苦瓜皂苷對飼喂高糖飼料松浦鏡鯉幼魚生長、消化及肝臟健康的影響

范澤，吳迪，李晨輝，2，李晉南，劉慶武，王連生

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點試驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141；3.黑龍江省雙鴨山市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，黑龍江 雙鴨山 155100）

淀粉是養(yǎng)殖魚類飼料中最重要的糖類來源,具有節(jié)約飼料蛋白質(zhì)的作用。魚類自身“先天性糖尿病體質(zhì)”使得糖類節(jié)約飼料蛋白效應(yīng)未能有效發(fā)揮[1]。魚類攝食高糖飼料后消化能力下降[2]、肝臟損傷[3,4]，免疫力減弱[5,6]。而一些植物提取物如皂苷類、類黃酮類、黃酮類等有潛在的防治這類代謝疾病的作用[7,8]。近年來，天然植物中皂苷類化合物的作用越來越受到重視。皂苷綠色、無毒害，且具有降血脂、抗氧化、抗菌抗炎癥等功能，成為值得深入開發(fā)與利用的生物活性物質(zhì)。

苦瓜皂苷是苦瓜中的有效成分之一，在抗氧化、提升免疫力、降低膽固醇、抑菌等方面效果顯著[9]。王先遠等[10]發(fā)現(xiàn)，苦瓜皂苷可顯著增強人體超氧化物歧化酶，谷胱甘肽活力，其機理可能與腫瘤壞死因子（TNF）的作用有關(guān)?？喙显碥諏Ω哐悄Ｐ托∈缶哂忻黠@降低血糖作用和抗氧化能力的恢復(fù)作用；灌胃120 mg/kg 苦瓜皂苷30 d 降血糖作用和恢復(fù)抗氧化能力的效果較好。目前苦瓜皂苷在水產(chǎn)動物營養(yǎng)免疫方面的研究還未見相關(guān)報道。

Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）-核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號通路是水產(chǎn)動物抵抗內(nèi)、外源氧化損傷的關(guān)鍵信號通路。在信號通路中，Nrf2 是促進下游抗氧化基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵信號蛋白，而Keap1 是Nrf2 的負調(diào)節(jié)蛋白[11]。研究證實：功能性營養(yǎng)物質(zhì)可對水產(chǎn)動物Keap1-Nrf2/ARE 信號通路進行調(diào)節(jié)[12]。但苦瓜皂苷對Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的調(diào)控機制尚未研究。

作為典型的雜食性魚類，盡管與肉食性魚類相比，鯉對于糖類的利用能力更勝一籌[1]。松浦鏡鯉是我國主要的鯉養(yǎng)殖品種，具有良好的抗病和抗逆能力[13]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，攝食高糖飼料后松浦鏡鯉腸道皺襞高度降低，腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收減弱，并伴有肝臟病理損傷[14]?；诖?，本實驗通過研究不同水平苦瓜皂苷對松浦鏡鯉腸道消化酶、肝臟抗氧化相關(guān)酶活性、基因表達及肝臟組織形態(tài)的影響，以期為初步揭示苦瓜皂苷在高糖飼料條件下改善魚體健康的潛在機制，及苦瓜皂苷作為功能性營養(yǎng)物質(zhì)在提高魚類對淀粉高效利用上提供科學(xué)依據(jù)，并為緩解高糖飼料引發(fā)的魚類健康問題提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗飼料以魚粉、雞肉粉、豆粕、大豆?jié)饪s蛋白為蛋白質(zhì)源，魚油和豆油為脂肪源，以木薯淀粉為糖源，根據(jù)先前的研究結(jié)果[15]，分別設(shè)置低糖（10%，LC）和高糖（30%，HC）兩個對照組；高糖+4 個不同梯度的苦瓜皂苷水平：30%糖水平+100 mg/kg（MCS1）、400 mg/kg（MCS2）、1 600 mg/kg（MCS3）及6 400 mg/kg（MCS4）。所用飼料成分組成及營養(yǎng)水平見表1?？喙显碥召徸晕靼藏惣Z生物科技有限公司，純度≥98.5%，其添加濃度依馬春宇等[16]對苦瓜皂苷降血糖及抗氧化作用機制的研究結(jié)果設(shè)置。飼料制作：將所有干性原料經(jīng)粉碎后，過80 目篩，按逐級放大原則使用混勻機攪拌混勻，然后依據(jù)飼料配方比例加入魚油及豆油，在混勻機中充分混合后用飼料制粒機制成直徑為1.50 mm 的沉性顆粒飼料。

