土壤中砷和硒生物有效態(tài)的聯(lián)合提取

吳梅，趙家宇，劉怡，田興磊，倪潤(rùn)祥，劉永林*

（1.重慶師范大學(xué)GIS應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331；2.重慶師范大學(xué)地理與旅游學(xué)院，重慶 401331；3.山東省地質(zhì)科學(xué)研究院，濟(jì)南 250013；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站，北京 100125）

硒（Se）是人與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，其攝入過(guò)少或過(guò)量均會(huì)危害健康[1]。砷（As）是被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分為一類(lèi)致癌物的類(lèi)重金屬[2-4]。人體主要通過(guò)食物鏈攝取硒和砷，而農(nóng)作物是食物鏈的重要組成部分[1，5-6]。農(nóng)作物中硒和砷的含量既受到土壤中硒和砷總量影響，更受到土壤中硒和砷的生物有效性的制約[7-8]。有研究表明，硒與砷的化學(xué)性質(zhì)近似，且土壤中硒與砷的伴生關(guān)系明顯[9]。植物中硒與砷之間存在拮抗作用，即硒能緩解砷對(duì)植物的毒害作用[10]。目前，農(nóng)作物中硒與砷的交互和拮抗作用已被廣泛關(guān)注[10-12]。若能同時(shí)提取土壤中生物有效態(tài)硒與砷，將對(duì)進(jìn)一步研究土壤中硒與砷的遷移轉(zhuǎn)化、交互關(guān)系以及對(duì)植物中硒和砷含量的交互影響具有重要價(jià)值。除此之外，聯(lián)合提取實(shí)驗(yàn)可以減少實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約時(shí)間與物質(zhì)成本，具有較好的實(shí)際意義。

目前，關(guān)于聯(lián)合消煮測(cè)定土壤中砷、硒全量的研究較多[13-15]，但對(duì)聯(lián)合提取測(cè)定土壤中生物有效態(tài)砷與硒的研究較少。在前人研究工作中，提取土壤生物有效態(tài)硒時(shí)多采用K2HPO4、KH2PO4、KH2PO4-K2HPO4和NaHCO3等作為浸提劑[16-17]；提取土壤生物有效態(tài)砷時(shí)多采用NaHCO3、HCl 和NaH2PO4作為浸提劑[7，18-19]。但以上浸提劑均為分開(kāi)提取土壤生物有效態(tài)硒與砷，以致實(shí)驗(yàn)步驟多，效率較低。因此，需找到一種化學(xué)浸提劑，用以聯(lián)合提取土壤中生物有效態(tài)硒和砷，以提高實(shí)驗(yàn)效率。前人研究表明，硒與砷在化學(xué)性質(zhì)上具有相似的原子數(shù)和電子層數(shù)，常以含氧酸根形式存在[20]。因此，理論上可以找到一種化學(xué)浸提劑將土壤中生物有效態(tài)硒與砷同時(shí)提取。

在土壤生物有效態(tài)硒的常用浸提劑中，NaHCO3和K2HPO4的水溶液呈堿性，KH2PO4的水溶液呈酸性。前人研究表明，這3 種浸提劑不僅能提取土壤水溶態(tài)硒和可交換態(tài)硒（這兩種形態(tài)硒合稱(chēng)生物有效態(tài)硒），還能提取其他形態(tài)硒，如酸性的KH2PO4提取劑也可將土壤中少量的碳酸鹽結(jié)合態(tài)硒提取出來(lái)。KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液呈中性，可以有效提取土壤中有效態(tài)硒，同時(shí)也可避免對(duì)其他形態(tài)硒的提取[16]，因此，使用KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液提取土壤中的生物有效態(tài)硒效果最好[21-23]。張傳琦等[24]、張克斌等[25]認(rèn)為，0.1 mol·L-1稀HCl 對(duì)土壤生物有效態(tài)砷的提取效果較好。黃瑞卿等[18]對(duì)比研究了0.1 mol·L-1HCl、0.5 mol·L-1NaH2PO4和0.5 mol·L-1NaHCO3提取土壤生物有效態(tài)砷，結(jié)果顯示3 種浸提劑都能較好地提取土壤中的生物有效態(tài)砷。肖玲等[26]認(rèn)為，0.5 mol·L-1NaHCO3是提取土壤生物有效態(tài)砷最適宜的浸提劑?；诖耍狙芯繉⒕C合對(duì)比0.5 mol·L-1NaHCO3、0.5 mol·L-1KH2PO4、0.1 mol·L-1HCl 和0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO44 種化學(xué)浸提劑對(duì)土壤中生物有效態(tài)硒與砷的聯(lián)合提取實(shí)驗(yàn)效果，旨在達(dá)到以下研究目的：①闡述4 種化學(xué)浸提劑所提取的土壤生物有效態(tài)硒和砷與土壤總硒和總砷的相互關(guān)系；②用植物指示法驗(yàn)證4種浸提劑聯(lián)合提取土壤生物有效態(tài)硒與砷的實(shí)驗(yàn)效果，以確定最佳浸提劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

