基于BDNF/TrkB信號通路的鎖陽黃酮對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的影響

呂鑫 ，顧志榮 ，祁梅 ，郭燕 ，毛小文 ，葛斌

1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

鎖陽為鎖陽科植物鎖陽Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質莖[1]，其有效部位鎖陽黃酮主要由兒茶素、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、表兒茶素、蕓香苷、表兒茶素沒食子酸酯等成分組成[2]，具有抗氧化[3]、延緩衰老[4]、清除自由基及調節(jié)免疫[5]等多種活性。阿爾茨海默?。ˋD）是一種多見于老年人的漸進性、致殘性神經(jīng)退行性病變，以認知功能減退、記憶力下降、語言功能障礙等為主要臨床表現(xiàn)，嚴重者完全喪失生活能力[6]。AD主要病理改變是皮層和海馬神經(jīng)元外的β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積及神經(jīng)元內高度磷酸化的Tau蛋白形成纖維纏結[7-8]。BDNF/TrkB信號通路與海馬學習記憶能力相關，因此與AD關系密切。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過結合和激活酪氨酸激酶受體B（TrkB）維持突觸生長和可塑性，抑制神經(jīng)細胞凋亡及調控中樞膽堿能系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[9]。研究表明，BDNF可通過改變突觸前的遞質釋放，或增加突觸后的遞質敏感性調節(jié)突觸效能[10-11]，從而提高突觸可塑性。乙酰膽堿（ACh）是調節(jié)認知功能的神經(jīng)遞質，在AD患者海馬中水平降低[12-13]，前期研究表明，BDNF蛋白表達與ACh含量呈正相關[14]。BDNF結合TrkB受體后可激活下游PI3K/Akt、MAPK/ERK等抗凋亡通路[15]。因此，本實驗通過海馬注射Aβ1-42誘導AD大鼠模型，觀察鎖陽黃酮對模型大鼠行為學，海馬組織BDNF、TrkB、ACh及凋亡相關蛋白表達的影響，揭示其抗AD的作用機制，為AD治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

4 月齡SPF 級雄性Wistar 大鼠70 只，體質量（250±50）g，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2020-0002。飼養(yǎng)于甘肅省藥品檢驗研究院SPF級動物實驗室，動物使用許可證號SYXK（甘）2020-0006。

1.2 藥物及制備

鎖陽藥材，2021年3月采集于內蒙古，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為鎖陽Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質莖。由實驗室按前期方法制備鎖陽黃酮[16]，用生理鹽水分別配制成濃度為2.5、5、10 mg/mL 溶液。Aβ1-42凍干粉（貨號04010011827，強耀生物），使用前37 ℃孵育1周，使其呈凝聚態(tài)備用。取Aβ1-42凍干粉1 mg 溶于50 μL DMSO 中，加生理鹽水至200 μL，稀釋成5 μg/μL，分裝后，避光保存于-80 ℃冰箱備用。鹽酸多奈哌齊片（貨號2010023），5 mg/片，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)，用生理鹽水配制成0.05 mg/mL水溶液。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL 試劑盒（貨號49330900），瑞士羅氏；Bax 抗體（貨號50599-2-1g），武漢三鷹；Bcl-2 抗體（貨號A19693）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-9抗體（貨號A18676）、TrkB抗體（貨號A19832），武漢愛博泰克；BDNF 抗體（貨號ab108319），上海艾博抗；Caspase-3抗體（貨號AF6311），江蘇親科生物；膽堿乙酰轉移酶（ChAT）、ACh、乙酰膽堿酯酶（AChE）ELISA 試劑盒（貨號分別為ZC-36507、ZC-37533、ZC-37535），上海茁彩。大鼠跳臺記錄儀（型號DB097），北京智鼠多寶；透射電子顯微鏡（型號JEM-1400FLASH），日本電子株式會社；大鼠腦立體定位儀（型號WT-200），成都泰盟；轉輪式切片機（型號2016），德國徠卡；數(shù)字切片掃描儀（型號Pannoramic 250），匈牙利3DHIESTECH；全功能酶標儀（型號MK3），美國Thermo Fisher；高速低溫組織研磨儀（型號KZ-Ⅲ-F），武漢賽維爾。