表1 飼料組成和營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Tab.1 Ingredient and nutrient levels of the diets used in the experiment（dry matter basis）

試驗用松浦鏡鯉幼魚由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗站提供，待用基礎(chǔ)飼料（購自哈爾濱通威飼料有限公司，含30%蛋白和6%脂肪）暫養(yǎng)14 d 后挑取規(guī)格一致、體質(zhì)健康、初始體質(zhì)量為（6.43±0.02）g 的松浦鏡鯉幼魚在室內(nèi)控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展飼養(yǎng)試驗。

1.2 方法

根據(jù)試驗飼料設(shè)置6 個處理組，每個處理組3個重復(fù)，每個重復(fù)25 尾魚。試驗魚飼養(yǎng)于室內(nèi)500 L 控溫循環(huán)水族箱中，分別投喂6 組飼料，養(yǎng)殖56 d。整個試驗期間，每天8:00 am、13:00 pm 和17:30 pm 投喂三次，日投喂率為7%～8%/（體質(zhì)量·d）。每14 d 測定1 次各網(wǎng)箱魚的質(zhì)量，調(diào)整投喂量。采用多參數(shù)水質(zhì)分析儀（HQ40D）（美國HACH 公司）監(jiān)測養(yǎng)殖試驗過程中主要水質(zhì)參數(shù)。試驗期間，水溫變化在28℃～32℃之間，溶解氧量為6.0 mg/L 左右，pH7.6～8.0。

養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，停食24 h。每個重復(fù)隨機取魚3 尾，經(jīng)100 mg/L 的MS-222 麻醉后，解剖取整條腸道，并將腸道內(nèi)容排空，用0.9%生理鹽水清洗干凈后，保存于-20℃冰箱，用于測定消化酶；解剖取肝臟用于測定抗氧化相關(guān)指標；每個重復(fù)再隨機取魚4 尾，經(jīng)同樣麻醉后，剖取肝臟，2 尾魚得肝臟用于抗氧化相關(guān)基因的檢測，另2 尾魚的肝臟（約0.5 cm3）用于測定與觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。

腸道及肝臟粗酶液的制備：將組織按照組織的0.9%生理鹽水為1∶9 的比例配制成10%的組織勻漿液，4℃離心20 min 后吸取上清液，存于-20℃冰箱中備用。

腸道脂肪酶和淀粉酶活性用南京建成生物工程研究所測定試劑盒。其中檢測淀粉酶活性的方法為碘-淀粉比色法，檢測脂肪酶活性的方法為比濁法。利用酶聯(lián)免疫試劑盒測定腸道蛋白酶活力。

肝臟抗氧化相關(guān)指標（過氧化氫酶CAT、過氧化物酶POD、谷胱甘肽GSH 活性及丙二醛MDA 含量）用南京建成生物工程研究所測定試劑盒。利用酶聯(lián)免疫試劑盒測定腸道肝臟超氧化物歧化酶SOD 活力。

用于基因表達測定的肝臟經(jīng)液氮迅速冷凍后，于-80℃冰箱中保存。利用Trizol 法提取各組織總RNA，參照TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Code No:RR047A）說明書，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Genbank 中及相關(guān)文獻中現(xiàn)有的鯉相關(guān)基因的保守序列設(shè)計引物。所有引物均由生工生物工程（上海）有限股份公司合成（表2）。實時熒光定量PCR 反應(yīng)根據(jù)SYBRPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（Code: RR420A）試劑盒說明書進行，采用SYBRGreen 染色法，在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System 實時PCR 檢測系統(tǒng)下進行。為了避免擴增批次間的差異，目的基因與其對應(yīng)的內(nèi)參基因同時擴增，每個模板均做三個重復(fù)，得到三個Ct 值，取其平均值作為最終Ct 值，后運用比較Ct 法（△△Ct）分析比較所得數(shù)據(jù)，得到各模板中各基因的相對表達量，計算公式為：