萬(wàn)分之一分析天平：BSA124S-CW 型[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；調(diào)速多用振蕩器：HY-4型（常州天瑞儀器有限公司）；電動(dòng)離心機(jī)：LD-5 型（金壇區(qū)西城新瑞儀器有限公司）；電熱板：DS24-45F型（萊玻特瑞科技有限公司）；氫化物發(fā)生原子熒光光度計(jì)（HG-AFS）：AFS-9700 型（北京海光儀器有限公司）；硒與砷空陰極燈：HAF-2 型（北京海光儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí) 驗(yàn) 所 需 試 劑：NaHCO3、HCl、HNO3、HClO4、KH2PO4、K2HPO4、硫脲、抗壞血酸和氫氧化鈉均為優(yōu)級(jí)純，硼氫化鈉為分析純，以上樣品均購(gòu)買(mǎi)于重慶川東化工有限公司；砷標(biāo)準(zhǔn)溶液（GNM-SAS-002-2013）和硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（GNM-SSE-003-2013）采購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。實(shí)驗(yàn)所需混合溶液：HNO3和HClO4混合溶液，HNO3∶HClO4（體積比）=5∶1；硫脲+抗壞血酸溶液，2.5 g硫脲和2.5 g抗壞血酸溶于100 mL超純水；1μg·mL-1砷和硒的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用1 mol·L-1HCl 將10μg·mL-1砷、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至1 μg·mL-1；還原劑（現(xiàn)配現(xiàn)用），2.5 g 氫氧化鈉和7 g硼氫化鈉溶于500 mL超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品處理與測(cè)試

1.3.1 土壤與玉米樣品采集和前處理

隨機(jī)采集成土母巖和土壤類(lèi)型相同的9 件玉米根系土壤，并采集對(duì)應(yīng)成熟的玉米根和玉米籽。土壤樣品在室內(nèi)自然風(fēng)干后剔除其中的瓦塊、碎石、植物根系，過(guò)2 mm 孔徑的尼龍篩（10 目），采用四分法取10目土樣，用瑪瑙研缽充分研磨后過(guò)0.15 mm 孔徑的尼龍篩（100 目），保存在塑料瓶中，待測(cè)。玉米籽與玉米根的處理參考《土地質(zhì)量地球化學(xué)評(píng)價(jià)規(guī)范》（DZ/T 0295—2016）進(jìn)行。將采集的玉米根與土壤剝離，玉米脫粒后保留玉米籽，用超純水將玉米根和玉米籽反復(fù)清洗干凈后按編號(hào)順序放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，將剪成0.5~1.0 cm 的玉米根系和玉米籽一起放置在85~90 ℃烘箱中烘烤1 h，再在70 ℃條件下烘干至質(zhì)量恒定。用不銹鋼粉碎機(jī)將其粉碎后過(guò)60 目尼龍篩，保存在塑料瓶中，待測(cè)。

