基于PCR-DGGE分析宣威火腿的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

鄒穎玲，劉姝韻，王桂瑛，*，普岳紅，葛長榮，廖國周，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南昆明650201）

宣威火腿是云南省傳統(tǒng)名特優(yōu)產(chǎn)品，其以“身穿綠袍，色香味美，咸淡相宜，風(fēng)味獨特，食而不膩”等特點名揚海內(nèi)外，距今已有兩百七十多年的歷史[1]，它是由原產(chǎn)地域內(nèi)飼養(yǎng)的含有烏金豬血統(tǒng)的鮮豬后腿在原產(chǎn)地經(jīng)過腌制、發(fā)酵、成熟制作而成[2]。宣威火腿名氣取決于其特定的品質(zhì)，而火腿特定品質(zhì)的形成又取決于宣威獨特的地理氣候環(huán)境[3]。境內(nèi)獨特的天然環(huán)境，促進(jìn)火腿微生物的大量繁殖，從而保證火腿的持續(xù)發(fā)酵[4]。微生物在肉制品的風(fēng)味形成和安全性方面發(fā)揮著各自獨特的作用，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵微生物會引起原料中的蛋白質(zhì)、脂肪等主要組分發(fā)生微生物及生物化學(xué)變化，進(jìn)而影響發(fā)酵肉制品的品質(zhì)，促進(jìn)其產(chǎn)生芳香化合物，提升肉制品的風(fēng)味。并且能通過抑制有害微生物的生長繁殖減少鹽用量、降低亞硝酸鹽殘留和生物胺含量[5]。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）是一種分析微生物區(qū)系的分子指紋技術(shù)，能夠快速、高效、全面地分析微生物的組成及群落結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌分類和鑒定的有效工具[6-9]。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，PCR-DGGE技術(shù)不需培養(yǎng)，而是直接從樣品中提取總DNA，不僅能檢測到難培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，而且能同時檢測多種微生物，耗時短。該技術(shù)雖然在肉制品微生物方面起步較晚，但近年來廣泛應(yīng)用于原料肉及各種肉制品微生物群落結(jié)構(gòu)的分析[10-11]。目前，運用免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)研究宣威火腿微生物區(qū)系鮮有報道，基于此，本研究旨在通過PCRDGGE技術(shù)分析不同加工年份（1年、2年和3年）的宣威火腿細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，為進(jìn)一步探討宣威火腿品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

宣威火腿樣品：云南省宣威市某公司提供，并分別在加工1年、2年和3年火腿的表面和內(nèi)部（距肉表面 5 cm）取約 10 g肉樣品，標(biāo)記為：A1、A2（1 年腿的表面和內(nèi)部），B1、B2（2年腿的表面和內(nèi)部），C1、C2（3年腿的表面和內(nèi)部），將6個樣品真空包裝，置于-20℃保存以待分析。

1.1.2 試劑及儀器

乙醇、冰醋酸、硝酸銀、37%甲醛、氫氧化鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨環(huán)境微生物DNA提取試劑盒、1×TAE緩沖液、ddH2O：北京博友順有限公司；DNA純化試劑盒、DH 5α感受態(tài)細(xì)胞：北京天根生化科技公司；dNTP、rTaq、pMD18-T Cloning Kit：日本Takara公司；40%甲叉雙丙烯酰胺：美國 Bio-Rad公司；甲酰胺（去離子）、Urea、APS：美國Amresco公司；四甲基乙二胺：美國Sigma公司；DNA純化試劑盒：美國OMEGA公司。

Centrifuge 5415D離心機：德國Eppendorf公司；T-gradient PCR儀：德國Biometra公司；SDC-6恒溫槽：寧波新芝有限公司；Gel-Doc2000凝膠成像儀、Dcode變形梯度凝膠電泳儀：美國伯樂Bio-Rad公司；JYSPFT十六烷基三甲基溴化銨：北京軍意東方儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品中總DNA的提取

具體操作步驟按照十六烷基三甲基溴化銨環(huán)境微生物DNA提取試劑盒進(jìn)行，所得DNA保存于-20℃待分析。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴增

參考趙乾宇[12]的方法，以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物GC-338F和518R擴增樣品16S rDNA高變區(qū)序列。所用引物序列如表1所示。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR擴增體系（50μL）為：10×PCR緩沖液5μL；dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL；rTaq（5 U/μL）0.4 μL；GC-338F（20 mmol/L）1 μL；518R（20 mmol/L）1 μL；模板 DNA 50 ng；用 ddH2O 補至 50 μL。

PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃復(fù)性 45 s，72℃延伸 1 min，30個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物采用DNA純化試劑盒純化回收。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的DGGE分析

