古菌群落視角評(píng)估某退役鈾尾礦庫(kù)的治理效果

伊英達(dá)，陳恒雷，馮光文

（新疆大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，放射生態(tài)與離子束生物技術(shù)研究中心，烏魯木齊 830017）

化石能源的使用給各國(guó)生態(tài)環(huán)境保護(hù)工作帶來(lái)了巨大壓力[1]。為了降低化石能源的負(fù)面影響，尋求更加清潔高效的能源替代品，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家將替代目標(biāo)鎖定在核能上[2]。鈾元素作為核能利用的重要原料[3]，在降低化石能源消耗、改善生態(tài)環(huán)境質(zhì)量、維持經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展方面發(fā)揮著重要作用[4]，然而鈾元素在開(kāi)采和冶煉過(guò)程中，難以避免會(huì)產(chǎn)生大量的固體廢棄物，這些廢棄物既含有天然放射性核素（如238U、232Th、226Ra、40K 和222Rn 等），也含有一定量具有化學(xué)毒性的重金屬[5]。為了消除固體廢棄物中有害物質(zhì)遷移、擴(kuò)散對(duì)周?chē)h(huán)境的影響，按照《鈾礦冶輻射防護(hù)和輻射環(huán)境保護(hù)規(guī)定》（GB 23727—2020）的要求建設(shè)鈾尾礦庫(kù)，構(gòu)建人工防滲、護(hù)坡等措施，對(duì)其進(jìn)行填埋、覆土處理[6]。為了了解鈾尾礦庫(kù)中有害物質(zhì)是否向周?chē)h(huán)境發(fā)生遷移、擴(kuò)散，需對(duì)尾礦庫(kù)進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)控，以評(píng)估其對(duì)周?chē)h(huán)境的影響。Yong等[7]和Mao等[8]以位于中國(guó)西北某退役10多年的鈾尾礦庫(kù)為研究對(duì)象，開(kāi)展了尾礦庫(kù)中天然放射性核素和重金屬的遷移規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn)尾礦庫(kù)及其周?chē)寥拉h(huán)境中的天然放射性核素和重金屬均處于當(dāng)?shù)氐谋尘八?，從宏觀放射生態(tài)視角評(píng)估，尾礦庫(kù)退役治理效果良好。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)和“組學(xué)”技術(shù)的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鈾尾礦中微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了廣泛的研究[9-14]。Yan 等[9]通過(guò)對(duì)我國(guó)南方某鈾尾礦及其毗鄰農(nóng)田土壤中的微生物進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能在鈾污染的土壤中呈現(xiàn)顯著變化。曾濤濤等[11]對(duì)我國(guó)南方某鈾尾礦庫(kù)壩土壤中的細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行考察，篩選出了5種耐鈾菌屬。Yan 等[12]使用變性梯度凝膠電泳法（DGGE）分析了我國(guó)東南某鈾廠尾礦的土壤微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)鈾尾礦中土壤的放射性核素分布規(guī)律對(duì)微生物多樣性有深遠(yuǎn)的影響。Sánchez-Castro等[13]從位于法國(guó)的Bessines-sur-Gartempe 鈾尾礦庫(kù)分離出2 種耐鈾菌株，并評(píng)估了它們?cè)阝櫳镄迯?fù)中的潛能。此外，Radeva 等[14]調(diào)查了位于保加利亞的“Sliven”鈾礦廢料堆和“Buhovo”鈾礦區(qū)土壤中古菌群落的多樣性。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)鈾尾礦庫(kù)古菌多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的研究較少，對(duì)古菌與尾礦庫(kù)土壤環(huán)境因子的響應(yīng)知之甚少。位于我國(guó)新疆北部的某退役治理尾礦庫(kù)，庫(kù)區(qū)內(nèi)尾礦渣上方已進(jìn)行了1 m 的覆土，覆土來(lái)源于尾礦庫(kù)區(qū)周邊土壤，該尾礦庫(kù)退役10 多年后庫(kù)區(qū)土壤古菌群落的結(jié)構(gòu)狀況有待研究。基于此，本研究以該尾礦庫(kù)為研究對(duì)象，在前期研究基礎(chǔ)上[2，7-8]，通過(guò)16S rRNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析，研究鈾礦冶尾礦庫(kù)內(nèi)外古菌多樣性與群落分布特征，以及開(kāi)展古菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)研究，嘗試從微生態(tài)-古菌群落視角，評(píng)估尾礦庫(kù)退役治理效果，為構(gòu)建鈾尾礦庫(kù)的微生態(tài)評(píng)價(jià)體系提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