1.3.2 土壤生物有效態(tài)硒與砷的提取過(guò)程

4 種浸提劑提取土壤生物有效態(tài)硒與砷的詳細(xì)步驟見(jiàn)表1。其中0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4提取時(shí)振蕩和離心分兩次進(jìn)行，第一次振蕩240 min 后離心10 min，將上清液倒入聚乙烯瓶中。在離心管剩余樣品中加入10 mL 超純水繼續(xù)振蕩240 min 后離心10 min，將上清液倒入聚乙烯瓶中與上一步的0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4溶液混合均勻。

表1 4種提取劑分別提取土壤生物有效態(tài)砷與硒的步驟[13-14]Table 1 Steps of extracting bioavailable arsenic and bioavailable selenium with four extractants respectively in soils[13-14]

提取液中砷和硒的測(cè)試步驟：①分別取5 mL 4種提取劑所得浸提液至100 mL 燒杯，加入2 mL HNO3和HClO4混合溶液，在180 ℃的電熱板上消煮至冒出大量濃白煙，取下，冷卻至室溫；②加入2 mL 6 mol·L-1HCl，繼續(xù)消煮至冒出大量濃白煙，取下，冷卻至室溫。③用超純水少量多次沖洗燒杯內(nèi)壁和表面皿內(nèi)側(cè)，將所得溶液轉(zhuǎn)移至20 mL試管，加入1 mL 12 mol·L-1HCl，定容，搖勻，上機(jī)測(cè)定提取液中硒濃度。④準(zhǔn)確吸取測(cè)定硒濃度后的消解溶液3 mL，加入2 mL 硫脲+抗壞血酸和HCl混合液（硫脲+抗壞血酸和HCl的體積比為1∶1），定容至15 mL，靜置40 min，測(cè)定提取液中砷濃度。稱(chēng)取0.5 g 左右玉米籽和玉米根測(cè)定其總硒和總砷，稱(chēng)取0.1 g 土壤樣品，測(cè)定其總硒和總砷，具體消煮和測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)[27]。

1.3.3 硒、砷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定

分別取0.5 mL 1 μg·mL-1的硒或砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入5 mL 12 mol·L-1HCl，定容至50 mL，搖勻，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)液中硒、砷的濃度為10μg·L-1。以5%（體積比）的HCl溶液為載流，氫氧化鈉和硼氫化鈉混合溶液為還原劑。待儀器穩(wěn)定后用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量法測(cè)定樣品中硒、砷含量。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制與檢出限

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用燒杯、試管等均在20%HNO3中浸泡超過(guò)24 h。土壤總硒和總砷測(cè)定中使用兩組土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07404a 和GBW07406a）控制；土壤生物有效態(tài)硒與砷測(cè)定中使用兩組平行樣品以確保實(shí)驗(yàn)操作可靠。玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10012）用于控制玉米根和玉米籽中總硒和總砷的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)中所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的硒、砷的測(cè)定含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。硒標(biāo)準(zhǔn)曲線：c=0.012IF+0.023，r=0.999 9（c為濃度，IF為熒光強(qiáng)度）；砷標(biāo)準(zhǔn)曲線：c=0.039IF+0.129，r=0.999 4。硒和砷的檢測(cè)限分別為0.01μg·L-1和0.05 μg·L-1。土壤總砷、總硒與玉米根和玉米籽砷、硒的加標(biāo)回收率均在93%~106%之間。

1.4 儀器工作條件

實(shí)驗(yàn)儀器工作參數(shù)：振蕩器250 r·min-1，離心機(jī)4 000 r·min-1，電熱板180 ℃。HG-AFS 工作條件見(jiàn)表2。

表2 儀器工作條件Table 2 Instrument operating conditions

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤生物有效態(tài)砷含量

Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，4 種提取劑所提取的土壤中生物有效態(tài)砷含量具有顯著差異（P<0.05）。0.5 mol·L-1NaHCO3、0.5 mol·L-1KH2PO4、0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4提取的土壤生物有效態(tài)砷含量均值分別為0.119、0.478、0.548 mg·kg-1和0.343 mg·kg-1（表3）。0.5 mol·L-1KH2PO4和0.1 mol·L-1HCl 提取的土壤生物有效態(tài)砷含量與土壤總砷含量無(wú)顯著相關(guān)性。0.5 mol·L-1NaHCO3（r=0.794，P<0.01）和0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4（r=0.788，P<0.01）提取的土壤生物有效態(tài)砷含量與土壤總砷含量均呈顯著正相關(guān)。