參考湯玲娟等[13]的方法，并適當(dāng)調(diào)整。取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行變形梯度凝膠電泳（DGGE）分析。采用變形梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠（化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol/L和40%的丙烯酰胺）在1×TAE緩沖液中150 V 60℃下電泳5 h。

1.2.4 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

參考鄭艷等[14]的方法，用滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶，采用DNA純化試劑盒回收目的條帶。以2 μL回收產(chǎn)物為模板，338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系（50 μL）為：10×PCR緩沖液 5 μL；dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL；rTaq （5 U/μL）0.4 μL；338F（20 mmol/L）1 μL；518R（20 mmol/L）1 μL；模板 DNA 2 μL；補ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 30 s，55℃復(fù)性 30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后，72℃延伸10 min。將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到Pmd18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，菌液由華大基因?qū)Σ迦氲募?xì)菌16S rDNA片段進(jìn)行序列測定。

1.2.5 細(xì)菌多樣性指數(shù)計算

細(xì)菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個體數(shù)以及均勻度的綜合指標(biāo)。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個條帶的強度（灰度），對各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度等指標(biāo)進(jìn)行分析。DGGE圖譜采用Quantity one軟件對每個樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析，香農(nóng)指數(shù)（H）、豐度（S）和均衡指數(shù)（E）等指標(biāo)被用來比較不同樣品的多樣性情況[15]。參考鄭艷等[14]的方法進(jìn)行計算，計算公式如下所示。

式中：pi為樣品中單一條帶的強度在該樣品所有條帶總強度中所占的比率；N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度；Ni為第i條帶的豐度；S是某樣品中所有條帶數(shù)目總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣威火腿細(xì)菌DNA提取結(jié)果

宣威火腿樣品細(xì)菌DNA電泳圖見圖1。

圖1 宣威火腿樣品細(xì)菌DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of bacterial DNA from Xuanwei ham samples

由圖1可以看出，從不同加工年份宣威火腿表面和內(nèi)部提取出的細(xì)菌DNA片段完整性較好，有利于后續(xù)的PCR擴增。

2.2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴增

宣威火腿樣品細(xì)菌組16S rDNA的PCR擴增結(jié)果見圖2。

圖2 宣威火腿樣品細(xì)菌組16S rDNA的PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rDNA of bacterial group of Xuanwei ham sample

以GC-338F和518R為引物，從不同加工年份宣威火腿的表面和內(nèi)部6個樣品中提取的總DNA為模板進(jìn)行16S rDNA片段擴增，得到200 bp的DNA片段（圖2），所有樣品條帶清晰，符合DGGE分析。

2.3 DGGE指紋圖譜及分析結(jié)果

宣威火腿樣品的DGGE圖譜見圖3，宣威火腿樣品的DGGE條帶強度示意圖見圖4。

用DGGE圖譜中條帶數(shù)來反映細(xì)菌多樣性，泳道中各條帶均代表一種不同的細(xì)菌，條帶亮度用來反映細(xì)菌的豐富度[16]。由圖3和圖4可以看出，明顯分離的條帶有40條，顯示出宣威火腿中豐富的細(xì)菌種類，其中1年腿表面有16個主要條帶，內(nèi)部有16個；2年腿表面有23個，內(nèi)部有15個；3年腿表面有29個，內(nèi)部有22個，多數(shù)條帶為每個泳道共有，說明有共有的細(xì)菌類型存在于不同加工年份宣威火腿表面和內(nèi)部。另外共有條帶的亮度也存在一定的差異，說明其中細(xì)菌群落數(shù)量存在差異。

圖3 宣威火腿樣品的DGGE圖譜Fig.3 DGGE map of Xuanwei ham samples

圖4 宣威火腿樣品的DGGE條帶強度示意圖Fig.4 Schematic diagram of DGGE band intensity of Xuanwei ham samples

2.4 主要電泳條帶的測序比對結(jié)果分析

主要條帶的序列測定結(jié)果見表2。

表2 主要條帶的序列測定結(jié)果Table 2 The sequencing results of the main bands

續(xù)表2 主要條帶的序列測定結(jié)果Continue table 2 The sequencing results of the main bands

將宣威火腿樣品主要的40條電泳條帶進(jìn)行克隆與測序，測序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對，從中獲取各個同源性信息。由表2可知，有1條條帶未測出結(jié)果，測出的39條回收帶有37條的同源性較高，在95%以上。

