氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹的急性毒性研究

吳松，黃曉麗，陶月，覃東立，陳中祥，郝其睿，高磊，王海濤，孫言春，王鵬，張穎

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江省黑土保護與修復(fù)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

近年來，水稻與水產(chǎn)養(yǎng)殖動物互利共生的稻漁綜合種養(yǎng)的生態(tài)養(yǎng)殖模式在我國各地蓬勃發(fā)展[1]，稻漁綜合種養(yǎng)的規(guī)模和水產(chǎn)品產(chǎn)量不斷提升[2]。據(jù)統(tǒng)計，2020 年中國稻田養(yǎng)殖總面積為253 ×104hm2，水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)325×104t[3]。稻蟹養(yǎng)殖是稻漁綜合種養(yǎng)的主要模式之一。2020 年，全國稻蟹的產(chǎn)量為6.32×104t，養(yǎng)殖面積為12.7×104hm2，僅次于稻蝦和稻魚綜合種養(yǎng)，位居全國第三位[2,3]。目前，我國的稻蟹綜合種養(yǎng)模式中幾乎全部以中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）作為養(yǎng)殖對象[4]。隨著中華絨螯蟹的養(yǎng)殖規(guī)模和市場需求的逐年增大，其養(yǎng)殖條件和質(zhì)量安全也得到越來越多的關(guān)注[5-8]。在水稻種植過程中，為了防治雜草和病蟲害而施用除草劑和殺蟲劑，這些農(nóng)藥可能影響稻田養(yǎng)殖的水產(chǎn)動物和水產(chǎn)品產(chǎn)量及質(zhì)量[9,10]。因此，研究稻田施用農(nóng)藥對蟹的毒性效應(yīng)十分必要。

不同種類農(nóng)藥對中華絨螯蟹的毒性效應(yīng)不同。長時間暴露在氟蟲腈[5]、辛硫磷[10]、吡蟲啉[10]和敵百蟲[11]等殺蟲劑下，中華絨螯蟹會出現(xiàn)中毒癥狀。陳尚朝等[12]研究了兩種有機磷類殺蟲劑對中華絨螯蟹的毒性作用，發(fā)現(xiàn)部分有機磷類藥物可以降低中華絨螯蟹的代謝活動，影響長發(fā)育。施用有機磷藥物會抑制處于生長期的中華絨螯蟹的耗氧量及排氨量，降低其代謝水平。草酮、氰氟草酯和芐嘧磺隆·丙草胺3 種除草劑在中華絨螯蟹稻田間推薦用量5～6 倍濃度下，未見急性中毒反應(yīng)[13]。苯噻酰草胺[14]和草甘膦[15]可顯著影響中華絨螯蟹免疫指標(biāo)。氯蟲苯甲酰胺（Chlorantraniliprole），俗稱“康寬”，是是我國稻田最常用的高效雙酰胺類殺蟲劑[16-19]，對防治稻田小菜蛾[20]、二化螟[21]、瓢蟲[22-23]和大型水蚤[24]等效果顯著。近年來，已開展了氯蟲苯甲酰胺對鯉（Cyprinus carpio）、克林雷氏鯰（Rhamdia quelen）等水產(chǎn)動物的毒性效應(yīng)的研究[25,26]，但對中華絨螯蟹的研究尚未見報道。

東北地區(qū)稻蟹綜合種養(yǎng)模式發(fā)展較快，以遼寧為代表，養(yǎng)殖面積達(dá)13×104hm2[2]。本研究以東北地區(qū)稻田養(yǎng)殖的中華絨螯蟹幼蟹和成蟹為研究對象，開展了氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹幼蟹和成蟹的急性毒性實驗，以掌握該農(nóng)藥對中華絨螯蟹的損害程度，評價其對中華絨螯蟹的安全性，為稻漁綜合種養(yǎng)過程中的合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用中華絨螯蟹幼蟹體質(zhì)量（21.32±2.10）g和成蟹（87.32±9.20）g（以下簡稱幼蟹和成蟹）于2021 年6 月購自遼寧省盤錦市盤山縣胡家鎮(zhèn)養(yǎng)殖場，在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖車間使用曝氣自來水暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間平均水溫（22±2）℃，pH 為6.85～7.46，投喂浸泡好的碎玉米粒。暫養(yǎng)結(jié)束后隨機選取規(guī)格統(tǒng)一、健康無病、附肢齊全的成蟹和幼蟹進(jìn)行急性毒性實驗。