表3 4種提取劑分別提取的土壤生物有效態(tài)砷含量和土壤、玉米總砷含量（mg·kg-1）Table 3 Four extractants extract the bioavailable arsenic content in soil and total arsenic content in soils and corns（mg·kg-1）

4種提取劑中僅0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4所提取的土壤生物有效態(tài)砷含量與玉米籽（r=0.901 8，P<0.01）和玉米根（r=0.848 1，P<0.01）總砷呈顯著正相關(guān)，其余均無(wú)顯著相關(guān)性（圖1）。雖然同為磷酸根的0.5 mol·L-1KH2PO4所提取土壤生物有效態(tài)砷含量高于0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4所提取的生物有效態(tài)砷含量，但其提取量與玉米籽和玉米根總砷無(wú)顯著相關(guān)性，因此相對(duì)來(lái)說(shuō)0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4更適用于土壤生物有效態(tài)砷的提取。

圖1 4種提取劑提取的土壤生物有效態(tài)砷含量與玉米籽、玉米根中總砷含量相關(guān)性Figure 1 Correlation between bioavailable arsenic content extracted by four extractants in soils and total arsenic content in corn seeds and roots

2.2 土壤生物有效態(tài)硒含量

Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，4種提取劑所提取的土壤生物有效態(tài)硒含量具有顯著差異（P<0.05），0.5 mol·L-1NaHCO3、0.5 mol·L-1KH2PO4、0.1 mol·L-1HCl 和0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4提取的土壤生物有效態(tài)硒含量均值分別為0.023、0.015、0.009、0.023 mg·kg-1（表4）。除0.1 mol·L-1HCl 外，0.5 mol·L-1NaHCO3（r=0.648，P<0.05）、0.5 mol·L-1KH2PO4（r=0.627，P<0.05）和0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4（r=0.707，P<0.05）提取的土壤生物有效態(tài)硒含量均與土壤總硒含量呈顯著正相關(guān)。

表4 4種提取劑分別提取的土壤生物有效態(tài)硒含量和土壤、玉米總硒含量（mg·kg-1）Table 4 Four content extractants extract the bioavailable selenium and total selenium content in soils and corns（mg·kg-1）

4 種提取劑提取的土壤生物有效態(tài)硒含量與玉米籽總硒含量均無(wú)顯著相關(guān)性，但與玉米根總硒含量均呈顯著正相關(guān)（圖2），r分別為0.818 3（P<0.01，0.5 mol · L-1NaHCO3）、0.717 5（P<0.05，0.5 mol · L-1KH2PO4）、0.731 3（P<0.05，0.1 mol·L-1HCl）、0.822 1（P<0.01，0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4）。綜合來(lái)看，0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4和0.5 mol·L-1NaHCO3都能有效將土壤中的生物有效態(tài)硒提取出來(lái)，這與周菲等[28]和周越等[29]的研究結(jié)果一致。

圖2 4種提取劑提取土壤生物有效態(tài)硒含量與玉米籽、玉米根總硒含量相關(guān)性Figure 2 Correlation between bioavailable selenium content extracted by four extractants in soils and total selenium content in corn seeds and roots