1.4 造模

70只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機選取10只作為空白組、10只作為假手術組。剩余大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉，參照腦立體定位坐標[17]確定海馬位置：前囟后沿中線移3.0 mm，左右各旁開2.2 mm，硬腦膜下深3 mm。用牙科鉆在定位點鉆孔，用微量進樣器在兩側各緩慢注射Aβ1-42溶液1 μL?？瞻捉M不予處理，假手術組注射等體積生理鹽水。退針完畢縫合傷口，單籠飼養(yǎng)至大鼠傷口痊愈。

1.5 分組及給藥

將造模大鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組和鎖陽黃酮低、中、高劑量組，每組10只。造模后3 d開始灌胃，多奈哌齊組予多奈哌齊溶液0.5 mg/kg，鎖陽黃酮低、中、高劑量組予鎖陽黃酮溶液25、50、100 mg/kg，灌胃體積1 mL/100 g，空白組、假手術組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)28 d。

1.6 跳臺實驗

跳臺實驗分學習階段和記憶階段[18]。學習階段先將大鼠放入跳臺箱中自由活動3 min，再通以36 V電壓，大鼠受到刺激后正確反應是跳上平臺躲避電擊，錯誤反應是跳下平臺受到電擊，24 h后再次實驗檢測大鼠記憶保持能力。記錄學習階段與記憶階段第1次跳下平臺的潛伏期及5 min內錯誤次數(shù)。

1.7 取材

跳臺實驗結束后，3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，股動脈取血，靜置2 h，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存，用于ELISA檢測。取血后脫頸處死大鼠，取3只分離全腦，置于4%多聚甲醛中固定，用于TUNEL染色。剩余大鼠冰盒上迅速取腦并分離雙側海馬，取黃豆大小海馬組織用3%戊二醛固定，用于透射電鏡觀察，剩余海馬組織液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存，用于ELISA和Western blot檢測。

1.8 TUNEL染色

固定的腦組織經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟后，檸檬酸微波修復8 min，PBS洗3次，每次5 min。加TUNEL孵育液，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min。加DAPI染核15 min，PBS沖洗，甘油明膠封片，采用數(shù)字切片掃描儀進行掃描，計算細胞凋亡率（凋亡細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%）。

1.9 透射電鏡觀察

將戊二醛固定的海馬組織用1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片用甲苯胺藍染色作光學定位，鉆石刀作超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色后用透射電鏡觀察。

1.10 ELISA檢測

取海馬組織，加入9倍量PBS，充分研碎，勻漿液4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書操作，測定海馬組織及血清ChAT、ACh、AChE含量。

1.11 Western blot檢測

取海馬組織，加入10 倍量裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，30 μg蛋白上樣，先100 V電泳15 min，當溴酚藍到達分離膠后，再180 V電泳至溴酚藍到分離膠底部，200 mA轉膜1 h，加5%脫脂牛奶封閉，加Bax 一抗（1∶5 000）、Bcl-2 一抗（1∶2 000）、BDNF一抗（1∶2 000）、Caspase-3一抗（1∶2 000）、Caspase-9 一抗（1∶2 000）、TrkB 一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶100 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗孵育，超敏ECL曝光，凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行掃描，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.12 統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鎖陽黃酮對模型大鼠跳臺實驗結果的影響

與假手術組比較，模型組大鼠跳臺實驗學習和記憶階段潛伏期均明顯縮短（P＜0.01），錯誤次數(shù)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽黃酮高劑量組大鼠跳臺實驗學習和記憶階段潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），錯誤次數(shù)明顯減少（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠跳臺實驗結果比較（±s）

表1 各組大鼠跳臺實驗結果比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01

組別空白組假手術組模型組多奈哌齊組鎖陽黃酮低劑量組鎖陽黃酮中劑量組鎖陽黃酮高劑量組只數(shù)10 10 10 10 10 10 10學習階段潛伏期/s 178.14±77.49 190.30±79.39 92.35±46.95**169.83±63.17&&117.12±67.35 135.93±45.79 163.97±61.60&錯誤次數(shù)2.90±1.10 2.90±1.20 10.30±2.67**4.70±1.95&&8.90±3.21 7.30±2.83 5.90±1.91&記憶階段潛伏期/s 211.67±67.98 232.60±53.42 122.72±61.24**191.98±91.94&128.10±57.25 155.58±56.36 200.92±49.88&&錯誤次數(shù)1.70±1.06 1.50±0.85 8.40±2.91**3.40±1.26&&6.80±2.82 6.50±2.42 4.10±2.13&

2.2 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織細胞凋亡的影響

空白組和假手術組大鼠海馬組織無明顯細胞凋亡；與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽黃酮各劑量組大鼠海馬組織細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠海馬組織細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×400）