由DGGE圖譜可知，宣威火腿中主要的細(xì)菌有39種，較為豐富。加工1年宣威火腿表面最亮的條帶為37和39，其中條帶37為Chromohalobacter，條帶39為Chromohalobacter marismortui。加工1年宣威火腿內(nèi)部最亮的條帶為 14、17、21、26、37 和 39，其中條帶 14 為Staphylococcus equorum（馬胃葡萄球菌）、條帶17為Staphylococcus xylosus（木糖葡萄球菌）、條帶21為Acinetobacter junii（瓊氏不動桿菌）、條帶 26為Tetragenococcus halophilus（嗜鹽四聯(lián)球菌）。加工2年宣威火腿表面最亮的條帶為14、16和26，其中條帶16為Staphylococcus warneri（沃氏葡萄球菌）。2年宣威火腿內(nèi)部最亮的條帶為14、17、19、26和39，其中條帶19為Staphylococcus epidermidis（表皮葡萄球菌）。加工3年宣威火腿表面最亮的條帶為 3、4、6、7、8、9、12、14、26和27，其中條帶3為未培養(yǎng)細(xì)菌、條帶4為Staphylococcus carnosus（肉葡萄球菌）、條帶 6為Staphylococcus saprophyticus（腐生葡萄球菌）、條帶7為Staphylococcus pentosaceus（戊糖葡萄球菌）、條帶8為Staphylococcus arlettae（阿爾萊特葡萄球菌）、條帶9為Staphylococcus simulans（模仿葡萄球菌）、條帶12為Chromohalobacter japonicus、條帶 27為 Lentibacillus salarius。加工3年宣威火腿內(nèi)部最亮的條帶為19、21、25和26，其中條帶25為未培養(yǎng)細(xì)菌。由DGGE圖譜可知，不同加工年份宣威火腿的表面及內(nèi)部均檢測出Tetragenococcus halophilus（嗜鹽四聯(lián)球菌），由此可推斷，Tetragenococcus halophilus（嗜鹽四聯(lián)球菌）是宣威火腿的優(yōu)勢菌種。不同加工年份宣威火腿的表面及內(nèi)部檢測出了大量的馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、戊糖葡萄球菌等葡萄球菌屬，由此可看出，葡萄球菌屬是宣威火腿的優(yōu)勢菌屬。另外，在宣威火腿中還檢測出了3種未培養(yǎng)細(xì)菌，其在宣威火腿中的作用有待進(jìn)一步研究。

2.5 樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)與聚類分析

戴斯系數(shù)比較PCR-DGGE圖譜的相似性結(jié)果見表3。

表3 戴斯系數(shù)比較PCR-DGGE圖譜的相似性Table 3 Comparison of the similarity of PCR-DGGE spectra by the Dyce coefficient %

DGGE圖譜的相似性是通過Quantity One軟件進(jìn)行分析的，通過分析得到不同加工年份宣威火腿細(xì)菌群落相似性指數(shù)。由表3可知，加工1年宣威火腿內(nèi)部與加工2年內(nèi)部的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性最高，為66.8%，加工1年表面與加工2年表面的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性最低，為17%。從宣威火腿表面看，加工2年的與加工3年表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性為52%，分別比加工1年與加工2年表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性和加工1年與加工3年表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性高35%、32%。從宣威火腿內(nèi)部看，加工1年與加工2年內(nèi)部細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分別比加工1年與加工3年內(nèi)部細(xì)菌結(jié)構(gòu)相似性和加工2年與加工3年內(nèi)部細(xì)菌結(jié)構(gòu)相似性高27.9%、10.6%。圖5為不同加工年份宣威火腿表面及內(nèi)部的條帶相似性聚類分析圖。

圖5 宣威火腿樣本間的聚類圖Fig.5 Cluster diagram between Xuanwei ham samples

由圖5可知，加工1年、2年和3年宣威火腿表面及內(nèi)部的細(xì)菌群落按相似程度分為3類，加工1年宣威火腿表面的細(xì)菌群落為一類，加工2年和加工3年表面的細(xì)菌群落聚成一類，3個不同加工年份宣威火腿內(nèi)部的細(xì)菌群落聚為一類，說明加工時間對宣威火腿表面及內(nèi)部的細(xì)菌群落有一定的影響。

2.6 宣威火腿樣品的細(xì)菌群落多樣性

宣威火腿各樣品間的細(xì)菌群落多樣性分析見表4。

表4 宣威火腿各樣品間的細(xì)菌群落多樣性分析Table 4 Analysis of bacterial community diversity among different samples of Xuanwei ham

微生物多樣性指數(shù)用于評估微生物群落的豐富度。香農(nóng)指數(shù)（H）用于評估微生物群落的多樣性，H越大，說明微生物群落多樣性越高；均勻度指數(shù)（E）用于評估微生物分布的均勻程度，E值越大，說明微生物群落分布越均勻；豐富度指數(shù)（S）是指一個群落或生境中物種數(shù)目的多寡[17]。由表4可看出，不同加工年份宣威火腿表面的香農(nóng)指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)均高于內(nèi)部的數(shù)值，說明不同加工年份宣威火腿表面及內(nèi)部細(xì)菌群落多樣性有差異。加工3年宣威火腿表面的香農(nóng)指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)最大，說明其樣品的細(xì)菌群落種類和數(shù)量最多，且較均勻。