鈾礦冶尾礦庫(kù)位于新疆境內(nèi)，為一座固體尾礦渣貯存庫(kù)，2007 年完成了防滲層、表層覆土（約1 m）以及混凝土護(hù)坡等退役治理工程，退役尾礦庫(kù)剖面圖如圖1所示。尾礦庫(kù)所處位置平均海拔為926 m，庫(kù)區(qū)內(nèi)呈現(xiàn)北高南低、西高東低的走勢(shì)，混凝土護(hù)坡修建于尾礦庫(kù)地勢(shì)較低的東北方向，尾礦庫(kù)東南方向?yàn)榍鹆甑貛揖o鄰山體，研究區(qū)域面積約20 000 m2。尾礦庫(kù)及其周邊地表土壤植被稀少，氣候干燥少雨，日照充足，氣溫變化幅度較大，庫(kù)區(qū)所在位置遠(yuǎn)離地表水源、耕地和畜牧地帶[7]。尾礦庫(kù)的具體點(diǎn)位圖見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

圖1 退役尾礦庫(kù)剖面圖Figure 1 Profile view of the decommissioned tailings pond

1.2 樣品采集與處理

土壤樣品的采集工作于2019年8月完成，尾礦庫(kù)內(nèi)及毗鄰區(qū)域共設(shè)置了7 個(gè)采樣點(diǎn)，在垂直方向0~5 cm 與5~15 cm 兩個(gè)不同深度采集土壤樣品。鑒于退役治理過(guò)程中礦渣上方覆土來(lái)自庫(kù)區(qū)周邊土壤，選取尾礦庫(kù)毗鄰區(qū)域土壤的采樣點(diǎn)位作為對(duì)照樣本，具體的采樣點(diǎn)位和方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7-8]。尾礦庫(kù)內(nèi)和毗鄰區(qū)域分別設(shè)置4 個(gè)和3 個(gè)采樣點(diǎn)位。其中，尾礦庫(kù)內(nèi)：0~5 cm 深度的采樣點(diǎn)命名為T(mén)S1、TS2、TS3、TS4，5~15 cm 深度的采樣點(diǎn)命名為T(mén)X1、TX2、TX3、TX4；尾礦庫(kù)毗鄰區(qū)域：0~5 cm 深度的采樣點(diǎn)命名為CS1、CS2、CS3，5~15 cm 深度的采樣點(diǎn)命名為CX1、CX2、CX3，毗鄰區(qū)布點(diǎn)與尾礦庫(kù)邊緣的距離為15~35 m?；谏鲜鰳狱c(diǎn)分布，每個(gè)采樣點(diǎn)附近隨機(jī)采集等量的3 份土壤，經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)無(wú)菌操作混勻后裝入無(wú)菌的采樣袋中，共采集42（7×2×3）個(gè)土壤樣品，樣品被分為4個(gè)樣品組（TS 組、TX 組、CX 組、CS 組）。每個(gè)采樣點(diǎn)樣品被分成3 份，一份用于分析土壤中放射性核素含量，一份用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)和重金屬/類(lèi)金屬含量，一份用于分子生物學(xué)分析。其中，用于分子生物學(xué)分析的樣品，使用車(chē)載冰箱恒溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，存入超低溫冰箱（-80 ℃）用于后續(xù)DNA提取。

1.3 測(cè)定與分析方法

1.3.1 土壤中放射性核素比活度的測(cè)定

土壤樣品中天然放射性核素（238U、232Th 與40K）的比活度測(cè)定使用γ 射線光譜法，能量刻度和效率刻度參考《高純鍺γ 能譜分析通用方法》（GB/T 11713—2015），放射性核素特征峰的能量選擇和估算參考《土壤中放射性核素的γ 能譜分析方法》（GB/T 11743—2013）和相關(guān)文獻(xiàn)[7，15]。樣品中詳細(xì)的天然放射性核素的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 土壤理化參數(shù)與重金屬/類(lèi)金屬的測(cè)定

