傷。三種化合物中,AG對(duì)于改善氧化損傷的效果最顯著。

通過結(jié)構(gòu)特征分析可以發(fā)現(xiàn),AG中含有2,4-二羥基-二聯(lián)苯羧酸結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基極易被氧化,對(duì)活性氧等自由基有較強(qiáng)的捕捉能力,可與自由基反應(yīng)生成共振穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu),終止鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng),從而保護(hù)線粒體膜不被損傷,維持了膜的完整性和功能,AG具有良好的改善線粒體功能活性可能與其含有酚羥基有關(guān)。研究表明[18],環(huán)烯醚萜類化合物的苷元部分藥理活性顯著,當(dāng)苷元中引入空間結(jié)構(gòu)較大的基團(tuán)時(shí),會(huì)干擾其與配體的結(jié)合,影響其活性,而SW對(duì)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)影響顯著,這提示SW較小的空間位阻可能更利于其與配體的結(jié)合。環(huán)烯醚萜類化合物具有多種重要的藥理活性,基于本研究,通過對(duì)GPS、AG、SW作用機(jī)制的了解和對(duì)三種環(huán)烯醚萜化合物的降脂活性的比較,我們希望日后的研究中能夠充分發(fā)揮母核與有效官能團(tuán)的作用,為藥物的研發(fā)提供新的策略。

綜上,GPS、AG、SW均可減少油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中的脂質(zhì)積累,其機(jī)制可能與改善線粒體功能障礙、增加脂肪酸β-氧化和減少脂質(zhì)合成有關(guān)。