表2 各組大鼠海馬組織細胞凋亡率比較（±s，%）

表2 各組大鼠海馬組織細胞凋亡率比較（±s，%）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，&&P＜0.01

2.3 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織超微結構的影響

空白組和假手術組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞結構正常，突觸數(shù)量較多；模型組大鼠海馬組織大量神經(jīng)細胞凋亡，胞漿內可見腫脹的線粒體，部分粗面內質網(wǎng)擴張，突觸數(shù)量減少，突觸間隙增寬；多奈哌齊組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞線粒體輕度腫脹，粗面內質網(wǎng)輕度擴張，突觸數(shù)量較多；鎖陽黃酮低劑量組大鼠海馬組織多數(shù)神經(jīng)細胞凋亡，胞漿內可見腫脹的線粒體，部分粗面內質網(wǎng)輕度擴張，突觸數(shù)量和突觸小泡較少，突觸間隙增寬；鎖陽黃酮中劑量組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞少量凋亡，細胞核皺縮，染色質聚集，胞漿電子密度增大，線粒體腫脹，軸突內神經(jīng)纖維溶解、空化，突觸數(shù)量較少，突觸小泡較豐富，部分突觸間隙增寬；鎖陽黃酮高劑量組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞核輕度皺縮，細胞膜不連續(xù)，胞漿內容物丟失，突觸數(shù)量較多，突觸小泡輕度溶解，部分突觸間隙增寬。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞超微結構（標尺=1 μm）

圖3 各組大鼠海馬組織突觸超微結構（標尺=500 nm）

2.4 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織及血清膽堿乙酰轉移酶、乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織及血清ChAT、ACh含量明顯減少（P＜0.01），AChE含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽黃酮高劑量組大鼠海馬組織及血清ChAT、ACh含量明顯增加（P＜0.01，P＜0.05），AChE 含量明顯減少（P＜0.01，P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織及血清ChAT、ACh、AChE含量比較（±s）

表3 各組大鼠海馬組織及血清ChAT、ACh、AChE含量比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01

組別空白組假手術組模型組多奈哌齊組鎖陽黃酮低劑量組鎖陽黃酮中劑量組鎖陽黃酮高劑量組海馬組織只數(shù)血清AChE/（nmol/L）20.78±4.79 22.01±5.99 28.56±4.62**22.74±2.43&&27.10±5.83 26.39±3.44 23.91±5.42&6 6 6 6 6 6 6 ChAT/（pg/mL）51.02±7.27 51.99±7.76 28.42±6.21**44.25±8.77&&37.98±6.31&41.95±2.84&&44.51±7.24&&ACh/（μg/mL）53.03± 9.53 53.62±12.02 21.92± 6.81**46.38± 9.13&&30.58±11.01 35.42± 4.09&43.19± 8.24&&AChE/（nmol/L）11.81±1.78 12.46±1.75 20.07±4.26**14.34±2.76&&19.89±2.74 17.19±3.04 15.82±3.08&只數(shù)10 10 10 10 10 10 10 ChAT/（pg/mL）87.79±16.14 86.58±19.30 64.56±14.92**78.32±15.24&71.28±12.82 74.51± 7.01 78.00±10.21&ACh/（μg/mL）101.00±17.16 97.72±17.81 63.18± 8.37**88.89±10.22&&69.91± 9.03 76.72± 4.99&87.94± 9.13&&

2.5 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸蛋白酶-9、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和酪氨酸激酶受體B蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織Bcl-2、BDNF和TrkB蛋白表達明顯降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽黃酮高劑量組大鼠海馬組織Bcl-2、BDNF和TrkB蛋白表達明顯升高，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4、表4。

圖4 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、BDNF和TrkB蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、BDNF和TrkB蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、BDNF和TrkB蛋白表達比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01

TrkB 1.00±0.00 0.94±0.07 0.19±0.02**0.67±0.03&&0.31±0.03&&0.59±0.06&0.66±0.02&&組別空白組假手術組模型組多奈哌齊組鎖陽黃酮低劑量組鎖陽黃酮中劑量組鎖陽黃酮高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 3 Bcl-2 1.00±0.00 0.95±0.19 0.26±0.02**0.70±0.13&&0.30±0.04 0.59±0.06&&0.70±0.07&&Bax 1.00±0.00 1.02±0.12 4.15±0.15**1.61±0.22&&2.97±0.28&&2.29±0.45&&1.62±0.09&&Caspase-3 1.00±0.00 1.06±0.06 4.03±0.18**1.69±0.04&&3.51±0.20 2.83±0.10&1.70±0.06&&Caspase-9 1.00±0.00 0.92±0.07 2.68±0.45**1.47±0.18&&2.13±0.17&1.87±0.29&&1.52±0.31&&BDNF 1.00±0.00 0.96±0.13 0.23±0.03**0.68±0.03&&0.33±0.06 0.43±0.07 0.71±0.04&&