2.3 0.1 mol·L-1 KH2PO4-K2HPO4對(duì)土壤生物有效態(tài)砷與硒的聯(lián)合提取

4種提取劑中0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4提取土壤生物有效態(tài)砷的效果最佳（表3和圖1）。原因是磷與砷的電子排布相似，且均形成三元酸，但磷酸根半徑較砷酸根和亞砷酸根小，具有更強(qiáng)的電荷密度，因此，磷酸根易將吸附在土壤顆粒表面的砷替換下來(lái)[30-31]。在化學(xué)性質(zhì)上，磷酸鹽與砷酸鹽也具有許多相似性，磷酸鹽緩沖溶液不僅可以提取土壤吸附的砷，而且對(duì)于部分存在于土壤顆粒晶格中的砷也可提取，從而增加了提取量[32-33]。通氣性良好的土壤中，砷主要以砷酸根和亞砷酸根形態(tài)存在，它和磷酸根有很大的相似性。在大多數(shù)自然土壤中，As（Ⅴ）可以被氧化鐵、氧化鋁和氧化鈣吸附固定，與As（Ⅴ）相似，磷酸鹽在土壤中也會(huì)被上述物質(zhì)強(qiáng)烈地吸附固定[34]。Alam 等[35]比較了磷酸鉀、硫酸鉀、氯化鉀、硝酸鉀和高氯酸鉀對(duì)土壤砷的提取率，發(fā)現(xiàn)磷酸鉀的提取率比其他幾種鹽的提取率高得多，土壤對(duì)磷酸根的吸附選擇性高于砷酸根，因此，磷酸根可以有效地將土壤吸持的砷酸根和亞砷酸根提取出來(lái)。

0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4和0.5 mol·L-1NaHCO3提取土壤中生物有效態(tài)硒的效果均較好（表4 和圖2），但由于0.5 mol·L-1NaHCO3對(duì)土壤生物有效態(tài)砷的提取效果較差，因此0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4更適合于聯(lián)合提取土壤生物有效態(tài)硒與砷。0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4可以提取土壤中的水溶態(tài)、可交換態(tài)及部分有機(jī)結(jié)合態(tài)的硒[21]，以上3 種賦存形態(tài)的硒是評(píng)價(jià)土壤中硒生物有效性的適宜指標(biāo)[22-23]。吳少尉等[16]試驗(yàn)了不同提取劑對(duì)于土壤中有效態(tài)硒的提取效果，其中NaHCO3、KH2PO4、K2HPO4、KH2PO4-K2HPO4的浸提率均較高。由于NaHCO3、K2HPO4的水溶液呈堿性，KH2PO4的水溶液呈酸性，都使提取液中不僅只含有有效態(tài)硒，而使用呈中性的KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液提取可避免對(duì)其他形態(tài)硒的提取[36]。

硒與砷具有相似的原子數(shù)和電子層數(shù)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，常以含氧酸根形式存在[9，20]。0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4提取土壤生物有效態(tài)硒與砷的原理是陰離子交換作用，磷酸根能將土壤中被其他化合物，例如氧化鐵、氧化鋁所吸附的砷酸根、亞砷酸根、硒酸根、亞硒酸根提取出來(lái)[16，18]。因此，從化學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均可得出，0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4可作為土壤中生物有效態(tài)硒與砷聯(lián)合提取的浸提劑，此浸提劑即可簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟、節(jié)約化學(xué)試劑，也對(duì)綜合評(píng)價(jià)土壤中砷與硒的生物有效性具有重要意義。

3 結(jié)論

（1）4 種提取劑中僅0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4

提取的土壤生物有效態(tài)砷與土壤總砷（r=0.788，P<0.01）、玉米籽砷（r=0.902，P<0.01）和玉米根砷（r=0.848，P<0.01）呈 顯 著 正 相 關(guān)，因 此0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4對(duì)土壤生物有效態(tài)砷提取效果最好。

（2）4 種提取劑中0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4和0.5 mol·L-1NaHCO3提取的生物有效態(tài)硒含量與土壤總硒（r=0.707，P<0.05；r=0.648，P<0.05）、玉米根硒（r=0.822，P<0.01；r=0.818，P<0.01）呈顯著正相關(guān)，但0.5 mol·L-1NaHCO3對(duì)土壤生物有效態(tài)砷的提取效果較差。

（3）本研究建立了土壤中生物有效態(tài)砷與硒聯(lián)合提取的實(shí)驗(yàn)方法——0.1 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4聯(lián)合提取法。