土壤樣品理化參數(shù)測(cè)定項(xiàng)目主要包括：土壤pH值、EC（電導(dǎo)率）、TN（總氮）、TOC（總有機(jī)碳）、TP（總磷）。其中，土壤pH 值的測(cè)量方法為土壤水浸法，測(cè)定流程參考《土壤檢測(cè) 第2 部分：土壤pH 的測(cè)定》（NY/T 1121.2—2006）和相關(guān)文獻(xiàn)[16]；土壤EC 的測(cè)定采用電極法，測(cè)定步驟參考《土壤電導(dǎo)率的測(cè)定電極法》（HJ 802—2016）和相關(guān)文獻(xiàn)[17]；土壤中的TOC、TN和TP 分別使用重鉻酸鹽氧化法、半微量凱氏定氮法和鉬銻抗分光光度法，測(cè)定過(guò)程參考《土壤有機(jī)碳的測(cè)定重鉻酸鉀氧化-分光光度法》（HJ 615—2011）和相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]。

土壤樣品中重金屬/類(lèi)金屬的檢測(cè)主要包括Cr、Zn、Pb、Cd及類(lèi)金屬As。土壤樣品中Cr、Zn、Pb、Cd及類(lèi)金屬As的測(cè)定采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）[20]。

詳細(xì)的土壤理化參數(shù)、重金屬/類(lèi)金屬的測(cè)定與分析結(jié)果見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。

1.4 DNA提取和高通量測(cè)序

使用CTAB 方法提取土壤樣品的總DNA[21]，DNA的濃度和純度使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，使用無(wú)菌水將DNA 稀釋至1 ng·μL-1。將稀釋后的基因組DNA 作為模板，應(yīng)用引物519F（5'-CAGCCGCC-GCGGTAA-3'）和引物915R（5'-GTGCTCCCCCGC-CAATTCCT-3'）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），擴(kuò)增新古菌的V4 區(qū)[22]。使用瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，同時(shí)依據(jù)檢測(cè)結(jié)果將產(chǎn)物混樣，之后使用Qiagen 凝膠提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)）對(duì)混合的產(chǎn)物進(jìn)行純化處理。

按照TruSeq?DNA PCR-Free 建庫(kù)試劑盒（Illumi-na，美國(guó)）產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，經(jīng)過(guò)Qubit?2.0 熒光計(jì)（Thermo Scientific）和Agilent 2100 生物分析系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，評(píng)估達(dá)標(biāo)后，在Illumina Nova-Seq 平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)測(cè)序。高通量測(cè)序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

以PCR 擴(kuò)增引物序列和標(biāo)簽（Barcode）序列為參考，從下機(jī)的數(shù)據(jù)中分出每個(gè)樣本的序列（reads），用FLASH（V1.2.7）截?cái)嗝總€(gè)樣本的標(biāo)簽和引物序列，合并雙端序列，最終得到拼接序列（Raw Tags）[23]，隨后使用QIIME（V1.9.1）對(duì)Raw Tags 進(jìn)行篩選得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）[24-25]，緊接著使用UCHIME算法將Tags數(shù)據(jù)與參考數(shù)據(jù)庫(kù)（Silva）進(jìn)行比較，檢測(cè)并去除嵌合體序列后得到有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）[26-27]。使用ASV 非聚類(lèi)去噪法Denoise[28]（基于Usearch 10.0 軟件的Unoise 3 功能）對(duì)所有樣本的全部Effective Tags 進(jìn)行去噪并生成ASV。使用Vsearch軟件生成特征表，基于SILVA138.1[29]的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)[30]進(jìn)行物種注釋分析。

α 多樣性和β 多樣性分析通過(guò)QIIME（V1.9.1）軟件[25]和R 軟件（V4.2.1）完成。數(shù)據(jù)整理工作借助Ex-cel 2016 軟件完成，單因素方差分析通過(guò)Minitab 20完成。利用R 語(yǔ)言中的“vegan”包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）、基于距離的冗余分析（db-RDA）和方差分解分析（VPA）[31-32]。db-RDA 前，先使用方差膨脹因子對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行共線性分析并剔除共線性較強(qiáng)的環(huán)境因子[31-34]；其次對(duì)RDA 模型進(jìn)行校正和檢驗(yàn)，使用R 語(yǔ)言“vegan”包中的“orddiR2step”函數(shù)對(duì)模型進(jìn)行前向選擇，同時(shí)使用R 語(yǔ)言“ggplot2”程序包完成相應(yīng)數(shù)據(jù)的可視化[32，35-38]。

