柴芍承氣湯對膿毒癥大鼠胰腺損傷的影響及機制研究

馮萍 ，吳深寶 ，季峰

1.浙江大學(xué)國際健康醫(yī)學(xué)研究院，浙江 義烏 322000； 2.義烏市中心醫(yī)院，浙江 義烏 322000；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310000

膿毒癥（sepsis）是機體應(yīng)對感染失衡導(dǎo)致的可危及生命的全身炎癥反應(yīng)綜合征，最終會導(dǎo)致膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征[1]。華盛頓大學(xué)健康指標與評估研究所（IHME）對1990－2017年全球膿毒癥的發(fā)病率和病死率進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，2017年因膿毒癥死亡人數(shù)占全球死亡總?cè)藬?shù)的19.7%[2]。目前膿毒癥相關(guān)研究主要集中在肺臟、腎臟和肝臟等，但膿毒癥相關(guān)胰腺損傷同樣具有重要意義[3]。且胰腺損傷會進一步通過內(nèi)分泌失調(diào)、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)使病情加劇[4]。因此，減輕胰腺損傷對治療膿毒癥十分重要。

半胱氨酸白三烯（CysLT）主要由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，作為炎癥介質(zhì)廣泛存在于機體中[5]。阻斷或選擇性抑制CysLT對炎癥狀態(tài)（如哮喘、結(jié)腸炎及胰腺損傷）具有改善作用[6]。核因子（NF）-κB通路作為調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號通路，能誘導(dǎo)腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-1β等炎癥因子表達[7]，阻斷該通路可減輕相關(guān)器官炎癥損傷。CysLT受體1（CysLTR1）可通過NF-κB通路誘導(dǎo)炎癥細胞趨化和活化，從而促進炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展[8]。

柴芍承氣湯是在大承氣湯基礎(chǔ)上加柴胡、黃芩、白芍組成。有研究表明，針對胰腺的缺血壞死，柴芍承氣湯能抑制胰蛋白酶分泌及活性，改善胰腺微循環(huán)并修復(fù)微血管內(nèi)皮損傷，抑制炎癥因子釋放，從而改善相關(guān)癥狀[9-10]。但柴芍承氣湯改善膿毒癥繼發(fā)胰腺損傷的具體機制尚不清楚。本研究通過建立膿毒癥繼發(fā)胰腺損傷大鼠模型，檢測胰腺組織CysLTR1和NF-κB表達，探討柴芍承氣湯對膿毒癥胰腺損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量（320±30）g，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，動物許可證號SYXK（浙）2021-0012。飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、濕度55%～65% SPF動物房，自由進食飲水。本實驗經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批（20221101）。

1.2 藥物及制備

柴芍承氣湯由白芍10 g、柴胡10 g、黃芩10 g、枳實10 g、厚樸10 g、生大黃10 g、玄明粉10 g組成，將前5味藥物飲片置于容器中，加入純凈水煮沸18 min，關(guān)火后加入生大黃浸泡2 min，過濾，在濾液中加入玄明粉，冷卻至室溫。湯劑由義烏市中心醫(yī)院中醫(yī)科制備。

1.3 主要試劑及儀器

脂質(zhì)過氧化物（LPO）試劑盒，南京建成，貨號A106-1；谷胱甘肽（GSH）試劑盒，南京建成，貨號A006-1；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒，南京建成，貨號A044；RIPA組織細胞快速裂解液，北京索萊寶，貨號R0010；BCA蛋白定量試劑盒，美國Thermo，貨號PICPI23223； NC 膜， 美 國Millipore， 貨 號HATF00010；CysLTR1 抗體，上海碧云天，貨號Orb182861；NF-κB 抗體，美國CST，貨號#8242；TUNEL試劑盒，瑞士Roche公司，貨號11684817910；DAB 濃縮型試劑盒，上海長島生物，貨號FL-6001；免疫組化試劑盒，福州邁新生物，貨號KIT-5002；廣譜二抗，上海長島生物，貨號D-3004；蛋白預(yù)染Marker，F(xiàn)ermentas，貨號SM1811；HRP 標記二抗，上海碧云天，貨號分別為A0208、A0181、A0216。

電泳儀（Bio-Rad公司，型號mini protean 3 cell），電轉(zhuǎn)儀（大連競邁科技有限公司，型號PS-9），酶標儀（芬蘭雷勃酶標儀，型號MK3），正置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號CX41）。

1.4 分組、造模及給藥

36只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、膿毒癥組和柴芍承氣湯組，每組12只。膿毒癥組和柴芍承氣湯組行盲腸結(jié)扎穿孔法建立膿毒癥模型[11]：術(shù)前大鼠禁食不禁水12 h，異氟烷吸入麻醉，于腹部行正中切口，暴露盲腸并結(jié)扎其根部，用16號針對盲腸穿刺3次形成腸瘺，并留置2 cm×2 mm橡皮條引流。將盲腸回納，逐層縫合腹部切口，皮下注射生理鹽水50 mL/kg抗休克。手術(shù)完畢放回鼠籠飼養(yǎng)觀察，自由進食飲水，手術(shù)全程遵循無菌原則。對照組僅行開關(guān)腹操作。柴芍承氣湯組于造模前1 h及造模后6 h各灌胃1次，灌胃體積5 mL/100 g，膿毒癥組和對照組灌胃等體積無菌生理鹽水。造模后6 h脫頸處死大鼠，造模及灌胃過程中各組均無大鼠死亡。