表2 試驗所用引物Tab.2 Primers in present study

肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察：固定于4%多聚甲醛的肝臟組織通過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、制成5 μm 切片、蘇木精伊紅染液（H&E）染色等步驟，制作成肝臟組織切片。切片在光學(xué)顯微鏡（Leica MD 2000B）下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

生長指標的計算：

式中：t 代表試驗天數(shù)（d）；Nt代表實驗結(jié)束時魚存活尾數(shù)；W0為魚初始體質(zhì)量（g）；Wt為魚終末體質(zhì)量（g）；F 代表飼料攝取量干重（g）。

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，并利用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），若差異達到顯著水平（P<0.05），則進行Duncan's 法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚生長指標的影響

由表3 可知，盡管HC 組與LC 組的終末均體質(zhì)量及特定生長率無顯著差異（P>0.05），但二者均低于LC 組。而HC 的飼料效率顯著低于LC 組（P<0.05）。在高糖飼料添加苦瓜皂苷組中，MCS3 組魚的終末均體質(zhì)量、特定生長率、飼料效率及攝食率最高，顯著高于HC 組（P<0.05），且MCS3 組的終末均體質(zhì)量、攝食率顯著高于LC 組（P<0.05）。

表3 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚生長指標的影響Tab.3 Effect of bitter melon Momordica charantia saponins on growth of juvenile Songpu mirror carp in various treatments throughout the experiment

2.2 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚腸道消化酶的影響

由表4 可知，8 周養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，HC 組鯉的蛋白酶及淀粉酶活性均低于LC 組，但并無顯著差異（P>0.05），而脂肪酶活性顯著高于LC 組。高糖飼料中添加苦瓜皂苷后，蛋白酶及淀粉酶活性先升高后降低，脂肪酶活性先降低后升高。MCS3 組鯉的蛋白酶及淀粉酶活性最高，顯著高于HC 組和MCS4組（6 400 mg/kg）（P<0.05），而其脂肪酶活性最低，顯著低于HC 組（P<0.05），且三種的活性均與LC 組無顯著差異（P>0.05）。

表4 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚腸道消化酶的影響Tab.4 Effect of bitter melon M.charantia saponins on the intestinal digestive enzyme activities of juvenile Songpu mirror carp in various treatments throughout the experiment

2.3 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚肝臟抗氧化指標的影響

由表5 可知，HC 組鯉的的SOD、CAT、POD、GSH 及T-AOC 活性均低于LC 組，其中POD 及T-AOC 活性顯著低于LC 組（P<0.05），而MDA 含量卻顯著高于LC 組（P<0.05）。高糖飼料中添加苦瓜皂苷后，抗氧化酶活性先升高后降低，MDA 含量先降低后升高。MCS3 組的SOD、CAT、POD、GSH 及T-AOC 活性最高，顯著高于HC 組（P<0.05），而其MDA 含量卻最低，顯著低于HC 組（P<0.05）。

表5 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚肝臟抗氧化指標的影響Tab.5 Effect of saponins of bitter melon M.charantia on the hepatopancreas antioxidant indices of juvenile Songpu mirror carp in various treatments throughout the experiment

2.4 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚肝臟抗氧化相關(guān)基因表達的影響

由圖1 可知，8 周養(yǎng)殖后，HC 組松浦鏡鯉幼魚中，除Keap1 外其余抗氧化相關(guān)基因的表達均顯著低于LC 組（P<0.05）。隨著高糖飼料中苦瓜皂苷含量的增加，松浦鏡鯉幼魚肝臟抗氧化相關(guān)基因的表達均先升高后降低。MCS3 組Nrf2、CuZnSOD、Mn-SOD 和CAT 的表達量最高，顯著高于HC 組（P<0.05），MCS3 組（1 600 mg/kg）Keap1 表達量最低，顯著低于HC 組，CAT 表達量顯著高于LC 組（P<0.05）。