2 結(jié)果與分析

2.1 古菌16S rRNA擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建與分析

基于采集的42個(gè)鈾礦冶尾礦庫(kù)及其毗鄰區(qū)域0~5 cm 與5~15 cm 兩個(gè)不同深度土壤樣品，利用高通量測(cè)序，過(guò)濾低質(zhì)量和短長(zhǎng)度的序列，去嵌合之后共得到421 002條古菌16S rRNA 有效基因序列，片段長(zhǎng)度范圍為278~410 bp，平均片段長(zhǎng)度為373 bp，物種注釋到的序列數(shù)為311 079，最終得到248 個(gè)古菌ASV代表序列。

2.2 土壤樣品古菌的相對(duì)豐度

基于SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)物種注釋結(jié)果可知，樣品中的古菌共聚類(lèi)到10 個(gè)門(mén)、17 個(gè)綱、19 個(gè)目、22 個(gè)科、32個(gè)屬、10 個(gè)種。在門(mén)和屬水平上，分別選取平均相對(duì)豐度大于1%的土壤古菌種群作為優(yōu)勢(shì)門(mén)和優(yōu)勢(shì)屬，并對(duì)其進(jìn)行相對(duì)豐度和差異分析。鈾尾礦庫(kù)內(nèi)外7個(gè)采樣點(diǎn)位分布于2個(gè)不同垂向深度的4個(gè)樣品組土壤古菌在門(mén)和屬水平占優(yōu)勢(shì)種群的相對(duì)豐度如圖2所示。在門(mén)水平上，Crenarchaeota（泉古菌門(mén)）、Euryar-chaeota（廣古菌門(mén)）、Halobacterota 菌門(mén)和一個(gè)未分類(lèi)菌門(mén)（unidentified_Archaea）為相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。在屬水平上，相對(duì)豐度較高的菌屬分別為Candi-datus_Nitrocosmicus（亞硝化侏儒菌屬）、Methanobacte-rium（甲烷桿菌屬）、Candidatus_Nitrososphaera菌屬。

圖2 土壤樣品中優(yōu)勢(shì)古菌類(lèi)群相對(duì)豐度柱狀圖Figure 2 Histogram of relative abundance of dominant archaeal groups in soil samples

在門(mén)水平上，Crenarchaeota 菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，是研究區(qū)域內(nèi)分布最豐富的菌門(mén)，其他3 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)豐度相對(duì)較低，且在研究區(qū)域內(nèi)分布不均勻。盡管研究區(qū)域內(nèi)4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在不同土壤樣品組中的相對(duì)差別較大，分布不均勻，但通過(guò)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度在樣品組間未呈現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）。

在屬水平上，3 個(gè)主要優(yōu)勢(shì)屬在研究區(qū)域內(nèi)也呈現(xiàn)不均勻分布，但僅Candidatus_Nitrocosmicus菌屬在CX 和TX 組間呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），其他優(yōu)勢(shì)菌門(mén)樣品組間相對(duì)豐度未呈現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）。

通過(guò)對(duì)研究區(qū)域內(nèi)優(yōu)勢(shì)古菌門(mén)和屬在不同樣品組中相對(duì)豐度的分析可知，該鈾尾礦庫(kù)經(jīng)退役治理后，尾礦庫(kù)內(nèi)與其毗鄰區(qū)域土壤中的古菌群落結(jié)構(gòu)基本一致。

2.3 土壤古菌群落多樣性分析

2.3.1 土壤古菌α多樣性分析

為了了解尾礦庫(kù)庫(kù)區(qū)及毗鄰區(qū)域土壤古菌群落物種的豐富度和均勻度，選取研究區(qū)域內(nèi)土壤古菌群落α 多樣性進(jìn)行分析，分析結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，尾礦庫(kù)內(nèi)（TS、TX）土壤古菌群落的Chao1 指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon 指數(shù)分布范圍為1 618.32~2 537.74、1 662.80~2 520.83、6.98~9.09。毗鄰區(qū)域（CS、CX）土壤古菌群落的Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)分布范圍為1 086.81~2 443.87、1 160.55~2 460.18、6.51~8.80。