氯蟲苯甲酰胺懸浮劑（20%）購買自富美實（中國）投資有限公司，詳細(xì)信息見表1；二甲基甲酰胺為分析純，購買自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；便攜式水質(zhì)測定儀（YSI 2030，美國）。

表1 實驗用殺蟲劑基本信息Tab.1 Basic information on the test pesticide

1.2 方法

急性毒性實驗在長50 cm、寬40 cm、高40 cm（實際盛水20 L）的玻璃魚缸中進(jìn)行。實驗用水為曝氣自來水。采用靜水式體外暴露法[16]。實驗期間不投喂，水溫20℃～25℃、pH6.75～7.36，水體溶解氧（DO）含量保持在5.5 mg·L-1以上。預(yù)實驗確定成蟹的24 h 全死亡濃度（3 000 mg·L-1）和96 h 無死亡濃度（50 mg·L-1）。在50～3 000 mg·L-1的濃度之間，按照等比級數(shù)設(shè)6 個濃度梯度（表2）。同時確定幼蟹的24 h 全死亡濃度（3 500 mg·L-1）和96 h 無死亡濃度（75 mg·L-1）。在75～3 500 mg·L-1之間，按照等比級數(shù)設(shè)6 個濃度梯度（表2）。設(shè)置曝氣自來水空白對照組和二甲基甲酰胺助溶劑對照組，每個濃度組設(shè)4 個平行。每個玻璃缸投放6 只中華絨螯蟹，以96 h 為一個實驗周期，每24 h 更換一次實驗溶液。實驗開始后，定時觀察實驗蟹的存活狀況，測定水體pH、DO 濃度和溫度，記錄實驗蟹在24 h、48 h、72 h、96 h 時的行為變化和死亡情況，及時撈出死亡的實驗蟹。

表2 氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹的實驗濃度Tab.2 Experimental concentration of chlorantraniliprole on Chinese mitten handed crab

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±SD）表示，利用SPSS 19.0 軟件中單因素方差分析法（One-way ANOVA）分析不同藥物濃度梯度間差異。當(dāng)數(shù)據(jù)存在顯著性差異時，利用Duncan 法進(jìn)行多重比較。以P<0.05 差異顯著水平，P<0.01 為差異極顯著水平。半致死濃度（LC50）和安全濃度（SC）采用寇氏法[14]計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯蟲苯甲酰胺對成蟹的急性毒性

空白組和溶劑對照組中的成蟹未見異常反應(yīng)，活力正常，說明助溶劑二甲基甲酰胺對實驗結(jié)果沒有影響。實驗組中，隨著暴露時間的延長，成蟹表現(xiàn)出不同程度的中毒現(xiàn)象。在50 mg·L-1濃度下，大多數(shù)成蟹無中毒癥狀，活力基本正常，僅個別成蟹游動變緩，中毒現(xiàn)象較輕；在113 mg·L-1濃度組，72 h后成蟹呈應(yīng)激反應(yīng)遲鈍、抱團等中毒癥狀；257 mg·L-1和583 mg·L-1濃度組，48 h 后成蟹逐漸出現(xiàn)活力下降、抱團、附肢脫落、個體死亡等中毒現(xiàn)象。在3 000 mg·L-1濃度下，成蟹的中毒反應(yīng)明顯，12 h 內(nèi)即出現(xiàn)煩躁不安、軀體抬升、四處逃竄等現(xiàn)象，隨后逐漸趨于安靜、部分附肢脫落，軀體僵直。用玻璃棒輕觸，無明顯反應(yīng)，10 min 后再次觸碰，仍無反應(yīng)，即判定死亡。72 h 后90%以上的個體死亡。