3 討論

干腌火腿作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品，微生物是其品質(zhì)特征形成的一個重要影響因素。大量研究表明，微生物與火腿發(fā)酵有著密切的關(guān)系。參與火腿發(fā)酵的微生物群體主要包括細(xì)菌、霉菌、酵母，不同的菌群對火腿的發(fā)酵起著至關(guān)重要的作用，如細(xì)菌中葡萄球菌和微球菌等。細(xì)菌在發(fā)酵肉制品中起著重要的作用[18]，球菌在發(fā)酵肉制品中充當(dāng)還原亞硝酸鹽和形成過氧化氫酶的角色，利于發(fā)色及分解過氧化物，改善產(chǎn)品色澤及延緩酸敗，此外球菌可以分解蛋白質(zhì)和脂肪分泌脂肪酶和蛋白酶，改善產(chǎn)品風(fēng)味[19]。Essid等[20]研究發(fā)現(xiàn)，從Tunwasian傳統(tǒng)腌肉中分離出30株木糖葡萄球菌均具有過氧化氫酶活性，能使硝酸鹽、亞硝酸鹽含量減少。李平蘭等[21]研究發(fā)現(xiàn)宣威火腿中的優(yōu)勢菌群為葡萄球菌和微球菌、霉菌。耐鹽性的葡萄球菌和微球菌的代謝活動以及火腿表面大量霉菌的生長是宣威火腿獨特風(fēng)味形成的基礎(chǔ)。

本研究運用PCR-DGGE分析不同加工年份宣威火腿表面和內(nèi)部的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果表明，葡萄球菌屬和Tetragenococcus halophilus（嗜鹽四聯(lián)球菌）分別是宣威火腿的優(yōu)勢菌屬與優(yōu)勢菌種，這與黃艾祥等[22]的研究結(jié)果相似。Hinrichsen L等[23]研究意大利干腌火腿加工過程中微生物區(qū)系的變化發(fā)現(xiàn)，表皮和肌肉中不同的發(fā)酵階段會有不同的優(yōu)勢菌群，但最終成熟的火腿表面和內(nèi)部都是葡萄球菌為優(yōu)勢菌，這與試驗的結(jié)果相一致。葡萄球菌可將NO3-轉(zhuǎn)化為NO，進(jìn)一步與肌紅蛋白結(jié)合，形成亞硝基肌紅蛋白，使肉品呈現(xiàn)其特有的色澤[24]。葡萄球菌還能去除肉制品中乳酸代謝產(chǎn)生的H2O2，促進(jìn)芳香類風(fēng)味的形成[25]。另外，葡萄球菌具有耐鹽性，且有鹽的環(huán)境有利于其生長，這就造成了葡萄球菌在火腿表面是優(yōu)勢菌[26]。另外，本研究還檢測出了未培養(yǎng)細(xì)菌，表明PCR-DGGE技術(shù)相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)法更精確，同時該技術(shù)會受環(huán)境因素、PCR擴增引物的偏好性等因素的影響，從而影響該技術(shù)的準(zhǔn)確性。因此還需結(jié)合環(huán)境因素對宣威火腿細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究進(jìn)行深入、全面的分析。

4 結(jié)論

從不同加工年份宣威火腿中共檢測到了39種細(xì)菌，存在于宣威火腿中的細(xì)菌主要為馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、戊糖葡萄球菌等葡萄球菌屬以及Tetragenococcus halophilus（嗜鹽四聯(lián)球菌）、Microccccus varians（變異微球菌）等，其中葡萄球菌屬和Tetragenococcus halophilus（嗜鹽四聯(lián)球菌）分別為宣威火腿中的優(yōu)勢菌屬與優(yōu)勢菌種；此外，在宣威火腿中還檢測出了未培養(yǎng)細(xì)菌。多樣性分析表明，加工3年的宣威火腿表面細(xì)菌群落多樣性最高，加工1年火腿表面細(xì)菌群落多樣性最低。加工3年火腿內(nèi)部細(xì)菌群落多樣性最高，加工2年火腿內(nèi)部細(xì)菌群落多樣性最低。相較于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，采用PCRDGGE技術(shù)分析宣威火腿的細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)，結(jié)果更全面、更直觀，這也為進(jìn)一步研究宣威火腿獨特風(fēng)味的形成提供了技術(shù)支持。