表1 鈾尾礦庫(kù)及其毗鄰區(qū)域土壤古菌群落α多樣性指數(shù)Table 1 Alpha-diversity indexes of soil archaeal community in uranium tailings pond and its adjacent area

為更直觀地了解尾礦庫(kù)區(qū)與毗鄰區(qū)域古菌群落的α 多樣性指數(shù)分布，研究區(qū)域4 個(gè)樣品組α 多樣性指數(shù)的箱線圖如圖3 所示。由圖3 可知，TS、TX、CS、CX 點(diǎn)位土壤中古菌群落的Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)均未呈現(xiàn)顯著性差異（P>0.05），表明該尾礦庫(kù)經(jīng)退役治理后，尾礦庫(kù)內(nèi)與毗鄰區(qū)域表層土壤（0~15 cm）古菌群落多樣性不存在顯著差異。

圖3 尾礦庫(kù)區(qū)及其毗鄰區(qū)域土壤古菌群落α多樣性指數(shù)箱線圖Figure 3 Boxplots of alpha-diversity metrics of soil archaeal community in tailings pond and its adjacent area

2.3.2 土壤古菌β多樣性分析

采用基于Unweighted Unifrac 距離的PCoA 分析尾礦庫(kù)庫(kù)區(qū)及毗鄰區(qū)域土壤古菌群落的分布。如圖4 所示，尾礦庫(kù)內(nèi)土壤點(diǎn)位與毗鄰區(qū)域土壤點(diǎn)位的古菌群落分布未呈現(xiàn)明顯分離。PCoA 第一坐標(biāo)軸對(duì)總變異的貢獻(xiàn)率為20.48%，而PCoA 的第二坐標(biāo)軸僅解釋了總方差的15.77%。第一軸與第二軸并未將尾礦庫(kù)及毗鄰區(qū)域不同土壤點(diǎn)位古菌群落進(jìn)行明顯區(qū)分，這進(jìn)一步說(shuō)明該尾礦庫(kù)經(jīng)退役治理后，尾礦庫(kù)庫(kù)區(qū)內(nèi)外的土壤古菌群落組成具有相似性。

圖4 尾礦庫(kù)區(qū)及其毗鄰區(qū)域土壤樣品組間古菌群落的主坐標(biāo)分析（PCoA）Figure 4 PCoA of the main coordinates of archaeal community among soil samples in tailings pond and its adjacent area

2.4 土壤環(huán)境因子與古菌群落的相關(guān)性分析

為了掌握尾礦庫(kù)及其毗鄰區(qū)域土壤環(huán)境因子對(duì)古菌群落的影響，選取相對(duì)豐度前4 的優(yōu)勢(shì)古菌門(mén)和屬，分析土壤放射性核素、理化參數(shù)和重金屬/類(lèi)金屬與門(mén)、屬水平前4 豐度古菌間的Pearson 相關(guān)系數(shù)，基于該系數(shù)繪制相關(guān)性熱圖（圖5）。由圖5 可知，研究區(qū)域土壤環(huán)境因子中TN、TP、pH、Cd、232Th 是影響該區(qū)域土壤中主要古菌群落的重要環(huán)境因子。在門(mén)水平上，Crenarchaeota 菌門(mén)與土壤中TN 的含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。Euryarchaeota 菌門(mén)與土壤中TP 的含量、pH、Cd 的含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），而與土壤232Th 的比活度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。在屬水平上，Candidatus_Nitrososphaera菌屬與土壤TN 含量呈顯著正相關(guān)（P<0.01），Candidatus_Nitrocosmicus菌屬與土壤232Th 比活度呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。屬于Euryarchaeota 菌門(mén)的Methanobacterium菌屬與土壤TP含量、pH、Cd 含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與土壤中232Th比活度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。

圖5 尾礦庫(kù)及其毗鄰區(qū)域土壤環(huán)境因子與主要古菌群落相關(guān)性熱圖Figure 5 Heat map of correlation between soil environmental factors and major archaeal communities in tailings pond and adjacent area