1.5 生化檢測

取相同質(zhì)量胰腺組織，加入9 倍體積生理鹽水，4 ℃勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書操作分別檢測MPO、LPO、GSH水平。

1.6 免疫組化檢測

取胰腺組織（約1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm），經(jīng)固定、包埋及切片后，進行抗原修復(fù)，滴加CysLTR1 一抗（1∶300）、NF-κB一抗（1∶1 000），4 ℃濕盒孵育過夜，滴加HRP標記二抗孵育，DAB顯色，封片。在100倍顯微鏡下，每個樣本隨機選取8～10個視野，使用Image Pro Plus軟件計算平均光密度。

1.7 Western blot檢測

胰腺組織加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，按照20 mg組織加入150～260 μL裂解液比例進行勻漿，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液，BCA法進行蛋白定量。蛋白上樣后，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至NC 膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入CysLTR1 一抗（1∶300）、NF-κB 一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶1 500），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，按1∶1 000加入HRP標記二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗滌，發(fā)光液顯色處理，凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應(yīng)用Quantity One軟件進行灰度值分析，計算目標蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值，即蛋白相對表達量。

1.8 TUNEL染色

胰腺組織切片加入TUNEL反應(yīng)液50 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，洗滌后滴加POD液50 μL，37 ℃反應(yīng)30 min，DAB染色，顯微鏡下觀察，以棕褐色為陽性表達，計算細胞凋亡率（凋亡細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%）。

1.9 相關(guān)性分析

將對照組及膿毒癥組大鼠進行整體分析，以膿毒癥組與對照組CysLTR1差值為橫坐標，NF-κB差值為縱坐標，采用雙變量線性回歸分析法求得回歸方程，計算相關(guān)系數(shù)（r）。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布用±s表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柴芍承氣湯對模型大鼠胰腺組織髓過氧化物酶、脂質(zhì)過氧化物、谷胱甘肽水平的影響

與對照組比較，膿毒癥組胰腺組織MPO、LPO水平顯著升高，GSH 水平顯著降低（P＜0.001）；柴芍承氣湯組胰腺組織MPO、LPO水平顯著降低，GSH水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠胰腺組織MPO、LPO、GSH水平比較（±s）

表1 各組大鼠胰腺組織MPO、LPO、GSH水平比較（±s）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與膿毒癥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

GSH/（mg/g）5.53±0.38 1.68±0.37***2.90±0.37#組別對照組膿毒癥組柴芍承氣湯組只數(shù)12 12 12 MPO/（U/g）1.07±0.16 3.68±0.44***2.66±0.19#LPO/（μmoL/g）0.60±0.08 1.97±0.17***1.49±0.10##

2.2 柴芍承氣湯對模型大鼠胰腺組織半胱氨酸白三烯受體1、核因子-κB表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，與對照組比較，膿毒癥組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB 表達顯著升高（P＜0.001，P＜0.01）；與膿毒癥組比較，柴芍承氣湯組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達顯著降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB陽性表達（免疫組化染色，×200）

表2 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達比較（±s，平均光密度）

表2 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達比較（±s，平均光密度）

注：與對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與膿毒癥組比較，#P＜0.05

NF-κB 328.00±96.63 603.33±50.64**512.33±16.65#組別對照組膿毒癥組柴芍承氣湯組只數(shù)12 12 12 CysLTR1 594.67±124.31 1 164.00± 94.60***859.00± 41.39#

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，膿毒癥組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB 蛋白表達顯著升高（P＜0.001）；與膿毒癥組比較，柴芍承氣湯組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB蛋白表達顯著降低（P＜0.001）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與膿毒癥組比較，###P＜0.001

NF-κB 0.121 6±0.008 2 0.572 4±0.026 8***0.361 7±0.010 8###組別對照組膿毒癥組柴芍承氣湯組只數(shù)12 12 12 CysLTR1 0.082 5±0.001 4 0.545 6±0.010 5***0.382 7±0.030 3###

2.3 柴芍承氣湯對模型大鼠胰腺組織細胞凋亡的影響

與對照組比較，膿毒癥組大鼠胰腺組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.001）；與膿毒癥組比較，柴芍承氣湯組大鼠胰腺組織細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠胰腺組織細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×200）

表4 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB凋亡率比較（±s，%）

表4 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB凋亡率比較（±s，%）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與膿毒癥組比較，##P＜0.01

凋亡率33.31±6.19 65.08±5.39***43.83±4.88##組別對照組膿毒癥組柴芍承氣湯組只數(shù)12 12 12

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

對免疫組化和Western blot 檢測的膿毒癥組與對照組CysLTR1、NF-κB差值進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，NF-κB 表達與CysLTR1 表達呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），2種檢測方法r分別為0.732 0和0.642 4。見表5。