3 討論

中醫(yī)學認為，AD病機為腎精不足、腦髓漸空，臨床常用補腎益精中藥治療記憶力減退、理解能力降低、情緒低落等AD或類AD癥狀。鎖陽是補腎益精要藥，能補腎陽、益精血、利大便?，F(xiàn)代研究表明，鎖陽的神經(jīng)保護機制是多成分、多靶點共同作用的結果，主要通過降低腦組織氧化應激水平[19]、清除氧自由基[20]、調節(jié)線粒體動力失衡[21]、促進細胞再生及神經(jīng)突觸增長[22]、保護海馬細胞神經(jīng)元形態(tài)[23]等改善學習記憶能力，實現(xiàn)神經(jīng)保護作用。

Aβ引起的神經(jīng)毒性被認為是AD突觸功能和認知功能障礙的主要原因[24]。BDNF是哺乳動物海馬內分布最廣的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，具有促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、抗神經(jīng)元損傷、改善學習記憶能力等多種生物學活性[25]。研究表明，AD患者海馬區(qū)、內嗅皮層、新皮質和基底前腦表現(xiàn)為BDNF表達降低[26]，提示Aβ可降低BDNF表達，從而引起突觸丟失和認知功能損傷。本實驗結果表明，大鼠雙側海馬注射Aβ1-42后，跳臺實驗學習和記憶階段錯誤次數(shù)明顯增加，潛伏期明顯縮短，透射電鏡觀察顯示突觸數(shù)量減少、間隙增寬。經(jīng)鎖陽黃酮干預后，模型大鼠認知功能損傷和突觸超微結構得到改善。BDNF通過與TrkB受體結合，導致TrkB酪氨酸殘基自磷酸化，并激活下游信號通路。此外，BDNF/TrkB 還可以激活PI3K/Akt 信號通路，誘導BDNF自分泌，破壞糖原合成酶激酶-3磷酸化，從而改善AD大鼠學習記憶能力[27-28]。PI3K/Akt信號通路與細胞凋亡聯(lián)系密切，其中Bcl-2和Bax蛋白能有效調節(jié)細胞凋亡。AD患者海馬組織Bcl-2表達降低，Bax表達升高，從而激活Caspase并觸發(fā)依賴性凋亡級聯(lián)反應，激活的Caspase可修飾蛋白質，在Aβ1-42引起的細胞凋亡中發(fā)揮關鍵作用[29]。本實驗結果表明，模型組大鼠海馬組織細胞凋亡率明顯升高，多數(shù)神經(jīng)細胞凋亡，Bcl-2、BDNF 和TrkB 蛋白 表 達 明 顯 下 調，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯上調，鎖陽黃酮能降低模型大鼠海馬組織細胞凋亡率，逆轉上述蛋白表達，提示其能激活BDNF/TrkB信號通路，從而抑制細胞凋亡。ACh是膽堿能傳導通路中的關鍵神經(jīng)遞質，研究表明，其含量與學習記憶能力呈正相關[30]。AChE和ChAT是維持ACh含量動態(tài)平衡的關鍵酶，在AD發(fā)生時，大量膽堿能神經(jīng)元丟失，ChAT水平降低造成ACh合成、儲存與釋放大幅減少，進而引起學習、記憶和識別功能障礙[31]。本實驗結果顯示，模型組大鼠海馬組織及血清ChAT、ACh含量明顯減少，AChE含量明顯增加，鎖陽黃酮高劑量組海馬組織及血清ChAT、ACh含量明顯增加，AChE含量明顯減少，表明其能改善膽堿能系統(tǒng)損傷，增強膽堿能系統(tǒng)功能。

綜上所述，鎖陽黃酮能改善Aβ1-42誘導的AD模型大鼠學習記憶能力，其機制可能與激活海馬組織BDNF/TrkB 信號通路，增加中樞膽堿能系統(tǒng)ACh 含量，抑制細胞凋亡及增加突觸可塑性有關。