圖1 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚肝臟抗氧化相關(guān)基因表達的影響Fig.1 Effect of saponins of bitter melon M.charantia on the hepatopancreas antioxidant gene expression levels of juvenile Songpu mirror carp in various treatments throughout the experiment

2.5 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚肝臟組織形態(tài)的影響

根據(jù)肝臟抗氧化酶活性及相關(guān)基因及其表達結(jié)果，對比了LC、HC、MCS3 及MCS4 組松浦鏡鯉幼魚肝臟組織形態(tài)學(xué)。與LC 組相比，HC 組會導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)模糊，肝細胞嚴重損傷，出現(xiàn)細胞核缺失及嚴重脂肪樣變；MCS3 組改變了HC 組的病理表現(xiàn)，肝細胞核更清晰，細胞界限明顯且排列整齊，與LC 組肝臟組織結(jié)構(gòu)完整度相似，結(jié)構(gòu)較清晰。而在MCS4組則又出現(xiàn)了細胞核缺失，空泡化現(xiàn)象（圖2）。

圖2 苦瓜皂苷對松浦鏡鯉幼魚肝臟組織形態(tài)的影響（H.E 400×）Fig.2 Effect of saponins of bitter melon M.charantia on the hepatopancreas histology of juvenile Songpu mirror carp in various treatments throughout the experiment

3 討論

飼料中添加適宜水平的糖類可促進魚類生長，促進對高糖飼料的利用效率[17]。盡管雜食性魚類對高糖飼料有較好的耐受能力[17]，但過量添加依然會抑制魚體生長[18]。本試驗結(jié)果表明，高糖飼料組魚的終末體質(zhì)量與特定生長率低于低糖組，且高糖組魚的飼料效率顯著低于低糖組，表明高糖是限制魚體生長的關(guān)鍵因素，這與許霄霄等[19]研究結(jié)果基本一致。本試驗結(jié)果顯示，在高糖飼料中添加1 600 mg/kg 苦瓜皂苷與高糖組相比，終末體質(zhì)量、特定生長率及飼料效率均顯著提高，上述指標也高于低糖組。目前對苦瓜皂苷的研究主要集中在人和小鼠上。陳松瑞[20]研究發(fā)現(xiàn)，灌胃350 mg/kg 苦瓜皂苷12周后，2 型糖尿病小鼠體質(zhì)量顯著回升，這在一定程度上佐證了苦瓜皂苷的促生長效應(yīng)，但苦瓜皂苷在魚類營養(yǎng)中的應(yīng)用研究仍處于初期，需深入研究其促生長機制。

糖類應(yīng)用于魚體生長的首要限制因素即為消化。消化酶活性首先決定了魚類對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力。鯉作為典型的無胃魚類，對飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收主要在腸道中[21]。有研究表明，在飼料的適宜范圍內(nèi)提高糖水平可增強淀粉酶、蛋白酶活性[22,23]，而在本試驗中高糖組（30%）腸道淀粉酶、蛋白酶活性顯著低于低糖組，表明飼料糖水平可能超出了適宜范圍，這與李晉南等利用50%高淀粉飼料飼喂松浦鏡鯉的研究結(jié)果并不一致，可能是由于飼料糖源不同所致。本研究發(fā)現(xiàn)，當高糖飼料中補充1 600 mg/kg 苦瓜皂苷后，松浦鏡鯉幼魚腸道淀粉酶、蛋白酶活性較高糖組顯著提高。Jr Serrano[24]研究發(fā)現(xiàn)，鯉攝食含皂樹皂苷的飼料后腸道胰蛋白酶、淀粉酶活性明顯提升。這揭示皂苷類物質(zhì)在促進糖類、蛋白質(zhì)等在魚類腸道中的消化發(fā)揮重要作用，但具體調(diào)控機制有待于深入研究。