為了更深入地揭示影響尾礦庫(kù)土壤古菌群落的主要環(huán)境因子，對(duì)環(huán)境因子與尾礦庫(kù)內(nèi)外所有古菌ASV 進(jìn)行基于距離的db-RDA，使用方差膨脹因子對(duì)所有13 個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行共線性分析，依次刪除As、K、Pb 3 個(gè)共線性較強(qiáng)的環(huán)境因子，對(duì)剩余10 個(gè)環(huán)境因子依次進(jìn)行R2校正、約束軸置換檢驗(yàn)和P值校正，然后對(duì)模型進(jìn)行前向選擇，以選擇與尾礦庫(kù)及毗鄰區(qū)域土壤古菌群落相似矩陣（Bray-Curtis）顯著相關(guān)的環(huán)境因子。最終保留了232Th、pH、TN、TOC、EC 共5個(gè)顯著影響尾礦庫(kù)古菌物種群落的環(huán)境因子（P<0.05）。前向選擇后的db-RDA 結(jié)果顯示（圖6A），67.37%的總變差可以由232Th、pH、TN、TOC、EC因子解釋。232Th與大多數(shù)古菌物種（ASV）呈顯著負(fù)相關(guān)，圖中尾礦庫(kù)內(nèi)外采樣點(diǎn)位并未出現(xiàn)明顯分離，這也再一次驗(yàn)證了庫(kù)區(qū)內(nèi)外土壤古菌群落組成具有相似性的結(jié)論。為了揭示主要環(huán)境因子對(duì)群落結(jié)構(gòu)變化的相對(duì)貢獻(xiàn)，基于db-RDA 模型進(jìn)行VPA（圖6B）。由圖6（B）可知，土壤理化因子（pH、TN、TOC、EC）比放射性核素232Th解釋了更多的物種差異方差，兩者解釋了古菌52.35%的總變差，它們之間的相互作用解釋了6.00%的總變差。

圖6 尾礦庫(kù)及毗鄰區(qū)域土壤古菌物種（ASV）與環(huán)境因子關(guān)系的冗余分析和方差分解分析Figure 6 Distance-based redundancy analysis（db-RDA）and variance partitioning analysis（VPA）of the relationship between soil archaeal species（ASV）and environmental factors in tailings reservoirs and adjacent areas

3 討論

經(jīng)治理后的鈾尾礦庫(kù)作為一個(gè)潛在的風(fēng)險(xiǎn)源，可能會(huì)受到自然或人為因素的干擾，導(dǎo)致放射性核素和重金屬/類(lèi)金屬的遷移和擴(kuò)散，從而影響尾礦庫(kù)及其周?chē)h(huán)境的質(zhì)量和公眾健康[7-8]。鑒于可以快速反映土壤環(huán)境質(zhì)量變化，古菌可被選為反映土壤環(huán)境質(zhì)量的指標(biāo)[39]。通過(guò)對(duì)該鈾尾礦庫(kù)及毗鄰區(qū)域土壤古菌群落的研究，探索土壤環(huán)境因子與古菌群落的相互關(guān)系，及時(shí)發(fā)現(xiàn)放射性核素、重金屬/類(lèi)金屬的遷移和擴(kuò)散，從微生態(tài)－古菌視角評(píng)估尾礦庫(kù)退役治理效果，對(duì)維護(hù)尾礦庫(kù)及其周?chē)鷳B(tài)環(huán)境安全和公眾健康具有十分重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，該尾礦庫(kù)及其毗鄰區(qū)域土壤屬于堿性土壤[8]，Navarro-Noya 等[40]對(duì)異質(zhì)高鹽堿性土壤中古菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，在高堿性土壤中Candida-tus_Nitrososphaera及其相近菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，這與本研究的發(fā)現(xiàn)相一致。Tripathi 等[41]發(fā)現(xiàn)土壤pH 值能影響氨氧化古菌的豐富度和多樣性。氨氧化古菌分類(lèi)群都適應(yīng)中性或微堿性的條件[42]。本研究中屬于氨氧化古菌的Candidatus_Nitrocosmicus菌屬、Candi-datus_Nitrososphaera菌屬為研究區(qū)域土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬，表明這兩種菌屬能較好地適應(yīng)堿性土壤。Crenar-chaeota 菌門(mén)廣泛分布在海洋和陸地生境中，在pH 和溫度適中的各種水生和陸地環(huán)境中，該菌門(mén)均為優(yōu)勢(shì)菌群[43]。對(duì)該尾礦庫(kù)及毗鄰區(qū)域進(jìn)行古菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，Crenarchaeota菌門(mén)是第一優(yōu)勢(shì)菌群，表明尾礦庫(kù)與其周邊區(qū)域土壤環(huán)境具有普遍性。魏天嬌等[44]發(fā)現(xiàn)氮元素對(duì)氨氧化古菌具有促進(jìn)作用，本研究也發(fā)現(xiàn)屬于氨氧化古菌的Candidatus_Nitrososphaera菌屬與TN呈極顯著正相關(guān)，這也為氮元素對(duì)氨氧化古菌的促進(jìn)作用[42]提供了合理的論據(jù)。Kotelnikova等[45]發(fā)現(xiàn)堿性湖泊沉積物中分離出來(lái)的甲烷桿菌的最佳pH是在8.1~9.1之間，尾礦庫(kù)所在區(qū)域pH范圍為7.79~9.23，這解釋了在尾礦庫(kù)土壤古菌樣品中出現(xiàn)了豐度較高的Methanobacterium屬的原因。