成蟹的死亡數(shù)與氯蟲苯甲酰胺濃度具明顯的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著氯蟲苯甲酰胺濃度的升高和暴露時間的延長，成蟹的存活率明顯下降。24 h 時3 000 mg·L-1濃度組成蟹死亡率達(dá)25%，其他濃度組成蟹死亡率均低于15%。48 h 時，3 000 mg·L-1濃度組成蟹死亡率達(dá)62.5%，而其他濃度組成蟹死亡率為15%～30%，不同濃度組間存在極顯著差異（P=0.0027）。96 h 后，小于583 mg·L-1濃度組中成蟹死亡率均≤50%，1 323 mg·L-1濃度下死亡率達(dá)91.67%，不同組的死亡率存在顯著差異（P=0.0130）。而3 000 mg·L-1濃度下，成蟹全部死亡。氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹成蟹的24 h、48 h、72 h、96 h 的LC50分別為2 371 mg·L-1、1 222 mg·L-1、727.8 mg·L-1和286.4 mg·L-1；安全濃度為28.6 mg·L-1（表3）。

表3 氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹成蟹的急性毒性Tab.3 Acute toxicity of chlorantraniliprole to adult Chinese mitten handed crab

2.2 氯蟲苯甲酰胺對幼蟹的急性毒性

幼蟹對氯蟲苯甲酰胺的反應(yīng)與成蟹略有不同。藥物暴露初期，幼蟹中毒癥狀較成蟹輕。在75 mg·L-1濃度組中，整個暴露過程中絕大多數(shù)幼蟹無中毒癥狀，活力正常，僅有個別幼蟹出現(xiàn)了游動變緩的疑似中毒現(xiàn)象；349 mg·L-1和752 mg·L-1濃度組中的幼蟹暴露72 h 后逐漸出現(xiàn)游動活力下降、附肢部分脫落等中毒現(xiàn)象。在3 500 mg·L-1濃度下，氯蟲苯甲酰胺對幼蟹具有明顯的毒性作用，中毒癥狀與成蟹相似，24 h 內(nèi)即出現(xiàn)煩躁不安、軀體抬升、四處逃竄等現(xiàn)象。隨后，幼蟹趨于安靜，眼睛輕微晃動，輕觸碰后并無明顯反應(yīng)，直至死亡。死亡的幼蟹眼睛呈灰白色，體色變淺。72 h 后80%以上的個體死亡，較同階段成蟹的死亡率低約10%。

幼蟹的死亡率與氯蟲苯甲酰胺濃度呈正相關(guān)。隨著氯蟲苯甲酰胺濃度的升高和暴露時間的延長，幼蟹的存活率逐漸下降。24 h 時，低于1 623 mg·L-1的濃度組，幼蟹死亡率均低于15%，而3 500 mg·L-1濃度組中，死亡率達(dá)25%。48 h 時，低于1 623 mg·L-1濃度組的幼蟹死亡率約30%，而3 500 mg·L-1濃度組幼蟹死亡率達(dá)62.5%；96 h 后，≤752 mg·L-1濃度組幼蟹死亡率≤40%，1 623 mg·L-1濃度組死亡率達(dá)87.5%，不同組的死亡率差異極顯著（P=0.0011）。3 500 mg·L-1濃度組中，幼蟹全部死亡。通過分析得到：氯蟲苯甲酰胺對幼蟹24 h、48 h、72 h 和96 h 的LC50分別為2 526 mg·L-1、1 900 mg·L-1、834.2 mg·L-1和552.7 mg·L-1；安全濃度（SC）為55.3 mg·L-1（表4）。

表4 氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹幼蟹的急性毒性Tab.4 Acute toxicity of chlorantraniliprole to the juvenile Chinese mitten crab

2.3 氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹幼蟹和成蟹的毒性比較和安全性評價

氯蟲苯甲酰胺的田間常用施藥量為0.02 mg·L-1（按照藥物說明書折算），利用田間施藥量與實驗測得96 h-LC50的比值[27]可評價氯蟲苯甲酰胺的毒性安全性。幼蟹的田間施藥量/96 h-LC50的結(jié)果為4×10-5；成蟹的田間施藥量/96 h-LC50的結(jié)果為8×10-5（表5），表明幼蟹比成蟹對氯蟲苯甲酰胺的耐受性更強。

表5 氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹幼蟹和成蟹的安全性評價Tab.5 The safety evaluation of chlorantraniliprole to the juvenile and adult Chinese mitten handed crab