高血脂、高血糖是魚類攝食高糖飼料后典型的應(yīng)激癥狀，會導(dǎo)致進一步的組織氧化應(yīng)激[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖飼料誘導(dǎo)了松浦鏡鯉幼魚肝臟抗氧化酶SOD、CAT、POD、GSH、T-AOC 活性的降低和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量的升高，這在對異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[4]、大口黑鱸（Micropterus salmoides）[26]，白鯽（Carassius auratus cuvieri）[27]和彭澤鯽（Carussius auratus pengsenensis）[28]等研究中均有發(fā)現(xiàn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，飼料中補充功能性添加劑能夠緩解高糖飼料誘導(dǎo)的魚類肝臟氧化應(yīng)激[29]。已證實，苦瓜皂苷具有良好的抗氧化功效[12,30]。Jiang等[31]發(fā)現(xiàn)，苦瓜皂苷對高脂聯(lián)合鏈脲菌素模型大鼠具有顯著的抗氧化能力的恢復(fù)效應(yīng)。在本研究中，高糖飼料中添加400～1 600 mg/kg 苦瓜皂苷增加了肝臟SOD、CAT、POD、GSH 和T-AOC 活性，減少了肝臟MDA 含量。劉波等[32]研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜皂苷有良好的抗氧化活性，能夠提高小鼠體內(nèi)SOD 活性，降低非酒精性脂肪肝的發(fā)病風(fēng)險。上述結(jié)果揭示苦瓜皂苷可有效緩解了高糖飼料引發(fā)的松浦鏡鯉幼魚肝臟抗氧化能力減弱，保護肝臟健康。在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的日常飼料基礎(chǔ)中添加300 mg/kg 或450 mg/kg 皂樹皂苷能增強其SOD、CAT 和谷胱甘肽過氧化物酶的活性[33]。結(jié)合本試驗結(jié)果表明，皂苷類物質(zhì)可作為改善水產(chǎn)動物抗氧化能力的功能性飼料添加劑。Keap1/Nrf2 信號通路是水產(chǎn)動物抵抗內(nèi)、外源性氧化損傷關(guān)鍵信號通路[11,34]。本試驗發(fā)現(xiàn)，高糖飼料中添加1 600 mg/kg 苦瓜皂苷顯著增強了松浦鏡鯉幼魚肝臟Nrf2 及下游抗氧化酶（MnSOD、CuZnSOD 及CAT）的基因表達，而Keap1 基因表達被抑制，進一步揭示適宜水平苦瓜皂苷的添加能夠減輕高糖飼料對魚類肝臟的氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮抗氧化劑的作用，且這種作用與Keap1-Nrf 2 信號通路密切相關(guān)。

高糖飼料會引起魚體肝臟腫大，空泡化以及脂肪樣病變[29,35]，影響肝臟健康。李靜輝[36]指出，鯉攝食含15%玉米淀粉的飼料時肝細胞出現(xiàn)水樣變和輕微的脂肪樣變；攝食含30%玉米淀粉飼料時肝細胞嚴重脂肪樣變。本研究得出與之一致的結(jié)論。劉波等[32]發(fā)現(xiàn)，當苦瓜皂苷劑量為100 mg/kg 時，非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，炎性細胞浸潤與脂肪顆粒堆積基本消失。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，添加1 600 mg/kg 苦瓜皂苷后，松浦鏡鯉幼魚肝臟組織形態(tài)基本恢復(fù)正常，但添加量達到6 400 mg/kg 時，肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷加劇。這表明，苦瓜皂苷的添加劑量增加到1 600 mg/kg 能成為緩解高糖攝入誘導(dǎo)的代謝性肝病的有效手段，但組織修復(fù)機制需進一步深入研究。

綜上，高糖飼料中補充適宜水平苦瓜皂苷可以增強松浦鏡鯉幼魚腸道對糖、蛋白質(zhì)的消化吸收能力；減少對高糖的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這一過程與Keap1-Nrf2 信號通路關(guān)系密切；同時也可修復(fù)高糖誘導(dǎo)的肝細胞受損。本研究發(fā)現(xiàn)松浦鏡鯉高糖飼料中添加苦瓜皂苷添加水平應(yīng)在1 600 mg/kg 左右，下一步將在此濃度上下游設(shè)計濃度點，以確定其最佳添加水平。當苦瓜皂苷添加水平達到6 400 mg/kg時，會對松浦鏡鯉腸道消化及肝臟健康產(chǎn)生不利影響。