表5 2種檢測方法的胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達相關(guān)性分析

3 討論

膿毒癥是宿主對感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，中心環(huán)節(jié)是失控性的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭和膿毒性休克，是重癥感染死亡的主要原因[12]。胰腺損傷是膿毒癥重要的器官功能障礙之一，膿毒癥引起的胰腺損害是由多因素、多條件介導(dǎo)的病理過程，可能涉及由細菌移位引起的內(nèi)毒素血癥、臟器及血管缺血再灌注損傷、血栓形成和代謝及免疫功能抑制等多方面[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠胰腺組織細胞凋亡率顯著升高，表明在膿毒癥中存在胰腺組織細胞水平的損傷。研究顯示，危重患者如果在原發(fā)疾病基礎(chǔ)上出現(xiàn)胰酶水平升高，可使病情進一步惡化甚至導(dǎo)致死亡[15-16]。因此，對胰腺組織損傷機制的研究需要進一步深入。本研究也發(fā)現(xiàn)，膿毒癥損傷的胰腺組織中，反映炎癥程度的MPO和LPO水平上調(diào)，具有抗炎、抗氧化作用的GSH水平下調(diào)，提示膿毒癥引起的組織損傷是失調(diào)性炎癥反應(yīng)。

CysLT是由花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶催化而生成的一類活性很強的炎癥介質(zhì)，是過敏性慢反應(yīng)物質(zhì)，具有強烈促炎作用，通過細胞表面受體CysLTR1 和CysLTR2 發(fā)揮作用[17]。CysLT 可以提高血管通透性，引起炎癥細胞趨化及浸潤，并引起相關(guān)炎癥因子釋放，誘導(dǎo)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。不僅參與過敏性鼻炎、支氣管哮喘等發(fā)病過程，對缺血引起的腦細胞損傷同樣起到重要作用[18]。研究表明，CysLTR的特異性阻滯劑孟魯司特鈉能提高GSH水平，減輕脂質(zhì)過氧化，抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而對膿毒癥引起的胰腺、小腸、肝臟損傷產(chǎn)生保護作用[19]。本研究膿毒癥組大鼠胰腺組織CysLTR1蛋白表達較對照組顯著升高，說明膿毒癥引起的胰腺損傷可能由CysLTR1介導(dǎo)。

NF-κB作為真核細胞的核轉(zhuǎn)錄因子，在正常細胞質(zhì)中為無活性物質(zhì)。當炎癥介質(zhì)或內(nèi)毒素等刺激后，NF-κB活化并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與炎癥相關(guān)物質(zhì)特定的基因序列結(jié)合并轉(zhuǎn)錄，從而引起炎癥反應(yīng)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，CysLT可引起NF-κB活性增強，促進靶基因轉(zhuǎn)錄，從而引起炎癥介質(zhì)釋放增加[8]；Wang等[21]研究表明，激活CysLTR1介導(dǎo)的NF-κB信號通路可誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥，引起神經(jīng)損傷。提示NF-κB作為CysLTR下游通路，受CysLTR1調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，CysLTR1與NF-κB表達呈正相關(guān)，在一定程度上表明CysLTR1 可介導(dǎo)NF-κB通路活化。NF-κB通路也參與由膿毒癥引起的組織器官損害：Shang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過抑制NF-κB通路減輕膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷；El-Tanbouly等[23]也發(fā)現(xiàn)，NF-κB抑制劑雷公藤紅素可減輕因盲腸結(jié)扎和穿刺誘導(dǎo)的大鼠急性肝功能障礙。本研究膿毒癥組大鼠胰腺組織NF-κB表達顯著升高，提示膿毒癥引起的胰腺損傷可能存在NF-κB信號通路活化。

膿毒癥基本病機在于正虛毒損和絡(luò)脈瘀滯，根本為正氣不足、毒邪內(nèi)蘊，并在此基礎(chǔ)上進一步發(fā)展成機體陽脫陰竭、氣陰兩虛。柴芍承氣湯是治療膿毒癥胰腺損傷的重要方劑，具有通里攻下、峻下熱結(jié)作用。研究顯示，大黃有效成分能有效抑制胰酶分泌和腸道細菌內(nèi)毒素滋生[24]；柴胡中柴胡皂苷具有抑制胰蛋白酶、抗炎、調(diào)節(jié)免疫及解熱鎮(zhèn)痛作用[25]；白芍中白芍總苷可通過抑制NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng)，減少胰腺細胞凋亡[26]；厚樸可通過阻斷NF-κB信號通路減少TNF-α和IL-6釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)[27]。本研究中膿毒癥大鼠經(jīng)柴芍承氣湯干預(yù)后，胰腺組織細胞凋亡顯著減少，MPO、LPO水平顯著降低，GSH水平升高，表明柴芍承氣湯對胰腺損傷具有一定保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，柴芍承氣湯可顯著降低胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達，推測柴芍承氣湯可能通過抑制CysLTsR1/NF-κB通路從而減輕膿毒癥胰腺損傷。本研究可為臨床治療膿毒癥胰腺損傷提供新思路。