大部分研究采用96 h-LC50來評價藥物對水生動物的急性毒性大小。依照大型甲殼類生物96 h-LC50值，可將農(nóng)藥對大型甲殼類生物急性毒性劃分為四個等級[28]：96 h-LC50≤0.1 mg·L-1為劇毒；0.1 mg·L-1<96 h-LC50≤1.0 mg·L-1為 高 毒；1.0 mg·L-1<96 h-LC50≤10 mg·L-1為中毒；96 h-LC50>10 mg·L-1為低毒。依據(jù)田間施藥量與實驗獲得的96h-LC50比值來評價氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹的毒性。田間施藥量/96 h-LC50<0.1 為低風(fēng)險；0.1<田間施藥量/96 h-LC50≤1.0 為中等風(fēng)險；1.0<田間施藥量/96 h-LC50≤10 為高風(fēng)險；田間施藥量/96 h-LC50>10 為極高風(fēng)險[27]。結(jié)合《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[28]和本實驗結(jié)果可以得知，氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹幼蟹和成蟹均屬于低毒、低風(fēng)險等級。

與吡蟲啉、辛硫磷[10]、毒死蜱[12]等相比，在常用的稻田殺蟲劑中，氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹的毒性最小。陳尚朝等[29]研究發(fā)現(xiàn)，兩種有機磷類殺蟲劑（毒死蜱、硫丹）抑制了處于生長期的中華絨螯蟹耗氧量、排氨量及代謝水平，影響其生長發(fā)育。洪宇航[30]研究了除草劑草甘膦對中華絨螯蟹成蟹主要免疫指標(biāo)影響。結(jié)果表明，草甘膦顯著影響中華絨螯蟹總血細(xì)胞密度、血清中血藍(lán)蛋白含量和酚氧化酶、酸性磷酸酶以及堿性磷酸酶活性。隨著草甘膦濃度升高，影響越為明顯，可造成部分免疫功能下降?？梢?，不同農(nóng)藥對不同養(yǎng)殖動物和不同發(fā)育時期的動物毒副作用也不同[27]。本實驗結(jié)果表明，中華絨螯蟹幼蟹對氯蟲苯甲酰胺的耐受能力強于成蟹。

氯蟲苯甲酰胺與昆蟲魚尼丁受體亞型選擇性結(jié)合，導(dǎo)致受體通道長期開放，使昆蟲細(xì)胞內(nèi)源Ca2+大量釋放，從而引起昆蟲肌肉收縮，停止進(jìn)食，最終死亡[31,32]。總體而言，氯蟲苯甲酰胺對養(yǎng)殖水產(chǎn)品的毒性較低，藥物安全性較高，在合理的劑量下不會對常見養(yǎng)殖水產(chǎn)動物產(chǎn)生毒害作用。于振海等[33]測得，氯蟲苯甲酰胺對克氏原螯蝦的96 h-LC50為335.64 mg·L-1，介于本研究中中華絨螯成蟹和幼蟹的96 h-LC50之間。盛銀平等[34]研究了氯蟲苯甲酰胺對8 種常見淡水養(yǎng)殖魚蝦的急性毒性，結(jié)果表明該農(nóng)藥對鯉、鯽（拉丁名）等大多數(shù)魚類為低毒。孟華清等[35]研究了氯蟲苯甲酰胺對鯉魚幼苗的急性毒性效應(yīng)，結(jié)果顯示氯蟲苯甲酰胺對鯉魚幼苗的96 h-LC50為130.4 mg·L-1。該研究結(jié)果表明氯蟲苯甲酰胺對鯉魚幼苗低毒。因此，結(jié)合本實驗結(jié)果和上述學(xué)者的研究綜合分析，氯蟲苯甲酰胺在合理劑量下施用對稻田養(yǎng)殖中華絨螯蟹存活無明顯影響。

氯蟲苯甲酰胺對中華絨螯蟹低毒，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中正常使用對稻田養(yǎng)殖中華絨螯蟹無明顯影響。但氯蟲苯甲酰胺對其他對外界環(huán)境脅迫反應(yīng)更為敏感的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的毒性，還有待進(jìn)一步研究。