通過(guò)對(duì)尾礦庫(kù)及毗鄰區(qū)域土壤古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析可知，庫(kù)區(qū)內(nèi)、外土壤古菌多樣性和豐富度具有相似性，說(shuō)明尾礦庫(kù)與周邊區(qū)域的土壤環(huán)境從微生態(tài)-古菌視角看已無(wú)明顯差異。盡管土壤pH、TN、TOC、232Th、EC 是影響研究區(qū)域土壤中古菌群落的主要環(huán)境因子，但這些環(huán)境因子的測(cè)定值均處于當(dāng)?shù)赝寥赖谋尘爸捣秶鷥?nèi)，并未顯著影響庫(kù)區(qū)內(nèi)外土壤古菌群落結(jié)構(gòu)。反之，土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的變化未反映出該尾礦庫(kù)中放射性核素、重金屬/類(lèi)金屬的遷移和擴(kuò)散，微生態(tài)-古菌視角與前期該尾礦庫(kù)宏觀生態(tài)評(píng)價(jià)相一致[7-8]。

4 結(jié)論

（1）在門(mén)和屬水平上，Crenarchaeota（泉古菌門(mén)）、Euryarchaeota（廣古菌門(mén)）、Halobacterota 菌門(mén)和一個(gè)未分類(lèi)菌門(mén)（unidentified_Archaea）為相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。Candidatus_Nitrocosmicus（亞硝化侏儒菌屬）、Methanobacterium（甲烷桿菌屬）、Candida-tus_Nitrososphaera菌屬為相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌屬。盡管尾礦庫(kù)內(nèi)與其毗鄰區(qū)域土壤中優(yōu)勢(shì)菌群呈現(xiàn)不均勻分布，但尾礦庫(kù)內(nèi)外土壤優(yōu)勢(shì)古菌群落結(jié)構(gòu)基本已無(wú)顯著差異。

（2）土壤古菌群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)，尾礦庫(kù)內(nèi)與毗鄰區(qū)域表層土壤（0~15 cm）古菌菌落多樣性已不存在差異，土壤古菌群落組成具有相似性。

（3）土壤pH、TN、TOC、232Th、EC 是影響庫(kù)區(qū)內(nèi)外優(yōu)勢(shì)古菌群落的主要環(huán)境因子，但這些因子并未造成庫(kù)區(qū)內(nèi)外土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的顯著改變。

（4）尾礦庫(kù)與毗鄰區(qū)域的土壤古菌群落已無(wú)明顯差異，說(shuō)明尾礦庫(kù)內(nèi)外土壤古菌群落并未受到放射性核素、重金屬/類(lèi)金屬的顯著影響，意味著放射性核素、重金屬/類(lèi)金屬未發(fā)生遷移和擴(kuò)散，這與前期宏觀生態(tài)視角的評(píng)價(jià)結(jié)果一致。